芫花素作为新冠病毒抑制剂的应用及其合成方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，涉及芫花素作为新冠病毒抑制剂的应用及其合成方法，具体涉及包含芫花素的药物组合物，芫花素及药物组合物在治疗新冠病毒感染相关疾病、制备抗新冠肺炎药物中的应用，本发明还涉及一种芫花素的合成方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒感染人体而引起的传染性疾病，其症状主要包括发热、乏力、干咳、呼吸困难以及肾衰竭等。目前的治疗方法大多为对症治疗，特别是对一些重症患者疗效较差。因此，开发有效的新型冠状病毒肺炎特效药物成为当下一个迫在眉睫需要解决的课题。
4.芫花素(genkwanin)别名芫花黄素，化学名称5,4
′‑
二羟基-7-甲氧基黄酮，分子式c
16h12
o5。1932年我国天然药物化学家曾广方先生和日本学者中尾万三合作，首次从上海市售芫花中分离出芫花素，并确定了其化学结构。药典记载,芫花味苦、辛，性温有毒,归肺、脾、肾经,其为传统的泻下逐水药,药理学研究表明，芫花对镇咳、祛痰、引产、抗肿瘤、杀虫、抗炎及免疫功能调节等方面药效较好。芫花素还具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及镇痛等多种功效，且毒副反应少。此外，芫花素对调节免疫、抑制乙酰胆碱酯酶以及预防糖尿病等方面具有一定的作用。美国、欧盟等国家将其广泛应用于保健方面，需求量不断地增加，具有广泛的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供芫花素在制备预防和治疗新型冠状病毒感染药物中的新用途，芫花素能够有效抑制新型冠状病毒的3c样蛋白酶(3c-like protease，3clp)的活性，能够用于制备预防和治疗抗新型冠状病毒药物。
6.基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：
7.本发明第一方面，提供芫花素作为新型冠状病毒抑制剂的应用。
8.根据目前的研究结论，多聚蛋白(polyproteins，pp)pp1a和pp1b对于维持冠状病毒rna的合成至关重要，而多聚蛋白的成熟需要经历一系列裂解过程，才能生成多亚基蛋白质复合物(被称为“病毒复制转录酶”)。多亚基蛋白质复合物的主要蛋白酶(main protease，mpro)为3c样蛋白酶(3c-like protease，3clp)和木瓜样半胱氨酸蛋白酶(papain-like cysteine protease，plp)，3clp和plp高度协调催化多聚蛋白的裂解，3clp和plp活性缺失会导致冠状病毒生命周期停止。
9.新型冠状病毒进入细胞依靠刺突蛋白spike识别受体ace2，两种参与新型冠状病毒蛋白酶解过程的关键蛋白酶分别为3c样蛋白酶和木瓜蛋白酶样蛋白酶。因此针对3c样蛋
白酶为靶点的小分子抑制剂可应用于制备预防和治疗新型冠状病毒感染的药物。
10.经本发明筛选验证，芫花素能够抑制新型冠状病毒的3clp活性，从而抑制新型冠状病毒的活性和增殖，缓解感染的宿主细胞内免疫失衡，证实了芫花素可通过调控新型冠状病毒的增殖周期实现对新冠病毒的抑制作用。
11.应当说明的是，本发明第一方面所述芫花素，包括如下式i所示结构的小分子实体化合物，还包括所述化合物的前药、互变异构体、内消旋体、外消旋体、代谢产物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物；
[0012][0013]
优选的，本发明第一方面所述应用具体包括以下任意一种应用方式：
[0014]
(1)芫花素作为活性成分用于制备抗新型冠状病毒的产品；
[0015]
(2)芫花素作为一种模型药剂用于制备新型冠状病毒的抑制模型；
[0016]
(3)芫花素作为3c样蛋白酶抑制剂。
[0017]
进一步的，上述(1)中，所述新型冠状病毒的产品包括抗新型冠状病毒的药物或保健品。
[0018]
进一步的，上述(2)或(3)方面的应用，具体的应用实例如应用于新冠病毒的感染机制研究，或新冠病毒活性药物的筛选。
