一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片、系统和方法

1.本发明涉及生物检测技术、微流控技术和外泌体分离检测技术领域，特别涉及一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片、系统和方法。


背景技术：

2.外泌体是细胞主动分泌的多形性的囊泡样小体，直径大多在30到100nm之间，外泌体携带和传递了多种重要的信号分子包括蛋白、mrna、mirna和脂类分子，广泛存在于细胞培养上清液、血清、血浆、唾液、尿液、羊水等生物体液中。近年来研究表明，外泌体不仅在细胞与细胞间的物质和信息传递中起重要作用，且具有体积小、易穿透生物膜、免疫原性低等优点，可作为药物的良好载体，外泌体携带的特异性蛋白及遗传物质更有望成为癌症、冠心病等多种疾病的早期诊断标志物。例如，肿瘤细胞产生的外泌体中检测到过度表达的蛋白质标志物，如fasl、trail和tgf-β等肿瘤抗原和免疫抑制蛋白，这使得外泌体在肿瘤及相关疾病的诊断中具有重要意义；从人乳汁中提取的外泌体中含有60余种与免疫调节相关的mirna；胶质瘤细胞的外泌体中则含有大量与细胞增殖迁移、血管形成和免疫反应相关的mrna。因此，从人体体液中高效快速分离外泌体对医学研究和临床诊断都至关重要。
3.尽管在体液中外泌体含量丰富，但是其他种类的细胞外囊泡(如微囊泡、凋亡小体)及生物粒子往往会对其检测结果产生干扰，因此对外泌体的分离和纯化是外泌体检测的前提，也是基于外泌体检测的疾病诊断的重要环节。目前仍然没有一种外泌体分离方法可以同时保证外泌体的含量、纯度和生物活性。
4.目前常见的外泌体分离方法有：离心法、过滤离心法、密度梯度离心法、免疫磁珠和色谱法。离心法是目前分离外泌体最常用的方法。收集细胞培养液以后依次用300g、2000g、10000g离心去除细胞碎片和大分子蛋白质，最后100000g离心得到外泌体。该方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，且外泌体容易聚集成块。过滤离心则是利用不同截留相对分子质量(mwco)的超滤膜离心分离外泌体。选择不同大小的mwco膜可使外泌体与其他大分子物质分离。这种方法操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。密度梯度离心是将样本和梯度材料一起超速离心，样品中的不同组分沉降到各自的等密度区。预先将两种浓度蔗糖溶液(如2.5m和0.25m)配成连续梯度体系置于超速离心管中，样本铺在蔗糖溶液上，100000g离心16h，外泌体会沉降到等密度区(1.10～1.18g/ml)。用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，且获取量少。免疫磁珠是包被有抗体的球型磁性微粒，可特异性地与靶物质结合。这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备,但该方法易受到体液中其他生物分子的干扰，无法用于未经处理的体液样本。色谱法利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离。该方法纯度相较于离心法较高但操作复杂，获取量也不高。
5.针对从体液中分离出的外泌体，除了通过透射电镜可以分析外泌体的大小、形态等，其表面携带的蛋白也是人们感兴趣的细胞信息。目前研究人员们最常利用sds-page电
泳法和western-blot来分析得到的外泌体中蛋白的含量及种类，这两种方法的操作过于复杂，大大降低了外泌体检测的时效性。
6.传统的外泌体检测鉴定方法主要有形貌表征、表面蛋白检测及内含核酸检测等，使用sem/tem进行形貌表征最为准确，但不适用于大量样品的快速测量；动态光散射和纳米粒子分析跟踪系统检测能够快速检测外泌体的尺寸大小，但难以区分尺寸相近的蛋白质沉淀和外泌体；表面蛋白可通过免疫印迹、酶联免疫法及流式细胞检测等进行检测，但存在操作复杂耗时、重复性差、干扰因素多等不足；内含核酸可通过pcr进行检测，特异性强，样本浓度要求低，但是操作复杂、设备要求高。
