用HPLC-ELSD测定发酵液中2KGA含量的方法与流程

用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法
技术领域
1.本发明属于液相色谱分析技术领域，尤其涉及一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法。


背景技术：

2.2-酮基-d-葡萄糖酸(2-keto-d-gluconicacid，2kga)可作为饲料的富钙添加剂、洗涤剂的促净剂、水泥增塑剂和摄影显影剂等。同时，2kga还是生产除莠化合物、糠醛、d-阿拉伯糖、d-核酮糖和d-异抗坏血酸(erythorbic acid)及其钠盐(sodium erythorbate)的前体。其中，作为食品添加剂d-异抗坏血酸(钠)的前体是其最主要的用途。
3.在工业生产上，2kga通常是由淀粉水解糖(葡萄糖)经细菌发酵转化而来。2kga的质量浓度是2kga发酵过程控制的一个极其重要的参数，在整个发酵期间需要进行不断的监测。因此，建立准确、快速、经济的2kga定量测定方法是十分必要的。
4.现有技术的缺点：
5.目前2kga的测定方法主要是转化碘量法、旋光度测定法和高效液相色谱(示差折光检测器)法。
6.转化碘量法的原理是：2kga分子内含有可直接发生酯化反应的羧基和醇羟基，还含有可发生互变异构反应的羰基，在强酸性条件下加热2kga水溶液可以将其定量转化为d-异抗坏血酸。利用d-异抗坏血酸与i2的氧化还原反应可以定量测定d-异抗坏血酸的质量浓度，然后换算成2kga的质量浓度。发酵液中的葡萄糖对该方法的测定结果影响很大，且每次测定都需要用2kga标准品做对照实验来确定转化率，实验步骤复杂。
7.旋光度测定法操作方便，但测试液浓度、温度和酸碱度均对2kga含量的测定有影响，误差较大，只适合发酵液中2kga总含量的初步测定。
8.高效液相色谱法克服了以上缺点，具有很高的灵敏性，克服了上述方法的缺点。但是，目前高效液相色谱法测定2kga还存在很大的不足：现有高效液相色谱法中2kga的检测均采用示差折光检测器进行检测，该检测器只能进行等度洗脱。对于分离难度大、需要建立较为复杂的梯度洗脱条件的发酵液难以进行非常准确的检测，且不利于色谱柱的保护。因此，选择合适的色谱柱和流动相，摸索出合适的梯度洗脱条件，建立一套发酵液中2kga检测方法具有很重要的意义。


技术实现要素：

9.本发明为了解决上述现有技术中存在的缺陷和不足，提供了一种通过hplc-elsd从发酵液中检测出2kga含量,分离度好、峰型完美、无杂质，同时用标准曲线法计算出发酵液中2kga含量，通过相关系数、回收率试验、重复性试验均能表明其稳定性、可靠性和精确性高的用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法。
10.本发明的技术方案：一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法，步骤如下：
11.(1)取发酵液50ml，4℃冰箱保存备用；
12.(2)取步骤(1)的发酵液2ml，12000rpm离心10min，取上清液稀释相应倍数，经0.22um有机滤膜过滤，即配制成样品溶液；
13.(3)取步骤(2)的样品溶液，采用hplc-elsd分析，hplc的色谱条件为：色谱柱：cosmosil 5c18-paq(4.6*250mm)，柱温30℃，流速0.6ml/min，进样体积1μl，洗脱方式为梯度洗脱，流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液，流动相b为0.1％(v/v)三氟乙酸乙腈溶液，记录时间为20.10min；蒸发光散射检测器条件为：温度100℃，氮气流量1.5l/min，增益值为1；
14.(4)配制2kga标准溶液，按照步骤(3)的色谱条件和蒸发光散射检测器条件进行hplc-elsd分析，绘制标准曲线；
15.(5)按照步骤(3)的色谱条件和蒸发光散射检测器条件，取发酵液样品溶液进行高效液相色谱分析，用标准曲线法计算出发酵液中2kga含量。