[0019]
本发明第二方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物中，芫花素作为活性成分。
[0020]
所述药物组合物中，还包括其他抗病毒活性成分，所述其他抗病毒活性成分包括但不限于金刚烷胺、金刚乙胺、恩夫韦地、马拉韦罗、阿昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦、膦甲酸钠、拉米夫定、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、阿德福韦酯、依法韦仑、奈韦拉平、沙奎那韦、奥司他韦、扎那米韦、利巴韦林或干扰素。
[0021]
所述药物组合物中，还包括其他活性成分，包括但不限于抗微生物剂、抗真菌剂、抗氧化剂、缓冲剂、防晒剂、美容剂、香料、润滑剂、湿润剂、干燥剂或增稠剂。
[0022]
当本领域技术人员将上述药物组合物应用于治疗疾病时，可使用任意药学上可接受的给药方式，所述药物组合物可单独给药，但优选采用与其它药学上可接受赋形剂联用的方式，这些赋形剂包括固体、半固体、液体、或气溶胶剂型，如：片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、扁囊剂、液体、悬液、溶液、栓剂、气雾剂等。
[0023]
优选的方式中，所述药物组合物的剂型为口服制剂、肺部吸入制剂、黏膜给药制剂或注射剂。更为优选的方式中，所述剂型为口服制剂采用方便的每日剂量方案，这种方案可按照疾病程度进行调整。上述口服制剂中，可以选择掺入任何常用的赋形剂，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、交联羟甲纤维素钠、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等形成药学上可接受的无毒组合物，制成如颗粒剂、粉末剂、丸剂、片剂、胶囊剂或口服液等形式。
[0024]
活性化合物可在宽剂量范围内有效，通常以药学有效量给药。应理解的是，上述药物组合物作为药物的情况下，医师可根据相关状况确定实际给药量，所述“相关情况”包括待治疗疾病、所选给药途径、实际给药化合物、病人个体的年龄、体重和反应、病人综合征的严重程度等。其他例如作为保健品的用途中，所述芫花素或药物组合物的实际用量由生产企业根据其测试结果推荐，测试方式也属于本领域常规的技术方案，例如参考芫花素的ic
50
、或其药代动力学特征等。
[0025]
本发明第三方面，提供一种用于治疗新型冠状病毒引发疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用治疗剂量的芫花素，和/或第二方面所述药物组合物。
[0026]
上述新型冠状病毒引发疾病的症状，包括但不限于发热、干咳、乏力、鼻塞、流涕、腹泻、肌肉疼痛、淋巴肿胀、身体不适、发痒、炎症、刺激、疼痛、肿胀、灼热感、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、代谢性酸中毒或出凝血功能障碍。
[0027]
本发明第四方面，提供一种新冠肺炎治疗药物，所述治疗药物中，芫花素或第二方面所述药物组合物作为活性成分。
[0028]
本发明第五方面，提供一种芫花素的合成方法，所述方法的合成路线如下：
[0029][0030]
所述制备方法包括将柚皮素甲基化得到7-o-甲基柚皮素，以及氧化所述7-o-甲基柚皮素的步骤。
[0031]
所述制备方法采用半合成的方式，半合成所采用的起始物料柚皮素价廉易得。
[0032]
所述甲基化试剂为碘甲烷、硫酸二甲酯、碳酸二甲酯中的一种或它们的组合物，优选碘甲烷。
[0033]
所述氧化试剂为碘、碘苯二乙酸中的一种或它们的组合物，优选碘。
[0034]
进一步的，所述合成方法的具体步骤如下：
[0035]
向柚皮素的dmf溶液中加入碳酸钾及碘甲烷，室温下搅拌反应一段时间后加入饱和氯化铵溶液终止反应获得7-o-甲基柚皮素；向7-o-甲基柚皮素的吡啶溶液中加入碘，升温反应一段时间，对产物进行纯化得到芫花素。