7.鉴于传统外泌体分离检测方法存在所需样本量大、外泌体损伤、回收率低、操作复杂耗时、设备要求高等缺点，亟需一种实现对外泌体的快速、高效分离并针对外泌体表面的特征蛋白进行检测的方法。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片、系统和方法，以克服现有技术存在的缺陷，本发明在快速、准确纯化分离外泌体的同时，还可以针对外泌体表面携带的特定蛋白进行检测，实现一步到位的外泌体分离检测。
9.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片，包括压电基底，所述压电基底的表面键合有微流道，所述微流道包括主流道以及连接在主流道一侧的一级缓冲液流道、一级分离流道、二级缓冲液流道和二级分离流道，所述主流道的一端设置有进样口，另一端连接至检测流道，所述检测流道的内表面修饰有荧光检测探针，所述压电基底上还设置有用于将体液样本中微米尺寸粒子从一级分离流道分离的一级分选电极以及用于将体液样本中亚微米尺寸粒子从二级分离流道分离的二级分选电极；
11.所述一级缓冲液流道的自由端设置有一级缓冲液进液口，所述一级分离流道的自由端设置有一级分离出口，所述二级缓冲液流道的自由端设置有二级缓冲液进液口，所述二级分离流道的自由端设置有二级分离出口，所述检测流道的自由端设置有荧光探针出口。
12.进一步地，按照体液样本流动方向，所述一级缓冲液流道、一级分离流道、二级缓冲液流道和二级分离流道依次连接在主流道的一侧，且一级缓冲液流道与二级缓冲液流道平行设置，一级分离流道和二级分离流道平行设置。
13.进一步地，所述一级缓冲液流道与二级缓冲液流道内缓冲液流动方向与体液样本流动方向之间呈锐角，所述一级分离流道和二级分离流道内液体流动方向与体液样本流动方向之间呈锐角。
14.进一步地，所述一级分选电极和二级分选电极位于主流道的另一侧，且一级分选电极位于一级缓冲液流道和一级分离流道之间，二级分选电极位于二级缓冲液流道和二级分离流道之间。
15.进一步地，所述检测流道呈s型设置；
16.所述荧光检测探针是由偶联重金属纳米粒子的核酸适配体及偶联荧光基团的互补序列ssdna组成的复合体；
17.所述的一级分选电极和二级分选电极是聚焦式表面声波叉指电极。
18.一种基于声表面波的外泌体分选及检测系统，包括进样单元、声表面波控制单元、样品收集器、荧光信号检测单元以及信号输出终端；
19.所述进样单元与进样口、一级缓冲液进液口以及二级缓冲液进液口连接，所述声表面波控制单元与一级分选电极和二级分选电极连接，所述样品收集器与一级分离出口、二级分离出口和荧光探针出口连接，所述荧光信号检测单元对准荧光探针出口，所述信号输出终端与述荧光信号检测单元相连。
20.进一步地，所述进样单元包括空气压缩泵，所述空气压缩机的出口端通过流量控制器连接至进样管，所述进样管包括装有待分离检测样品的第一进样管、装有一级缓冲液的第二进样管和装有二级缓冲液的第三进样管，所述第一进样管连接至进样口，所述第二进样管连接至一级缓冲液进液口，所述第三进样管连接至二级缓冲液进液口。
21.进一步地，所述声表面波控制单元包括信号发生电路，信号发生电路的输出端连接至功率放大电路，所述功率放大电路的输出端连接至一级分选电极和二级分选电极；
22.所述样品收集器包括一级分离液收集管、二级分离液收集管和检测样品收集管，所述一级分离液收集管与一级分离出口连接，所述二级分离液收集管与二级分离出口连接，所述检测样品收集管与荧光探针出口连接。
23.进一步地，所述荧光信号检测单元包括激光二极管，所述激光二极管的输出端设置有二向色镜，二向色镜的上侧依次设置有带通滤波片和凸透镜，所述凸透镜的上侧设置有光电倍增管，光电倍增管的输出端通过信号检测电路连接至信号输出终端；
24.所述信号输出终端包括用于对荧光信号进行采集、分析和记录的信号分析软件以及用于显示检测结果的信号显示设备。