16.优选地，所述步骤(3)中的梯度洗脱为：0～7min时，流动相b体积比为45％；梯度洗脱为：7～10min时，流动相b体积比从45～80％；梯度洗脱为：10～13min时，流动相b体积比从80～45％；梯度洗脱为：13～20min时，流动相b体积比为45％。
17.优选地，所述步骤(3)中hplc采用岛津高效液相色谱仪lc20a；hplc-elsd分析采用sqp分析天平。
18.优选地，所述步骤(4)中配制2kga标准溶液的步骤为：准确称取1g标准品，溶于10ml流动相a(0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液)溶液；取1ml标准溶液逐级稀释制得标准溶液浓度分别为20、10、5、2、1mg/ml。
19.优选地，所述步骤(4)中配制的2kga标准溶液为2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐溶液，称取的标准品为2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐单水合物。
20.优选地，2kga标准溶液分为2kga贮备标准溶液和2kga工作标准溶液，其中2kga贮备标准溶液的制备方法为称取1g2kga于10ml容量瓶中，用去离子水稀释、摇匀，浓度为100mg/ml，密封4℃下保存期24个月；2kga工作标准溶液的制备方法为取2kga贮备标准溶液1ml、2ml、5ml、1ml、2ml于100ml、100ml、100ml、100ml、10ml、10ml、10ml容量瓶中，用流动相稀释、摇匀，配制成浓度为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml，密封4℃下保存期3个月。
21.本发明的有益效果如下：
22.(1)本发明采用的液相色谱条件和蒸发光散射检测器条件适合分离和检测2kga，具有分辨率高、可靠性高、精密度高和重复性高的特点，比较多种c18色谱柱发现：cosmosil 5c18-paq(4.6*250mm)更适合分离2kga，比较多种流动相发现0.1％三氟乙酸乙腈和0.1％三氟乙酸水组合效果最佳，通过配制不同的流动相比例优化了梯度洗脱条件；通过hplc-elsd从发酵液中检测出2kga,分离度好、峰型完美、无杂质；
23.(2)本发明通过配制2kga标准品溶液，用标准曲线法计算出发酵液中2kga含量；相关系数、回收率试验、重复性试验表明该方法测定2kga含量具有稳定性、可靠性和精确性。
附图说明
24.图1为标准品(10mg/ml)hplc-elsd色谱图；
25.图2为发酵液hplc-elsd色谱图；
26.图3为标准曲线图；
27.图4为钙盐hplc-elsd检测色谱图；
28.图5为发酵液加内标后hplc-elsd色谱图；
29.图6为2kga全扫描质谱图；
30.图7为2kga裂解机理图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。虽然本发明已以实施例公开如下，但其并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，或者将本发明的前处理净化技术应用于其他仪器分析，均应属于本发明的保护范围。
32.实施例
33.1.实验部分
34.1.1仪器与试剂：
35.岛津lc-20a型高效液相色谱仪(包括在线脱气机、二元泵、手动进样器、柱温箱、蒸发光散射检测器)；sqp分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；甘2kga标准品(2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐单水合物，纯度99％，麦克林)；三氟乙酸为色谱纯；乙腈为hplc级；去离子水。实验样品：发酵液(浙江圣达生物研究院有限公司提供)。
36.本文中涉及到的浓度为液体的，均是体积浓度。
37.1.2检测发酵液中2kga含量的测定方法，包括如下步骤：
38.s1.标准溶液配制：
39.2kga贮备标准溶液：称取1g2kga于10ml容量瓶中，用去离子水稀释、摇匀，浓度为100mg/ml。密封4℃下保存期24个月。