[0036]
上述合成方法的一种实施方式中，所述柚皮素、碳酸钾及碘甲烷的摩尔比为1：1：1
～2。
[0037]
上述合成方法的一种实施方式中，所述7-o-甲基柚皮素的分离步骤如下；加入氯化铵终止反应后，向反应体系中加入乙酸乙酯萃取，保留有机相洗涤、干燥后经硅胶柱层析得到7-o-甲基柚皮素。
[0038]
上述合成方法的一种实施方式中，所述7-o-甲基柚皮素与碘的摩尔比为2：2～4。
[0039]
上述合成方法的一种实施方式中，所述升温后的反应温度为85～95℃。
[0040]
上述合成方法的一种实施方式中，所述芫花素的纯化方法为：通过减压浓缩去除反应体系中的吡啶，依次采用盐酸及饱和硫代硫酸钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取合并有机相，将有机相部分洗涤并干燥后经硅胶柱层析得到芫花素。
[0041]
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
[0042]
1、本发明一个方面中提供了芫花素对新冠病毒的抑制作用，为新冠肺炎发展的遏制提供了一种活性药物成分，并且芫花素作为一种保健品原料，其生理活性和安全性已经得到广泛的认可。因此，上述包含芫花素的药物组合物或抗新冠肺炎药物的研发有望缩短研发周期，尽快的投入临床治疗。
[0043]
2、本发明的另一个方面，还提供了芫花素的一种化学合成方式，本发明提供的半合成制备方法仅包括选择性甲基化和氧化两步反应，合成路线更加简便、高效，收率较全合成的制备方法有大幅提高(全合成制备方法收率为6～36％)。本发明提供的半合成制备方法以柚皮素为起始原料，柚皮素价廉易得与全合成制备方法所采用的2,4,6-三羟基苯乙酮或其甲基化衍生物相比较具有明显的价格优势，有利于工业放大生产。
附图说明
[0044]
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
[0045]
图1为实施例1中所述芫花素的核磁共振氢谱(1h-nmr)图；
[0046]
图2为实施例1中所述芫花素的核磁共振碳谱(
13
c-nmr)图；
[0047]
图3为实施例2中所述芫花素抑制新型冠状病毒3c样蛋白酶的半抑制浓度ic
50
图。
具体实施方式
[0048]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0049]
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0050]
术语解释：
[0051]
所述“药学上可接受的”：在正确的医学判断范围内，适合与人类和动物组织接触而不会引起额外毒性、刺激、过敏反应或其它问题，与合理受益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0052]
术语“药学上可接受的盐”：保留本发明化合物的生物学有效性和性质且不是生物学或其他方面所不期望的盐。在一些情况下，本发明中化合物能够在酚和/或羧基的存在下形成盐。药学上可接受的碱加成盐可通过无机和有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括例如：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括例如：伯胺、仲胺和叔胺。
[0053]
术语“前药”：化合物的非活性形式，其必须通过体内代谢，如由生物体液或酶和/或由给药后个体体内代谢为该化合物的活性形式以产生所期望的药理学效应。前药可在吸收前、吸收中、吸收后或在特定位点被代谢。可利用化合物的前药形式来提高生物利用度；提高个体可接受性，如掩盖或减少令人不快的特征：如苦味、臭味或胃肠道刺激性；改变溶解性；提供延长或缓慢的释放或递送；使制剂容易；和/或提供化合物的定位递送。本专利中提到化合物则包括该化合物的前药形式。
[0054]