25.一种基于声表面波的外泌体分选及检测方法，通过进样单元进样，待分离检测样品从进样口进入，两级缓冲溶液分别从一级缓冲液进液口以及二级缓冲液进液口进入，待分离检测样品经过一级分选电极和二级分选电极后，排除会影响外泌体检测的生物粒子后，含有外泌体的溶液进入检测流道，通过检测流道中荧光检测探针捕获外泌体，通过荧光探针出口将连接有荧光基团的互补序列溶液通过样品收集器收集，并通过荧光信号检测单元检测荧光强度，进一步通过信号输出终端得到体液样本中外泌体的浓度并显示。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
27.本发明提出了一种集成式的外泌体分离与检测芯片，采用微流控芯片和声表面波技术，在片上即可完成传统实验室采用的繁琐的分离、清洗、检测步骤，大大节省了时间和操作者的工作量，实现一步到位的外泌体快速分选与检测。
28.本发明基于声表面波技术提出的外泌体分选技术，利用流体内不同尺寸粒子在相同声场辐射下，由于尺寸不同受到的声辐射力不同的原理，针对人体体液中不同尺寸的干扰粒子对体液样本中外泌体进行两级分离，第一级分离将微米尺寸粒子分离出流道，第二级分离将亚微米尺寸粒子分离出流道，确保了分选的高精确性和高获得率。相较于传统的梯度密度离心，本发明提出的外泌体分选技术对设备要求更低，且精确性与获得率都更高。
29.本发明利用核酸适配体修饰在流道内表面作为荧光检测探针，体液样本分离后得到的高纯度外泌体直接进入检测流道进行检测，无需额外的收集步骤，简化了操作。该荧光探针特异性高，价格低廉，可针对外泌体表面特定蛋白实现特异性捕获，从而引起荧光信号
的变化，实现对外泌体的精确检测。
30.本发明系统可用于对体液样本中的外泌体进行快速纯化分离，并针对外泌体表面携带的特定蛋白进行检测，实现一步到位的外泌体分离检测。体液样本及缓冲液分别装入进样管中，通过进样系统泵入外泌体分选及检测芯片中，体液样本从进样口进入，经过一级分选电极和二级分选电极后，排除会影响外泌体检测的生物粒子后，含有外泌体的溶液进入检测流道，由于外泌体表面特定蛋白的核酸适配体对该蛋白具有更强的亲和力，因此核酸适配体会与蛋白结合，捕获外泌体，从而释放出连接有荧光基团的互补序列，通过荧光探针出口将连接有荧光基团的互补序列溶液收集样品，通过荧光检测单元检测荧光强度，所述信号分析软件对荧光信号进行采集、分析，得到体液样本中外泌体的浓度，通过所述信号输出终端输出检测结果。
附图说明
31.说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
32.图1为本发明的外泌体分选及检测芯片三维结构示意图；
33.图2为本发明的基于声表面波的外泌体分选及检测原理示意图；
34.图3为本发明的外泌体分选及检测芯片平面结构示意图；
35.图4为本发明系统的结构示意图。
36.其中，1、进样单元；1-1、空气压缩泵；1-2、流量控制器；1-3、进样管；2、声表面波控制单元；2-1、信号发生电路；2-2、功率放大电路；3、外泌体分选及检测芯片；3-1、压电基底；3-2、微流道；3-3、主流道；3-4、一级缓冲液流道；3-5、一级分离流道；3-6、二级缓冲液流道；3-7、二级分离流道；3-8、一级缓冲液进液口；3-9、一级分离出口；3-10、二级缓冲液进液口；3-11、二级分离出口；3-12、进样口；3-13、检测流道；3-14、荧光探针出口；3-15、一级分选电极；3-16、二级分选电极；4、样品收集器；4-1、一级分离液收集管；4-2、二级分离液收集管；4-3、检测样品收集管；5、荧光信号检测单元；5-1、激光二极管；5-2、二向色镜；5-3、带通滤波片；5-4、凸透镜；5-5、光电倍增管；5-6、信号检测电路；6、信号输出终端；6-1、信号分析软件；6-2、信号显示设备；7、荧光检测探针；8、微米尺寸粒子；9、亚微米尺寸粒子。
具体实施方式
37.下面结合附图对本发明做详细描述：