40.2kga工作标准溶液：取2kga贮备标准溶液1ml、2ml、5ml、1ml、2ml于100ml、100ml、100ml、100ml、10ml、10ml、10ml容量瓶中，用流动相稀释、摇匀，配制成浓度为浓度为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml。密封4℃下保存期3个月。
41.s2.供试品溶液制备：
42.发酵液2ml，12000rpm离心10min，取上清液稀释相应倍数，经0.22um有机滤膜过滤，即配制成样品溶液。
43.s4.液相色谱分析条件：
44.①
色谱柱:cosmosil 5c18-paq，4.6mm
×
250mm
×
5μm。或等效色谱柱。
45.②
流动相:0.1％三氟乙酸水(a)、0.1％三氟乙酸乙腈(b)
46.③
洗脱梯度：0～7min，流动相b体积比为45％；7～10min，流动相b体积比从45～80％；10～13min，流动相b体积比从80～45％；13～20min，流动相b体积比为45％
47.④
流速:0.6ml/min。
48.⑤
柱温:30℃。
49.⑥
进样量:1μl。
50.⑦
蒸发光散射检测器：
51.温度：100℃
52.氮气流量：1.5l/min
53.增益值：1。
54.s5.测定：
55.用2kga标准曲线工作溶液、供试品溶液分别进样，以峰面积的对数值为纵坐标，以标准工作溶液浓度的对数值为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量标准工作溶液及试样溶液中2kga的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，2kga的参考保留时间为4.515min。
56.1.3结果计算与表示
57.结果计算
58.试样中2kga含量(x)以毫克每毫升(mg/ml)表示，按式(1)计算：
59.x＝ncs…………
(1)
60.式中：
61.cs—从2kga标准工作曲线上计算得到的浓度，单位为毫克每升(mg/ml)；
62.n—供试液稀释倍数；
63.结果表示：
64.将符合重复性要求的两个独立测定值的算术平均值作为测定结果(mg/kg)，保留五位有效数字。
65.2结果与讨论
66.2.1液相条件选择
67.2kga可经c18色谱柱进行分离并用示差检测器检测已经有文献报道。本文选择cosmosil 5c18-paq色谱柱，以0.1％三氟乙酸乙腈、0.1％三氟乙酸水溶液作为流动相，对发酵液中2kga的液相色谱分析条件进行研究。
68.本发明分别用25％，45％和85％的0.1％三氟乙酸乙腈对2kga进行分离，发现0.1％三氟乙酸乙腈占比为45％时，2kga出峰时间在4.515min，与钙盐峰、溶剂峰完全分离，可以用于定量分析。
69.2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐单水合物易溶于水，本发明先是选择了去离子水作为标准品(2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐单水合物)的溶解液，按s4方法后发现色谱峰虽然分离度较好，但基线波动较大。原因是流动相与溶解液酸碱度存在较大差异，影响仪器信号输出，导致基线波动大。
70.为此，本发明采用流动相溶解2kga标准品，溶解时为了使2kga充分溶解到流动相中，增加了超声溶解步骤。用流动相溶解后的样液进样，按s4方法后发现基线噪音大幅下降，大大提高了方法灵敏度。色谱图见图1。发酵液按照“s2.供试品溶液制备”方法处理后按s4方法进样检测。色谱图见图2。
71.2.2方法稳定性研究
72.分别在0，1，2，4，8，16h等6个时间段按s4方法进样测定，记录2kga色谱峰峰面积，rsd＝3.545％(n＝6)，符合gb/t27404对检测结果精密度的要求。表明处理后的样液在16h内稳定性良好。结果见表1。
73.表1精密度实验检测数据一览表
74.序号时间保留时间峰面积
10h4.521373091321h4.519365952932h4.515356991044h4.524387075358h4.5263875710616h4.5243888960rsd(％)
ꢀꢀ
3.545
75.2.3方法的线性范围、回收率、精密度和检出限