术语“治疗”：包括(i)抑制疾病或失调，即阻滞或抑制疾病或失调的临床症状的发展；和/或(ii)缓解疾病或失调，即引起疾病或失调的临床症状的消退或痊愈。例子包括但不限于：抑制病毒感染症状如损伤的复发或严重性。
[0055]
所述“治疗剂量的”或“治疗有效量的”：对需要治疗的哺乳动物给药时，足以实现治疗的本发明化合物的量。有效剂量根据对象、所治疗疾病状况、个体体重和年龄、疾病的严重程度、所选特定化合物、采取的给药方案等而变化，本领域普通人员易于确定这些因素。
[0056]
正如背景技术所介绍的，开发新型冠状病毒肺炎的特效药物对于控制新冠肺炎的发展和治疗具有重要意义。芫花素分离自瑞香料植物芫花，已经被证实具有抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性，是一种目前广泛应用的保健产品原料。本发明研究证实了，芫花素可通过抑制新型冠状病毒的3c样蛋白酶活性实现对新冠病毒的抑制作用，提供了芫花素在抗新冠病毒方面的应用。另外，本发明还提供了一种芫花素的合成方法，以柚皮素为起始物合成芫花素。
[0057]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
[0058]
实施例1芫花素的合成方法
[0059]
本实施例中，提供一种以柚皮素为起始原料化学合成芫花素的方法，所述合成方法路线如下：
[0060][0061]
250ml圆底烧瓶中将柚皮素(2.72g,10.0mmol)溶于50ml dmf，室温搅拌下依次加入无水碳酸钾(1.38g,10.0mmol)及碘甲烷(2.11g,15.0mmol)。保持室温搅拌反应12.0小时，向反应体系中加入50ml饱和氯化铵溶液终止反应。依次用乙酸乙酯(50ml*2)萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液50ml洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析得7-o-甲基柚皮素白色固体(2.06g,72％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ12.03(s,1h),7.32(d,j＝8.1hz,3h),6.89(d,j＝8.2hz,2h),6.07(s,1h),6.04(s,1h),5.60(s,1h),5.35(d,j＝12.9hz,1h),3.80(s,4h),3.10(dd,j＝17.1,13.1hz,1h),2.78(d,j＝17.2hz,1h)；
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ196.24,168.12,164.14,162.97,156.25,130.48,128.02,115.73,103.17,95.17,94.34,79.01,55.74,43.17.
[0062]
250ml圆底烧瓶中将7-o-甲基柚皮素(1.43g,5.0mmol)溶于25ml无水吡啶，室温搅拌下加入碘(1.90g,7.5mmol)。升温至90℃，保温搅拌反应4.0小时后停止加热，自然降温至室温。减压浓缩蒸除大部分吡啶，残余体系依次用1m盐酸溶液50ml，饱和硫代硫酸钠溶液50ml洗涤，乙酸乙酯(50ml*2)萃取，合并有机相，饱和氯化钠溶液50ml洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，硅胶柱层析得芫花素白色固体(1.31g,92％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ12.72(s,1h),10.30(s,1h),7.73(d,j＝6.9hz,3h),6.72(d,j＝7.2hz,3h),6.60(s,1h),6.53(s,1h),6.13(s,1h),3.64(s,3h)；
13
c nmr(150mhz,dmso-d6)δ182.09,165.30,164.27,161.44,161.32,157.39,128.74,121.22,116.17,104.81,103.13,98.13,92.82,56.20.