38.一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片，如附图1、附图2和附图3所示，包括：压电基底3-1，压电基底3-1的一侧设有一级分选电极3-15和二级分选电极3-16。压电基底3-1上表面键合有微流道3-2，体液样本从进样口3-12进入微流道3-2，缓冲液从一级缓冲液进液口3-8进入，一级分选电极3-15产生声辐射力较弱的声场，将尺寸较大的微米尺寸粒子8(包括细胞碎片和血小板等粒子)从一级分离出口3-9分离；随后从二级缓冲液进液口3-10通入缓冲液，二级分选电极3-16产生声辐射力较强的声场，将比外泌体大的亚微米尺寸粒子9(包括凋亡小体和微囊泡等粒子)从二级分离出口3-11分离。最后外泌体进入检测流道3-13，由修饰在检测流道内表面的荧光检测探针7对表达表面特征蛋白的外泌体进行特异性捕获及检测；所述的微流道3-2包括进样口3-12，进样口3-12与主流道3-3连接；一级缓冲
液进液口3-8与一级缓冲液流道3-4连接，一级分离出口3-9与一级分离流道3-5连接；二级缓冲液进液口3-10与二级缓冲液流道3-6连接，二级分离出口3-11与二级分离流道9-1连接；主流道3-3还与检测流道3-13连接，检测流道3-13末端与荧光探针出口3-14连接。
39.所述的一级分选电极3-15和二级分选电极3-16是聚焦式表面声波叉指电极，一级分选电极3-15和二级分选电极3-16开启时分别能形成声辐射力大小不同的声场。一级分选电极3-15形成的声场声辐射力较弱，可以驱动尺寸较大的微米尺寸粒子8；二级分选电极3-16形成的声场声辐射力较强，可以驱动尺寸较小的比外泌体大的亚微米尺寸粒子9。
40.所述荧光检测探针7是基于核酸适配体与荧光基团的荧光共振能量转移效应，由偶联重金属纳米粒子的核酸适配体及偶联荧光基团的互补序列ssdna组成的复合体。所述核酸适配体能够特异性捕获外泌体表面表达的蛋白标志物，如cd63、cd81、cd9、epcam等。所述重金属纳米粒子具有荧光淬灭特性，如金纳米粒子。所述荧光基团包括但不限于碳量子点、fam、fitc、cy3、cy5等。
41.一种基于声表面波的外泌体分选及检测系统，如附图4所示，包括进样单元1、声表面波控制单元2、微流控芯片3、样品收集器4、荧光信号检测单元5及信号输出终端6。
42.所述进样单元1包括空气压缩泵1-1、流量控制器1-2、进样管1-3，所述进样管1-3中分别装有待分离检测的样品和缓冲液，所述空气压缩泵1-1提供压力驱动液体进入微流控芯片3，所述流量控制器1-2可控制液体在微流道系统内的流速；
43.所述声表面波控制单元2包括信号发生电路2-1和功率放大电路2-2，所述信号发生电路2-1可生成高频交流信号后通过功率放大电路2-2输入微流控芯片中的叉指电极中，压电基底在叉指电极高频电压的激励下产生谐振，形成声表面波，可通过控制信号发生器的频率和功率放大倍数调节声表面波参数；
44.所述微流控芯片3为上述的基于声表面波的外泌体分选及检测芯片；
45.所述样品收集器4包括一级分离液收集管4-1、二级分离液收集管4-2和检测样品收集管4-3，其中一级分离液收集管4-1与一级分离出口连接，二级分离液收集管4-2与二级分离出口连接，检测样品收集管4-3与荧光探针出口连接；
46.所述荧光信号检测单元5包括激光二极管5-1、二向色镜5-2、带通滤波片5-3、凸透镜5-4、光电倍增管5-5、信号检测电路5-6，所述的激光二极管5-1产生的激光经过二向色镜5-2反射后照射到微流控细胞分选芯片3上，当检测样品中含有荧光探针时，荧光标记物在激光的激发下产生荧光，荧光又依次通过二向色镜5-2、带通滤波片5-3、凸透镜5-4后进入光电倍增管5-5，光电倍增管5-5将荧光信号转换成为电信号，通过检测电路5-6检测并发送至信号输出终端6；
47.所述信号输出终端6包括信号分析软件6-1和信号显示设备6-2，所述信号分析软件6-1为对荧光信号进行采集、分析和记录的软件，所述信号显示设备6-2为二维图像显示器。
48.一种基于声表面波的外泌体分选及检测方法，通过进样单元1进样，待分离检测样品从进样口3-12进入，两级缓冲溶液分别从一级缓冲液进液口3-8以及二级缓冲液进液口3-10进入，待分离检测样品经过一级分选电极3-15和二级分选电极3-16后，排除会影响外泌体检测的生物粒子后，含有外泌体的溶液进入检测流道3-13，通过检测流道3-13中荧光检测探针7捕获外泌体，通过荧光探针出口3-14将连接有荧光基团的互补序列溶液通过样