76.以2kga含量为阴性的发酵液作为阴性基质样品，分别添加相当于1mg/ml，2mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml的2kga，旋涡混合2min，在优化实验条件下，对阴性基质样品进行处理和测定，以2kga峰面积的对数值与加入2kga浓度(mg/ml)的对数值绘制工作曲线，结果见图3。结果表明，2kga在1mg/kg～20mg/kg范围内线性良好，相关系数为0.9975，满足定量分析要求。以(s/n)*3计算检出限(lod)，结果见表2。
77.表2 2kga的线性范围、回归方程、相关系数和检出限：
78.组分名称2kga定量计算方法外标法标准曲线类型计算指数线性范围/(mg/ml)1～20校准曲线公式lnf(x)＝1.50432lnx+11.9083相关系数(r)0.9978拟合度(r2)0.9957检出限(lod)/(mg/ml)0.15
79.在2kga空白样品中添加3个水平的2kga标准溶液，按照“s2.供试品溶液制备”方法处理后做回收率实验，每个添加水平重复测定3次，添加回收率及其相对标准偏差见表3。
80.表3空白发酵液中2kga的加标回收率和精密度：
[0081][0082][0083]
本发明建立了用流动相溶解样品，经高效液相色谱蒸发光散射检测器测定发酵液中2kga含量的检测方法。在阴性发酵液基质中回收率在96％～102％，相对标准偏差0.47％-～1.62％。本方法简便、快速、重复性好、准确度高，是检测发酵液中2kga简便实用的方法。
[0084]
2.4验证性研究
[0085]
2.4.1钙盐峰的验证
[0086]
本发明采用2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐单水合物作为检测发酵液中2-酮基-d-葡萄糖酸的标准品，是有机酸和其钙盐的区别，采用hplc-elsd检测结果中，标准品的色谱图中t＝4.521min处为其主峰，在t＝4.025min处有一个杂质峰，判断其为钙盐峰；为了验证该
假设，用色谱纯氢氧化钙和三氟乙酸配制与标准品相当浓度和ph值的钙盐溶液，按照“s2.供试品溶液制备”方法处理后进行hplc-elsd检测，结果见图4。结果表明，t＝4.025min处的杂质峰为钙盐峰的假设完全正确，从而确定了t＝4.521min处的主峰为2kga峰；发酵液经离子交换树脂处理后不含有钙离子，因此在图3中仅有主峰，没有钙盐杂质峰。
[0087]
2.4.2发酵液样品的内标验证
[0088]
发酵液按照“s2.供试品溶液制备”方法处理后按s4.方法进样检测，从hplc-elsd色谱图(图2)中可以看出，t＝4.515min处有峰，初步判断其为发酵液中2kga的峰；为了证明该判断，将该样品与10mg/ml的2kga标准品溶液按照一定比例混合，作为内标样品进样检测，检测结果见图5。t＝4.516min处峰面积和t＝4.010min处峰面积均与混合比例相一致，从而确定t＝4.515min处峰为发酵液中2kga的峰。
[0089]
2.4.3主峰的质谱验证
[0090]
用相同的色谱柱及洗脱条件对2kga标准品进行lc-ms全扫描，结果见图6。从图中可以看出，保留时间t＝4.521min时，2kga标准品的质谱图中出现了m/z＝193.20的离子碎片，m/z＝103.2为2kga标准品二次裂解的碎片离子；2kga二次裂解机理见图7。综合以上分析，可以确定主峰t＝4.521min的物质是2kga。
[0091]
3实际样品的测定
[0092]
按本文建立的方法离子交换树脂处理前和处理后样品测定，结果见表4。
[0093]
表4各种发酵液样品中2kga含量测定结果
[0094][0095]
本发明通过hplc-elsd从发酵液中检测出2kga含量,分离度好、峰型完美、无杂质，同时用标准曲线法计算出发酵液中2kga含量，通过相关系数、回收率试验、重复性试验均能表明其稳定性、可靠性和精确性高。

技术特征：