[0063]
实施例2芫花素的抑制新型冠状病毒3clpro蛋白活性验证
[0064]
1、新型冠状病毒3clpro蛋白的表达与纯化
[0065]
1.1引物设计
[0066]
根据新型冠状病毒3clpro的基因(orf1ab的蛋白残基3264-3569，genbank检索号：mn908947.3)为模板设计基因特异性引物(3cl-f：gtgccgcgcggcagccatatgtcggcagtgctgcaaagcggtttccgtaagatg，seq id no：1；3cl-r：gtggtggtggtggtgctcgaggggcccttgaaaggtcacaccgctgc，seq id no：2)，其中3clpro-f引物序列带有ndei酶切位点，3clpro-r引物序列带有xhoi酶切位点。在蛋白n端加入savlq 5个氨基酸，构建3clpro自身酶切位点；在蛋白c端的vtfq氨基酸后加入gp两个氨基酸，构建precission蛋白酶酶切位点，促进目的基因与his标签融合表达。
[0067]
1.2新型冠状病毒3clpro基因扩增
[0068]
首先由通用生物合成具有大肠杆菌密码子偏爱性的新型冠状病毒3clpro基因。以合成的新型冠状病毒3clpro的基因作为模板，扩增总体系为100μl。pcr反应体系包括：cdna模板1μl、3cl-r 4μl、3cl-f 4μl、2
×
phanta master mix 50μl和ddh2o 41μl。反应程序具体为：94℃3min的预变性，30次扩增反应(94℃15s，65℃30s，72℃30s)及72℃充分延伸5min。pcr产物取9μl，加入1μl 6
×
gel loading dye purple混合均匀后上样，其中第一个胶孔中加入2μl dna marker，以供样品分离出的条带进行对照(电压150v，40min)。在紫外灯下观察pcr结果，并用切胶刀从凝胶上切下pcr正确片段的条带，放入1.5mlep管中，称重并记录。使用sanprep柱式dna胶回收试剂盒回收pcr产物，使用nano drop测定回收的目的基因浓度与纯度。
[0069]
1.3新型冠状病毒3clpro表达载体的构建
[0070]
使用ndei和xhoi限制性内切酶对pet28a(+)进行酶切，然后胶回收目的质粒片段用于重组连接。具体连接体系包括：pet28a(+)质粒片段20μg、3clpro目的基因40μg、5
×
ceⅱbuffer 5μl、exnaseⅱ2μl，并用水补足50μl。
[0071]
1.4新型冠状病毒3clpro的诱导表达
[0072]
将转化成功的大肠杆菌菌种在37℃下按1％(v/v)接种量接种于25ml含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中预培养过夜，然后将培养物按1％(v/v)接种量接种于1l含有卡那霉素(50μg/ml)的lb液体培养基中37℃培养。当od600达到0.8时，添加0.5mm异丙基-d-硫代半乳糖苷(iptg)在25℃下诱导12h，使3clpro蛋白表达。
[0073]
1.5新型冠状病毒3clpro的纯化
[0074]
1)取1l菌液在5000
×
g条件下离心10min，弃去上清液。
[0075]
2)将沉淀重悬于40ml lysis buffer中(所有缓冲液的ph在4℃下调节)，然后通过高压均质仪裂解3～5min。
[0076]
3)使用冷冻低温离心机将裂解液在4℃下超速离心(15000
×
g)30min，取上清再次超速离心(15000
×
g)30min。
[0077]
4)使用ni-nta柱进行蛋白纯化前，先用lysis buffer平衡ni-nta柱。
[0078]
5)将已离心2～3次的裂解液上清分批次加入至ni-nta柱流穿，流穿结束后，为除去非特异性结合蛋白，加入100ml左右的lysis buffer洗涤ni-nta柱，洗涤结束后使用25ml wash buffer及35ml elution buffer洗脱收集3clpro。
[0079]
6)将裂解液、流穿液、洗涤液、wash buffer及elution buffer各收集20μl。