品收集器4收集，并通过荧光信号检测单元5检测荧光强度，进一步通过信号输出终端6得到体液样本中外泌体的浓度并显示。
49.本发明的原理为：
50.由叉指电极产生的声表面波沿压电基底表面传播，不同尺寸的微粒在声表面波声场中会受到不同大小的声辐射力和粘滞力，其中粘滞力与微粒的半径成正比，而声辐射力与微粒的体积成正比。在声辐射力和粘滞力的共同作用下，体液中尺寸较大的细胞碎片、血小板等微米尺寸粒子受到一级分选电极3-15产生较弱的声场作用下，流动路径产生偏移，从而流向一级分离流道3-5，而尺寸较小的比外泌体大的亚微米尺寸粒子则会流向下一级分选电极，在二级分选电极3-16产生较强的声场作用下，流动路径产生偏移，流向二级分离流道9-1；至此，体液中对外泌体检测可以产生干扰的细胞碎片、血小板、亚微米尺寸粒子都被分离出流道。针对分离后的外泌体，采用基于荧光共振能量转移(fret)效应制备的荧光检测探针进行检测，该效应取决于fret供体-受体对之间的距离。在本发明中，荧光基团作为供体，重金属纳米粒子作为受体。与重金属纳米粒子连接的核酸适配体与荧光基团连接的互补序列结合时，供体-受体对距离较近，荧光基团的荧光被淬灭；当外泌体出现时，由于核酸适配体与外泌体表面特定蛋白间更强的亲和力，核酸适配体与外泌体表面特定蛋白结合，释放荧光基团连接的互补序列，大大增加了供体-受体对之间的距离，导致荧光基团的荧光恢复。通过检测荧光基团荧光强度的变化，可以推断得到体液样本中外泌体的浓度大小。
51.下面结合实施例对本发明做进一步详细描述：
52.实施例1
53.一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片，包括：铌酸锂压电基底，铌酸锂压电基底的一侧设有一级分选电极3-15和二级分选电极3-16。压电基底3-1上表面键合有聚二甲基硅氧烷(pdms)微流道3-2，人体全血样本从进样口3-12进入微流道3-2，0.1
×
pbs缓冲液(ph＝7.4)从一级缓冲液进液口3-8进入，一级分选电极3-15产生声辐射力较弱的声场，将尺寸较大的微米尺寸粒子8从一级分离出口3-9分离；随后从二级缓冲液进液口3-10通入缓冲液，二级分选电极3-16产生声辐射力较强的声场，将比外泌体大的亚微米尺寸粒子9从二级分离出口3-11分离。最后外泌体进入检测流道3-13，由修饰在检测流道内表面的荧光检测探针7对表达cd63蛋白的外泌体进行特异性捕获及检测。
54.所述的一级分选电极3-15和二级分选电极3-16是聚焦式表面声波叉指电极，一级分选电极3-15和二级分选电极3-16开启时分别能形成声辐射力大小不同的声场。一级分选电极3-15形成的声场声辐射力较弱，可以驱动尺寸较大的微米尺寸粒子8；二级分选电极3-16形成的声场声辐射力较强，可以驱动尺寸较小的比外泌体大的亚微米尺寸粒子9。所述的一级分选电极1为聚焦式弧形叉指电极，电极宽度为10μm，电极间距为10μm，电极对数为15对。所述的二级分选电极2为聚焦式弧形叉指电极，电极宽度为5μm，电极间距为5μm，电极对数为15对。
55.所述的微流道3-2包括进样口3-12，进样口3-12与主流道3-3连接；一级缓冲液进液口3-8与一级缓冲液流道3-4连接，一级分离出口3-9与一级分离流道3-5连接；二级缓冲液进液口3-10与二级缓冲液流道3-6连接，二级分离出口3-11与二级分离流道9-1连接；主流道3-3还与检测流道3-13连接，检测流道末端与荧光探针出口3-14连接。
56.所述的荧光检测探针7是基于外泌体表面cd63蛋白核酸适配体与荧光基团的荧光共振能量转移效应，由偶联金纳米粒子的核酸适配体及偶联荧光基团的互补序列ssdna组成的复合体。所述核酸适配体能够特异性捕获外泌体表面表达的cd63蛋白。所述的金纳米粒子直径约为13nm，具有荧光淬灭特性；所述的荧光基团为cy5荧光染料。所述的cd63蛋白的核酸适配体序列为：5
’‑
cooh-caccccacctcgctcccgtgacactaatgcta-sh-c6-3’；所述的互补序列ssdna序列为：5
’‑
tagcattagtgtc-c6-cy5-3’。
