一种现场快速检测水中汞离子的方法、试剂盒及其应用

1.本发明涉及重金属检测技术领域，特别是涉及一种现场快速检测水中汞离子的方法、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.随着经济的快速发展和城市化进程的加快，我国水体中重金属污染问题日益严重。重金属污染由于其不可降解、易于生物富集，在水体中达到一定浓度就会对生态环境、动植物系统产生危害，最终将通过食物链直接或间接地危害人类健康。在有毒金属元素中，汞的毒性排列首位，即便在其浓度很低的情况下也会对机体的神经内分泌等系统产生严重的影响。目前，汞的检测常用原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)、x射线荧光光谱法(r-fs)、冷蒸气原子荧光光谱法(cvaf)和高效液相色谱法(hplc)等，这些检测方法都需要昂贵的仪器和专业的操作人员，只能在实验室的条件下进行，不方便进行现场检测。变构转录因子(allosteric transcription factor，atf)是一类在细菌中广泛分布的调控蛋白，通常包含效应物感受结构域(ebd)和dna结合结构域(dbd)两个结构域。小分子效应物通过与ebd结合使atf的构象改变从而增强或减弱atf与dna的结合能力，进而调控基因的转录与表达。目前，还没有利用无细胞合成技术实现汞离子现场快速检测的相关记载。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种现场快速检测水中汞离子的方法，基于无细胞合成技术，具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，可显著提高水中汞离子检测的灵敏度和特异性。
4.为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
5.本发明提供了一种现场快速检测汞离子的方法，将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系以变构转录因子merr为控制元件，控制下游双链dna中荧光基因的表达。
6.优选的，所述变构转录因子merr的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，所述待测溶液与体外转录体系的体积比为1：10。
8.优选的，所述双链dna中含有变构转录因子merr特异性识别序列。
9.更优选的，所述双链dna的核苷酸序列如seq id no.2所示。
10.优选的，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、dntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。
11.本发明还提供了一种现场快速检测汞离子的试剂盒，所述试剂盒中包括变构转录因子merr以及含有变构转录因子merr特异性识别序列的双链dna，所述双链dna的merr特异性识别位点下游含有荧光基因。
12.优选的，所述试剂盒还包括：双蒸水、缓冲液、dntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。
13.更优选的，所述缓冲液包括：spermidine 20mm、tris-hcl 400mm、mgcl280mm、nacl 200mm和dtt 100mm。
14.本发明还提供了上述的方法或上述的试剂盒在汞污染物检测中的应用。
15.本发明提供了一种现场快速检测水中汞离子的方法，以无细胞合成技术为基础，制备简单、反应条件温和的体外转录体系，该体系以能够特异性识别和结合汞离子的变构转录因子merr为控制元件，控制下游荧光基因的表达，产生绿色荧光。经验证，本发明所述方法运用变构转录因子特异性识别汞离子的特性，具有灵敏度高和特异性强的特点。并且本发明体系简单，成分明确，在现场检测不会对环境造成二次污染，具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，能够实现免仪器现场即时检测。
附图说明
16.图1为模板质粒puc57图谱。
17.图2为pcr扩增产物纯化后测序结果图。
18.图3为不同汞离子浓度反应60min的荧光强度结果图。
19.图4为汞离子浓度与相应荧光强度的回归曲线。
20.图5为其他重金属检测结果图。
21.图6为其他重金属检测产生的荧光对比图；其中，pc为阳性对照，nc为阴性对照。
具体实施方式
22.本发明提供了一种现场快速检测汞离子的方法，将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系以变构转录因子merr为控制元件，控制下游双链dna中荧光基因的表达。
23.本发明中，所述变构转录因子merr是由144个氨基酸组成的蛋白质，所述merr的氨基酸序列为：mennlenltigvfakaagvnvetirfyqrkgllrepdkpygsirrygeadvvrvkfvksaqrlgfsldeiaellrlddgthceeasslaehklkdvrekmadlarmetvlselvcacharkgnvscpliaslqgeaglarsamp(seq id no.1)。本发明中，所述变构转录因子merr能够特异性识别和结合汞离子，通过控制体外录体系中双链dna下游的荧光基团的表达，实现汞离子的检测。本发明对所述变构转录因子merr的合成方法并没有特殊限定，本发明的具体实施例中，所述变构转录因子merr的合成工作由金斯瑞生物科技股份有限公司完成。