[0080]
7)每个样品加入5μl 5
×
sds-page protein loading buffer吹打混匀，在95℃条件下加热10min使蛋白样品变性，每管样品取10μl进行sds-page电泳，其中第一个胶孔中加入2μl prestained protein ladder，以供样品分离出的条带进行对照(电压220v，45min)。
[0081]
8)根据sds-page电泳结果浓缩洗脱液至2ml，使用替换液a(20mm hepes，400mm nacl，ph 7.5)替换洗脱液3次，最终得到4ml 3clpro浓缩液，使用nano drop测定蛋白浓度。在浓缩液中加入13mg/ml precission蛋白酶(ppe)100μl酶切过夜。
[0082]
9)使用gfc buffer(100mm nacl，20mm hepes，ph 7.5)平衡凝胶过滤分子筛层析柱(hiload 16/600superdex 200pg)。
[0083]
10)将4ml酶切处理后的3clpro浓缩液均分至3个1.5ml ep管中，4℃下超速离心
12000
×
g，10min。
[0084]
11)去除沉淀后，使用螺旋注射器将蛋白样品推入5ml上样环中，通过akta蛋白纯化仪进行蛋白纯化。
[0085]
12)浓缩从凝胶过滤分子筛层析柱洗脱下来的含有高纯度3clpro部分，浓缩液依次使用替换液b(20mm hepes，200mm nacl，ph 7.5)和替换液c(20mm hepes，100mm nacl，ph 7.5)替换3次，使用nano drop测定蛋白浓度。将3clpro蛋白按50μl/管进行分装，液氮速冻后放入-80℃保存。
[0086]
2、活性测试
[0087]
1)通过荧光共振能量转移技术(fret)测定新型冠状病毒3clpro活性及化合物对新型冠状病毒3clpro的抑制活性。测定试验中使用带有新型冠状病毒3clpro切割位点(箭头所示)的荧光底物(dabcyl-ktsavlq
↓
sgfrkm-e(edans)-nh2)和tris-hcl缓冲液(50mm tris-hcl，1mm edta，ph 7.3)。
[0088]
2)化合物由100％dmso溶解。取上述10μl化合物分别与40μl新型冠状病毒3clpro(终浓度0.1μm)在tris-hcl缓冲液中孵育1h，通过添加50μl荧光底物(dabcyl-ktsavlq
↓
sgfrkm-e(edans)-nh2、终浓度为20μm)引发反应。使用放射共振能量转移荧光分光光度计检测由于3clpro催化的底物裂解而产生的dabcyl荧光信号(340nm(激发)/490nm(发射))，通过3min内荧光信号的变化，从而判定化合物是否具有抑制活性。
[0089]
3)新型冠状病毒3clpro动力学常数通过将数据拟合到michaelismenten方程中得出。
[0090]
4)对芫花素进行ic
50
的测定。使用tris-hcl缓冲液将化合物稀释至梯度浓度(1.5625-100μm和0.15625-10μm)，并使用上述相同终浓度的新型冠状病毒3clpro和荧光底物体系进行测定。化合物的ic
50
值由graphpad prism 8.0软件计算。每次实验三个平行，最终结果用平均值
±
标准差(sd)表示。测试过程中，加入黄芩苷作为阳性对照药。测定结果显示芫花素对新型冠状病毒3clpro的ic
50
值为3.348μm，优于阳性对照药黄芩苷(ic
50
＝9.75μm)。显示出芫花素对新型冠状病毒3clpro的优异抑制活性。