57.一种基于声表面波芯片的外泌体一体式分选及检测方法，体液样本从进样口3-12进入，经过一级分选电极3-15和二级分选电极3-16后，排除会影响外泌体检测的生物粒子后，含有外泌体的溶液进入检测流道3-13，由于外泌体表面cd63蛋白的核酸适配体对该蛋白具有更强的亲和力，因此核酸适配体会与cd63蛋白的结合，捕获外泌体，从而释放出连接有cy5荧光染料的互补序列，通过荧光探针出口3-14将连接有cy5荧光染料的互补序列溶液收集并在645nm激发波长下，670nm处检测荧光强度，进一步得到体液样本中外泌体的浓度。
58.实施例2
59.一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片，包括：铌酸锂压电基底，铌酸锂压电基底的一侧设有一级分选电极3-15和二级分选电极3-16。压电基底3-1上表面键合有pdms微流道3-2，结肠癌患者全血样本从进样口3-12进入微流道3-2，0.1
×
pbs缓冲液(ph＝7.4)从一级缓冲液进液口3-8进入，一级分选电极3-15产生声辐射力较弱的声场，将尺寸较大的微米尺寸粒子8从一级分离出口3-9分离；随后从二级缓冲液进液口3-10通入缓冲液，二级分选电极3-16产生声辐射力较强的声场，将比外泌体大的亚微米尺寸粒子9从二级分离出口3-11分离。最后外泌体进入检测流道3-13，由修饰在检测流道内表面的荧光检测探针7对表达cea蛋白的外泌体进行特异性捕获及检测。
60.所述的一级分选电极3-15和二级分选电极3-16是聚焦式表面声波叉指电极，一级分选电极3-15和二级分选电极3-16开启时分别能形成声辐射力大小不同的声场。一级分选电极3-15形成的声场声辐射力较弱，可以驱动尺寸较大的微米尺寸粒子8；二级分选电极3-16形成的声场声辐射力较强，可以驱动尺寸较小的比外泌体大的亚微米尺寸粒子9。所述的一级分选电极1为聚焦式弧形叉指电极，电极宽度为10μm，电极间距为10μm，电极对数为15对。所述的二级分选电极2为聚焦式弧形叉指电极，电极宽度为5μm，电极间距为5μm，电极对数为15对。
61.所述的微流道3-2包括进样口3-12，进样口3-12与主流道3-3连接；一级缓冲液进液口3-8与一级缓冲液流道3-4连接，一级分离出口3-9与一级分离流道3-5连接；二级缓冲液进液口3-10与二级缓冲液流道3-6连接，二级分离出口3-11与二级分离流道9-1连接；主流道3-3还与检测流道3-13连接，检测流道末端与荧光探针出口3-14连接。
62.所述的荧光检测探针7基于外泌体表面cea蛋白核酸适配体与荧光基团的荧光共振能量转移效应，由偶联金纳米粒子的核酸适配体及偶联荧光基团的互补序列ssdna组成的复合体。所述核酸适配体能够特异性捕获外泌体表面表达的cea蛋白。所述的金纳米粒子直径约为5nm，具有荧光淬灭特性；所述的荧光基团为fam荧光染料。所述的cea蛋白的核酸适配体序列为：5
’‑
cooh-tcgcgcgagtcgtctggggaaccatcgagttacaccgaccttctatgtgcggccccccgcatcgtcctccc-sh-c6-3’；所述的互补序列ssdna序列为：5
’‑
gggaggacgatgc-c6-fam-3’。
63.一种基于声表面波芯片的外泌体一体式分选及检测方法，全血样本从进样口3-12进入，经过一级分选电极3-15和二级分选电极3-16后，排除会影响外泌体检测的生物粒子后，含有外泌体的溶液进入检测流道3-13，由于外泌体表面cea蛋白的核酸适配体对该蛋白具有更强的亲和力，因此核酸适配体会与cea蛋白的结合，捕获外泌体，从而释放出连接有fam荧光染料的互补序列，通过荧光探针出口3-14将连接有fam荧光染料的互补序列溶液收集并在494nm激发波长下，522nm处检测荧光强度，进一步得到全血样本中表达cea蛋白的外泌体的浓度。
64.实施例3
65.一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片，包括：铌酸锂压电基底，铌酸锂压电基底的一侧设有一级分选电极3-15和二级分选电极3-16。压电基底3-1上表面键合有聚二甲基硅氧烷(pdms)微流道3-2，乳腺癌患者全血样本从进样口3-12进入微流道3-2，0.1