24.本发明中，所述双链dna的长度为343bp，其中含有变构转录因子merr特异性识别序列，所述双链dna的核苷酸序列为：gcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagataatacgactcactataggaggatatttaccctgtactaaggtacgtggtttatgctgtaagtgaggcccacatactctgatgatccgagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcggatcattcatggcaagagacggtcgggtccagatattcgtatctgtcgagtagagtgtgggctcttgccatgtgtatgtgggtagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg(seq id no.2)。本发明对所述双链dna的合成方法并没有特殊限定，本发明的具体实施例中，所述获得双链dna的载体的构建工作由金斯瑞生物科技股份有限公司完成。
25.本发明中，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、dntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。所述缓冲液包括终浓度为20mm的spermidine、终浓度为400mm的tris-hcl、
终浓度为80mm的mgcl2、终浓度为200mm的nacl和终浓度为100mm的dtt。
26.本发明将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测。本发明中，所述待测溶液与体外转录体系的体积比优选为1：10。本发明中，所述孵育的温度优选为35-40℃，更优选为37℃；所述孵育的时间优选为10-70min，更优选为60min。本发明中，所述荧光检测优选为紫外检测，在紫外条件下，如有肉眼可见的绿色荧光产生说明待检溶液中含有汞离子。
27.本发明还提供了一种现场快速检测汞离子的试剂盒，所述试剂盒中包括变构转录因子merr以及含有变构转录因子merr特异性识别序列的双链dna，所述双链dna的merr特异性识别位点下游含有荧光基因。本发明中，所述试剂盒还包括：双蒸水、缓冲液、dntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。本发明中，所述荧光染料优选为dfhbi-1t，所述荧光染料的浓度优选为20mm。本发明中，所述dntps的浓度优选为100mm；所述tipp的浓度优选为0.3u；所述t7 rna聚合酶的浓度优选为200u/μl。
28.本发明还提供了上述的方法或上述的试剂盒在汞污染物检测中的应用。本发明所述试剂盒体系简单、成分明确，检测的灵敏度高，特异性强，可用于现场检测，具有快速、成本低、响应速度快的优势。
29.本发明中，所用原料、试剂与设备均为已知产品，采用常规市售产品即可。
30.本发明中，所用的载体构建、提取及纯化等生物学方法，如无特殊说明，均采用本领域常规的技术手段即可。
31.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
32.实施例1
33.双链dna模板的制备
34.(1)载体质粒的选择：选取puc57质粒为目的基因的载体质粒，puc57质粒的图谱如图1所示；
35.(2)目的基因的合成与扩增：运用化学合成的方法通过脱保护—活化—偶合—封闭—氧化的循环步骤得到全长的目的基因。而后通过上下游引物对目的基因进行pcr扩增。
36.其中，引物序列为：
37.上游引物：5
’‑
gcggataacaatttcacacaggaaacagc-3’(seq id no.3)；
38.下游引物：5
’‑
caaaaaacccctcaagacccg-3’(seq id no.4)。
39.pcr扩增程序：设置为95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火50s，72℃延伸1min，30个循环；72℃终止10min。
40.(3)基因连接：将质粒puc57和目的基因同时经xbal和bamhi双酶切，而后在t4 dna连接酶作用下4℃连接过夜。
41.(4)将质粒转导入感受态细胞dh5α中进行保存。在得到甘油菌后利用质粒小提试剂盒(tiangen,dp103)提取得到质粒。
42.(5)使用高保真pcr试剂盒(biolabs,10104358)对dna进行pcr扩增，使用纯化试剂盒(qiagende,28104)对pcr产物进行纯化。纯化后使用nanodrop测量浓度，用双蒸水稀释至浓度为0.5μm于-20℃储存。
43.(6)将纯化的模板送样测序，测序工作交给生工生物工程(上海)股份有限公司完
成，测序结果如图2所示。
44.实施例2
45.变构转录因子merr的制备
46.特异性识别汞离子的变构转录因子merr为144个氨基酸组成的蛋白质，氨基酸序列为：mennlenltigvfakaagvnvetirfyqrkgllrepdkpygsirrygeadvvrvkfvksaqrlgfsldeiaellrlddgthceeasslaehklkdvrekmadlarmetvlselvcacharkgnvscpliaslqgeaglarsamp，由金斯瑞生物科技股份有限公司完成。
47.实施例3
48.体外转录体系的建立
49.(1)缓冲液的制备：缓冲液成分及终浓度为：spermidine 20mm、ph 8.0的tris-hcl 400mm、mgcl280mm、nacl 200mm、dtt 100mm；配制完成后冰箱4℃保存备用；
50.(2)体外转录体系的建立：在200μl离心管中依次加入双蒸水6.57μl、缓冲液2μl、100mm dntps(atp、utp、ctp、gtp)各0.57μl、0.3u tipp 0.15μl、20mm荧光染料dfhbi-1t 3μl、0.5μm双链dna模板1μl、10μm变构转录因子merr 0.5μl、200u/μl t7 rna聚合酶2μl，混合均匀后在37℃条件下孵育15min，使蛋白merr与dna模板充分结合。