1.一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法，其特征在于：其步骤如下：(1)取发酵液50ml，4℃冰箱保存备用；(2)取步骤(1)的发酵液2ml，12000rpm离心10min，取上清液稀释相应倍数，经0.22um有机滤膜过滤，即配制成样品溶液；(3)取步骤(2)的样品溶液，采用hplc-elsd分析，hplc的色谱条件为：色谱柱：cosmosil 5c18-paq(4.6*250mm)，柱温30℃，流速0.6ml/min，进样体积1μl，洗脱方式为梯度洗脱，流动相由流动相a和流动相b组成，所述流动相a为0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液，流动相b为0.1％(v/v)三氟乙酸乙腈溶液，记录时间为20.10min；蒸发光散射检测器条件为：温度100℃，氮气流量1.5l/min，增益值为1；(4)配制2kga标准溶液，按照步骤(3)的色谱条件和蒸发光散射检测器条件进行hplc-elsd分析，绘制标准曲线；(5)按照步骤(3)的色谱条件和蒸发光散射检测器条件，取发酵液样品溶液进行高效液相色谱分析，用标准曲线法计算出发酵液中2kga含量。2.根据权利要求1所述的一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的梯度洗脱为：0～7min时，流动相b体积比为45％；梯度洗脱为：7～10min时，流动相b体积比从45～80％；梯度洗脱为：10～13min时，流动相b体积比从80～45％；梯度洗脱为：13～20min时，流动相b体积比为45％。3.根据权利要求1所述的一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法，其特征在于：所述步骤(3)中hplc采用岛津高效液相色谱仪lc20a；hplc-elsd分析采用sqp分析天平。4.根据权利要求1所述的一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中配制2kga标准溶液的步骤为：准确称取1g标准品，溶于10ml流动相a(0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液)溶液；取1ml标准溶液逐级稀释制得标准溶液浓度分别为20、10、5、2、1mg/ml。5.根据权利要求4所述的一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法，其特征在于：所述步骤(4)中配制的2kga标准溶液为2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐溶液，称取的标准品为2-酮基-d-葡萄糖酸半钙盐单水合物。6.根据权利要求4所述的一种用hplc-elsd测定发酵液中2kga含量的方法，其特征在于：2kga标准溶液分为2kga贮备标准溶液和2kga工作标准溶液，其中2kga贮备标准溶液的制备方法为称取1g2kga于10ml容量瓶中，用去离子水稀释、摇匀，浓度为100mg/ml，密封4℃下保存期24个月；2kga工作标准溶液的制备方法为取2kga贮备标准溶液1ml、2ml、5ml、1ml、2ml于100ml、100ml、100ml、100ml、10ml、10ml、10ml容量瓶中，用流动相稀释、摇匀，配制成浓度为1mg/ml、2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml，密封4℃下保存期3个月。

技术总结
本发明公开了一种用HPLC-ELSD测定发酵液中2KGA含量的方法，步骤如下：1)取发酵液50ml，4℃冰箱保存备用；2)取步骤1)的发酵液2ml，12000rpm离心10min，取上清液稀释相应倍数，经0.22um有机滤膜过滤，即配制成样品溶液；3)取步骤2)的样品溶液，采用HPLC-ELSD分析；4)配制2KGA标准溶液，进行HPLC-ELSD分析，绘制标准曲线；5)取发酵液样品溶液进行高效液相色谱分析，用标准曲线法计算出发酵液中2KGA含量。本发明通过HPLC-ELSD从发酵液中检测出2KGA含量,分离度好、峰型完美、无杂质，同时稳定性、可靠性和精确性高。靠性和精确性高。靠性和精确性高。


技术研发人员：闫妮娜 缪红艳 李中兵 蔡彬 黄亦存 吴佳艳
受保护的技术使用者：浙江圣达生物研究院有限公司
技术研发日：2021.12.22
技术公布日：2022/3/8