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pbs缓冲液(ph＝7.4)从一级缓冲液进液口3-8进入，一级分选电极3-15产生声辐射力较弱的声场，将尺寸较大的微米尺寸粒子8从一级分离出口3-9分离；随后从二级缓冲液进液口3-10通入缓冲液，二级分选电极3-16产生声辐射力较强的声场，将比外泌体大的亚微米尺寸粒子9从二级分离出口3-11分离。最后外泌体进入检测流道3-13，由修饰在检测流道内表面的荧光检测探针7对表达epcam蛋白的外泌体进行特异性捕获及检测。
66.所述的一级分选电极3-15和二级分选电极3-16是聚焦式表面声波叉指电极，一级分选电极3-15和二级分选电极3-16开启时分别能形成声辐射力大小不同的声场。一级分选电极3-15形成的声场声辐射力较弱，可以驱动尺寸较大的微米尺寸粒子8；二级分选电极3-16形成的声场声辐射力较强，可以驱动尺寸较小的比外泌体大的亚微米尺寸粒子9。所述的一级分选电极1为聚焦式弧形叉指电极，电极宽度为10μm，电极间距为10μm，电极对数为15对。所述的二级分选电极2为聚焦式弧形叉指电极，电极宽度为5μm，电极间距为5μm，电极对数为15对。
67.所述的微流道3-2包括进样口3-12，进样口3-12与主流道3-3连接；一级缓冲液进液口3-8与一级缓冲液流道3-4连接，一级分离出口3-9与一级分离流道3-5连接；二级缓冲液进液口3-10与二级缓冲液流道3-6连接，二级分离出口3-11与二级分离流道9-1连接；主流道3-3还与检测流道3-13连接，检测流道末端与荧光探针出口3-14连接。
68.所述的荧光检测探针7基于外泌体表面epcam蛋白核酸适配体与荧光基团的荧光共振能量转移效应，由偶联金纳米粒子的核酸适配体及偶联荧光基团的互补序列ssdna组成的复合体。所述核酸适配体能够特异性捕获外泌体表面表达的epcam蛋白。所述的金纳米粒子直径约为20nm，具有荧光淬灭特性；所述的荧光基团为石墨烯量子点(gqd)。所述的epcam蛋白的核酸适配体序列为：5
’‑
cooh-cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg-sh-c6-3’；所述的互补序列ssdna序列为：5
’‑
caggccaaccccc-c6-gqd-3’。
69.实施例4
70.本实施例提供一种基于微流控芯片和声表面波技术的外泌体分离检测系统，包括进样单元1、声表面波控制单元2、外泌体分选及检测芯片3、样品收集器4、荧光信号检测单元5及信号输出终端6。
71.所述进样单元1包括空气压缩泵1-1、流量控制器1-2、进样管1-3，进样管1-3中分别装有待分离检测的样品和缓冲液，空气压缩泵1-1提供压力驱动液体进入外泌体分选及
检测芯片3，流量控制器1-2可控制液体在微流道系统内的流速。
72.所述声表面波控制单元2包括信号发生器2-1和功率放大器2-2，信号发生器2-1可生成高频交流信号后通过功率放大器2-2输入外泌体分选及检测芯片3中的叉指电极中，铌酸锂压电基底在叉指电极高频电压的激励下产生谐振，形成声表面波，可通过控制信号发生器2-1的频率和功率放大倍数调节声表面波参数。
73.所述外泌体分选及检测芯片3采用实施例1-3所示的结构。
74.所述样品收集器4包括一级分离液收集管4-1、二级分离液收集管4-2和检测样品收集管4-3，其中一级分离液收集管4-1与一级分离出口3-9连接，二级分离液收集管4-2与二级分离出口3-11连接，检测样品收集管4-3与荧光探针出口3-14连接。
75.所述荧光信号检测单元5包括激光二极管5-1、二向色镜5-2、带通滤波片5-3、凸透镜5-4、光电倍增管5-5、信号检测电路5-6，激光二极管5-1产生的激光经过二向色镜5-2反射后照射到外泌体分选及检测芯片3上，当检测样品中含有荧光探针时，荧光标记物在激光的激发下产生荧光，荧光又依次通过二向色镜5-2、带通滤波片5-3、凸透镜5-4后进入光电倍增管5-5，光电倍增管5-5将荧光信号转换成为电信号，通过信号检测电路5-6检测并显示荧光强度.