[0091]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.芫花素作为新型冠状病毒抑制剂的应用。2.如权利要求1所述芫花素作为新型冠状病毒抑制剂的应用，其特征在于，所述芫花素包括如下式i所示结构的小分子实体化合物，还包括所述化合物的前药、互变异构体、内消旋体、外消旋体、代谢产物或其药学上可接受的盐或酯或溶剂化物；3.如权利要求1所述芫花素作为新型冠状病毒抑制剂的应用，其特征在于，所述应用具体包括以下任意一种应用方式：(1)芫花素作为活性成分用于制备抗新型冠状病毒的产品；(2)芫花素作为一种模型药剂用于制备新型冠状病毒的抑制模型；(3)芫花素作为3c样蛋白酶抑制剂。4.如权利要求3所述芫花素作为新型冠状病毒抑制剂的应用，其特征在于，所述(1)中，所述新型冠状病毒的产品包括抗新型冠状病毒的药物或保健品；或，所述(2)或(3)方面的应用，包括应用于新冠病毒的感染机制研究，或新冠病毒活性药物的筛选。5.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中，芫花素作为活性成分。优选的，所述药物组合物中，还包括其他抗病毒活性成分，所述其他抗病毒活性成分包括但不限于金刚烷胺、金刚乙胺、恩夫韦地、马拉韦罗、阿昔洛韦、更昔洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦、膦甲酸钠、拉米夫定、齐多夫定、恩曲他滨、替诺福韦、阿德福韦酯、依法韦仑、奈韦拉平、沙奎那韦、奥司他韦、扎那米韦、利巴韦林或干扰素；或，所述药物组合物中，还包括其他活性成分，包括但不限于抗微生物剂、抗真菌剂、抗氧化剂、缓冲剂、防晒剂、美容剂、香料、润滑剂、湿润剂、干燥剂或增稠剂；或，所述药物组合物与其它药学上可接受赋形剂联用，所述赋形剂包括固体、半固体、液体、或气溶胶剂型；进一步的，为片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、扁囊剂、液体、悬液、溶液、栓剂、气雾剂；或，所述药物组合物的剂型为口服制剂、肺部吸入制剂、黏膜给药制剂或注射剂；更为优选的方式中，所述剂型为口服制剂，采用方便的每日剂量方案，这种方案可按照疾病程度进行调整；所述口服制剂为颗粒剂、粉末剂、丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。6.一种用于治疗新型冠状病毒引发疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的个体施用治疗剂量的芫花素，和/或权利要求5所述药物组合物。7.一种新冠肺炎治疗药物，其特征在于，所述治疗药物中，芫花素或权利要求5所述药物组合物作为活性成分。8.一种芫花素的合成方法，其特征在于，所述方法的合成路线如下：
所述制备方法包括将柚皮素甲基化得到7-o-甲基柚皮素，以及氧化所述7-o-甲基柚皮素的步骤。9.如权利要求8所述芫花素的合成方法，其特征在于，所述甲基化试剂为碘甲烷、硫酸二甲酯、碳酸二甲酯中的一种或它们的组合物，优选碘甲烷；或，所述氧化试剂为碘、碘苯二乙酸中的一种或它们的组合物，优选碘。优选的，所述合成方法的具体步骤如下：向柚皮素的dmf溶液中加入碳酸钾及碘甲烷，室温下搅拌反应一段时间后加入饱和氯化铵溶液终止反应获得7-o-甲基柚皮素；向7-o-甲基柚皮素的吡啶溶液中加入碘，升温反应反应一段时间，对产物进行纯化得到芫花素。10.如权利要求9所述芫花素的合成方法，其特征在于，所述柚皮素、碳酸钾及碘甲烷的摩尔比为1：1：1～2；或，所述7-o-甲基柚皮素的分离步骤如下；加入氯化铵终止反应后，向反应体系中加入乙酸乙酯萃取，保留有机相洗涤、干燥后经硅胶柱层析得到7-o-甲基柚皮素；或，所述7-o-甲基柚皮素与碘的摩尔比为2：2～4；或，所述升温后的反应温度为85～95℃；或，所述芫花素的纯化方法为：通过减压浓缩去除反应体系中的吡啶，依次采用盐酸及饱和硫代硫酸钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取合并有机相，将有机相部分洗涤并干燥后经硅胶柱层析得到芫花素。

技术总结
本发明涉及芫花素作为新冠病毒抑制剂的应用及其合成方法。本发明研究结果显示芫花素对新冠病毒3C样蛋白酶具有抑制活性，提供了芫花素在新冠肺炎领域的应用。另外，本发明还提供了柚皮素为起始物合成芫花素的方式，合成路线更加简便高效，收率高，适用于工业化生产。适用于工业化生产。适用于工业化生产。


技术研发人员：颜世强 杨杰 何淑旺 王文笙 程中伟 胡醒
受保护的技术使用者：山东达因海洋生物制药股份有限公司
技术研发日：2021.12.10
技术公布日：2022/3/8