51.实施例4
52.设置10组实验，1-10组分别为0nm(阴性对照组)、0.1nm、0.5nm、1nm、5nm、10nm、50nm、100nm、500nm及1000nm汞离子浓度组。使用实验室用超纯水配制终浓度为100μm的汞离子标准溶液，通过稀释得到相应浓度的汞离子水样，各取2μl滴加到实施例3所述的体外转录体系中，构建2-10组反应；向体系内滴加2μl不含汞离子的实验室用超纯水构成第1组反应，作为阴性对照。
53.将各组反应体系取20μl转移到384孔板(黑底)中，使用酶标仪在37℃条件下对产生的荧光强度进行连续测量。选择酶标仪fl模式，设置酶标仪程序：激发波长为472nm，发射波长为507nm，选取加样孔所在区域对荧光强度进行测量。各组在60min时刻产生的荧光强度结果如图3所示。
54.当标准荧光强度值达到1时可以用肉眼观察到有荧光的出现，由图3可以看出，将检测时间延长至60min，可以进一步提高检测灵敏度，可实现对水中0.5nm汞离子的检出。并且在汞离子浓度为0.5-500nm范围内荧光强度与其有明显的线性关系，将汞离子浓度取对数后得到回归方程：y＝1.701*x+2.121，r2＝0.9916，其中y表示荧光强度，x表示汞离子浓度对数，回归方程曲线如图4所示。
55.可以看出，本技术检测方法能够在0.5-500nm范围内实现对水中汞离子的定量检测，且将检测时间延长可以提高检测灵敏度。
56.实施例5
57.对其他重金属的检测
58.为验证该检测技术的检测特异性，以重金属锌、铜、铅、镉、镍为干扰物加入到检测体系中观察反应结果。
59.设置8组反应，分别为：阳性对照组、阴性对照组、锌、铜、铅、镉、镍以及汞离子组。阳性对照及阴性对照组与实施例4中的体系相同；向反应体系中滴加2μl浓度为200μm的锌、铜离子标准溶液作为实验3组和4组；向反应体系内滴加2μl浓度为10μm的铅、镉、镍、汞离子
标准溶液作为5-8组。而后经过37℃孵育15min后，在紫外下查看结果，结果如图6所示。
60.最后取各组反应体系20μl转移到384孔板(黑底)中，使用酶标仪对产生的荧光强度进行测量。选择酶标仪fl模式，设置酶标仪程序：激发波长为472nm，发射波长为507nm，选取加样孔所在区域对荧光强度进行测量，结果如图5所示。
61.由以上实施例可以看出，本发明所述方法运用变构转录因子特异性识别汞离子的特性，可以实现对1nm汞离子的检出，具有灵敏度高和特异性强的特点，并且本发明体系简单，成分明确，在现场检测不会对环境造成二次污染，具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，能够实现免仪器现场即时检测。
62.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

技术特征：
1.一种现场快速检测汞离子的方法，其特征在于，将待测溶液滴加到体外转录体系中，孵育后进行荧光检测；所述体外转录体系以变构转录因子merr为控制元件，控制下游双链dna中荧光基因的表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变构转录因子merr的氨基酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测溶液与体外转录体系的体积比为1：10。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双链dna中含有变构转录因子merr特异性识别序列。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述双链dna的核苷酸序列如seq id no.2所示。6.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述体外转录体系还包括：双蒸水、缓冲液、dntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。7.一种现场快速检测汞离子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括变构转录因子merr以及含有变构转录因子merr特异性识别序列的双链dna，所述双链dna的merr特异性识别位点下游含有荧光基因。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：双蒸水、缓冲液、dntps、tipp、荧光染料以及t7 rna聚合酶。9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：spermidine 20mm、tris-hcl 400mm、mgcl280mm、nacl 200mm和dtt 100mm。10.权利要求1-6任一项所述的方法或权利要求7-9任一项所述的试剂盒在汞污染物检测中的应用。

技术总结
本发明涉及一种现场快速检测水中汞离子的方法、试剂盒及其应用，属于重金属检测技术领域。本发明以无细胞合成技术为基础，制备简单、反应条件温和的体外转录体系，该体系以能够特异性识别和结合汞离子的变构转录因子MerR为控制元件，控制下游荧光基因的表达，产生绿色荧光。本发明所述方法运用变构转录因子特异性识别汞离子的特性，具有灵敏度高和特异性强的特点。并且本发明体系简单，成分明确，在现场检测不会对环境造成二次污染，具有制备简单、可快速现场检测、成本低、响应速度快的优势，能够实现免仪器现场即时检测。能够实现免仪器现场即时检测。能够实现免仪器现场即时检测。


技术研发人员：王景峰 赵辰 张永康 谌志强 邱志刚 薛斌 李辰宇 王尚 张曦 杨晓波
受保护的技术使用者：军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所
技术研发日：2021.12.28
技术公布日：2022/3/8