76.所述信号输出终端6为平板电脑，平板电脑安装有信号分析软件6-1，可对荧光信号进行采集、分析和记录，同时具备信号显示设备6-2。
77.一种基于声表面波芯片的外泌体一体式分选及检测方法，全血样本从进样口3-12进入，经过一级分选电极3-15和二级分选电极3-16后，排除会影响外泌体检测的生物粒子后，含有外泌体的溶液进入检测流道3-13，由于外泌体表面epcam蛋白的核酸适配体对该蛋白具有更强的亲和力，因此核酸适配体会与epcam蛋白的结合，捕获外泌体，从而释放出连接有gqd的互补序列，通过荧光探针出口3-14将连接有gqd的互补序列溶液收集并在355nm激发波长下，445nm处检测荧光强度，进一步得到全血样本中表达epcam蛋白的外泌体的浓度。
78.以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

技术特征：
2)连接至进样管(1-3)，所述进样管(1-3)包括装有待分离检测样品的第一进样管、装有一级缓冲液的第二进样管和装有二级缓冲液的第三进样管，所述第一进样管连接至进样口(3-12)，所述第二进样管连接至一级缓冲液进液口(3-8)，所述第三进样管连接至二级缓冲液进液口(3-10)。8.根据权利要求6所述的一种基于声表面波的外泌体分选及检测系统，其特征在于，所述声表面波控制单元(2)包括信号发生电路(2-1)，信号发生电路(2-1)的输出端连接至功率放大电路(2-2)，所述功率放大电路(2-2)的输出端连接至一级分选电极(3-15)和二级分选电极(3-16)；所述样品收集器(4)包括一级分离液收集管(4-1)、二级分离液收集管(4-2)和检测样品收集管(4-3)，所述一级分离液收集管(4-1)与一级分离出口(3-9)连接，所述二级分离液收集管(4-2)与二级分离出口(3-11)连接，所述检测样品收集管(4-3)与荧光探针出口(3-14)连接。9.根据权利要求6所述的一种基于声表面波的外泌体分选及检测系统，其特征在于，所述荧光信号检测单元(5)包括激光二极管(5-1)，所述激光二极管(5-1)的输出端设置有二向色镜(5-2)，二向色镜(5-2)的上侧依次设置有带通滤波片(5-3)和凸透镜(5-4)，所述凸透镜(5-4)的上侧设置有光电倍增管(5-5)，光电倍增管(5-5)的输出端通过信号检测电路(5-6)连接至信号输出终端(6)；所述信号输出终端(6)包括用于对荧光信号进行采集、分析和记录的信号分析软件(6-1)以及用于显示检测结果的信号显示设备(6-2)。10.一种基于声表面波的外泌体分选及检测方法，采用权利要求6-9任一项所述的一种基于声表面波的外泌体分选及检测系统，其特征在于，通过进样单元(1)进样，待分离检测样品从进样口(3-12)进入，两级缓冲溶液分别从一级缓冲液进液口(3-8)以及二级缓冲液进液口(3-10)进入，待分离检测样品经过一级分选电极(3-15)和二级分选电极(3-16)后，排除会影响外泌体检测的生物粒子后，含有外泌体的溶液进入检测流道(3-13)，通过检测流道(3-13)中荧光检测探针(7)捕获外泌体，通过荧光探针出口(3-14)将连接有荧光基团的互补序列溶液通过样品收集器(4)收集，并通过荧光信号检测单元(5)检测荧光强度，进一步通过信号输出终端(6)得到体液样本中外泌体的浓度并显示。

技术总结
本发明公开了一种基于声表面波的外泌体分选及检测芯片、系统和方法，包括压电基底，所述压电基底的表面键合有微流道，所述微流道包括主流道以及连接在主流道一侧的一级缓冲液流道、一级分离流道、二级缓冲液流道和二级分离流道，所述主流道的一端设置有进样口，另一端连接至检测流道，所述检测流道的内表面修饰有荧光检测探针，所述压电基底上还设置有用于将体液样本中微米尺寸粒子从一级分离流道分离的一级分选电极以及用于将体液样本中亚微米尺寸粒子从二级分离流道分离的二级分选电极。本发明能够实现对外泌体的快速、高效分离并针对外泌体表面的特征蛋白进行检测。并针对外泌体表面的特征蛋白进行检测。并针对外泌体表面的特征蛋白进行检测。


技术研发人员：韦学勇 陈轩 刘湘连 杨磊 蒋庄德
受保护的技术使用者：西安交通大学
技术研发日：2021.12.28
技术公布日：2022/3/8