CFIm25在检测或治疗动脉粥样硬化中的应用的制作方法

cfim25在检测或治疗动脉粥样硬化中的应用
技术领域
1.本发明涉及分子医学领域，具体涉及cfim25在检测或治疗动脉粥样硬化中的应用。


背景技术：

2.动脉粥样硬化作为心血管疾病最重要的病理生理基础，其重要特征之一是血管平滑肌细胞的增殖，它不仅参与了动脉粥样硬化的形成过程，并直接导致经皮腔内血管成形术术后血管再狭窄。目前临床上并没有找到有效的抑制血管平滑肌细胞增殖的方法。故明确其机制，寻找新的有效的抑制方法对于动脉粥样硬化的防治尤为重要。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明提出了一种cfim25在检测或治疗动脉粥样硬化中的应用。
4.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
5.动脉粥样硬化的治疗靶点的检测试剂，包括：检测cfim25在动脉粥样硬化患者的主动脉组织中表达变化的试剂一与检测是否出现选择性多聚腺苷酸化的试剂二。
6.进一步地，所述试剂一为western blot检测试剂。
7.进一步地，所述western blot检测试剂包括cfim25特异性抗体和内参照gapdh特异性抗体。
8.进一步地，所述cfim25特异性抗体如antibody no.1所示。
9.进一步地，所述内参照gapdh特异性抗体如antibody no.2所示。
10.一种小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：检测cfim25在动脉粥样硬化患者的主动脉组织中表达变化，慢病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达后动脉粥样斑块的病变区域大小的改变，以及细胞增殖标记物ccnd1、igf1r表达量随cfim25的表达变化以及是否存在选择性多聚腺苷酸化。
11.进一步地，所述慢病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达后动脉粥样斑块的病变区域大小的检测包括油红染色和主动脉ct成像。
12.所述慢病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达包括cfim25慢病毒序列如seq no.1所示。
13.所述细胞增殖标记物ccnd1、igf1r表达量随cfim25的表达变化及是否存在可选择性多聚腺苷酸化现象包括通过cfim25、ccnd1及igf1r的特异性引物和内参照18s的特异性引物进行实时荧光定量pcr检测。其中，内参照18s正向引物、反向引物分别如seq no.12～13所示。
14.所述cfim25、ccnd1及igf1r的特异性引物包括cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的正向引物与反向引物；cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的正向引物的序列分别如seq no.2～6所示，所述cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的反向引物的序列如seq no.7～11所示。
15.本发明的有益效果：
16.本发明只需要从动脉粥样硬化患者主动脉组织中提取蛋白样品检测cfim25的表达水平；利用慢病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25基因表达，检测动脉粥样斑块的区域大小；以及利用慢病毒沉默主动脉平滑肌cfim25基因表达，提取主动脉平滑肌细胞的rna，检测增殖标记物ccnd1、igfr的表达以及是否存在apa现象。操作简单、快速、稳定性好。本发明为动脉粥样硬化患者的临床诊治提供强有力的理论支持，具有临床意义和推广价值。
附图说明
17.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
18.图1.cfim25在动脉粥样硬化患者与正常人主动脉组织中蛋白表达差异；
19.图2.小鼠主动脉平滑肌注射cfim25慢病毒、无关对照和生理盐水后，小鼠动脉粥样硬化斑块的区域大小检测；
20.图3.细胞增殖标记物ccnd1、igfr在沉默cfim25后的表达增加且存在apa现象。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
22.western blot检测发现cfim25表达在动脉粥样硬化患者主动脉组织中明显降低。
23.材料与方法：从6例动脉粥样硬化患者和6例正常人主动脉组织中提取总蛋白，50μg总蛋白用于western blot检测。western blot检测法包括总蛋白提取、sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、转膜、封闭、孵育一抗、孵育二抗、显影。
24.1.总蛋白提取包括：
25.(1)取6例动脉粥样硬化患者和6例正常人主动脉组织30mg，放入2ml ep管，低温保存。
26.(2)冰上配置蛋白提取裂解液(ripa强、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂)。
27.(3)每个样品中加入200ul蛋白裂解液，充分裂解肌肉组织，冰上静置30min。
28.(4)样品离心15min(12000rpm，4℃)，吸取上清转移到新的ep管；
29.(5)bca法测蛋白浓度(beyotime biotechnology，p0010)；
30.(6)根据所测蛋白浓度，等量调齐蛋白浓度，不足补水；
31.(7)加入5x loading buffer，置于金属浴95℃，5min。
32.2.sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)包括：
33.(1)选择合适的电泳槽和预制胶(genscript，m00655)、配置好电泳液和转膜液。
34.(2)取适量体积的样品上样，同时取3μl maker作对照。
35.(3)通电，110v电压下进行恒压电泳，70min。
36.3.转膜包括以下步骤：
37.(1)准备好相应大小的pvdf膜(millipore,billerica,ma,usa)，甲醛激活数秒。
38.(2)将电泳凝胶边缘部分剪切，转移到转膜夹上，注意正负极。
39.(3)转膜槽置于冰浴中。通电，300ma，90min。
40.4.封闭包括：
41.(1)提前配置含0.5％的脱脂牛奶封闭液。
42.(2)将转膜后的pvdf膜转移到封闭液中，摇床20转速，室温封闭120min。
43.5.孵育一抗包括：
44.(1)所述cfim25特异性抗体如antibody no.1所示。
45.(2)所述内参照gapdh特异性抗体如antibody no.2所示。
46.(3)按照抗体说明书稀释，摇床20转速，4℃过夜。
47.6.孵育二抗包括：
48.(1)洗膜，摇床70转速，3次，每次10min。
49.(2)根据二抗(antibody no.3和antibody no.4)说明书稀释，置于摇床20转，室温孵育90min。
50.7.显影包括：
51.(1)洗膜，摇床70转速，3次，每次10min。
52.(2)ecl显影液按照1:1配置，显影。
53.(3)采集图像。
54.8.结果分析包括：
55.根据内参照gapdh表达，计算cfim25的灰度值，结果如图1.所示，动脉粥样硬化患者主动脉组织中cfim25表达水平明显低于正常人主动脉中cfim25表达水平。
56.实施例2
57.动脉粥样硬化斑块区域大小检测发现慢病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达后，动脉粥样斑块区域增大。
58.材料与方法：小鼠主动脉平滑肌原位注射cfim25慢病毒，无关对照慢病毒和生理盐水，品种均为c57b/6j，每组6只。
59.1.根据慢病毒说明书，cfim25慢病毒原位注射小鼠主动脉平滑肌，10μl/点，每侧主动脉平滑肌注射3-5点。注射后3-5天慢病毒作用达到峰值，进行斑块区域大小检测。cfim25慢病毒序列如seq no.1所示。
60.2.使用油红染色和主动脉ct成像，检测动脉粥样斑块区域大小。
61.3.统计分析所得数据，结果如图2所示，cfim25慢病毒沉默组小鼠的病变斑块区域明显高于对照组小鼠。
62.实施例3
63.实时荧光定量pcr检测法发现增殖标记物ccnd1、igf1r随cfim25基因敲除而升高且存在apa现象。
64.材料与方法：分别从敲除cfim25和对照组主动脉平滑肌细胞中抽提总rna，1μg rna经逆转录成cdna后，进行实时荧光定量pcr检测。2、所述cfim25、ccnd1及igf1r的特异性引物包括cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的正向引物与反向引物；cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的正向引物的序列分别如seq no.2～6所示，所述cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的反向引物的序列如seq no.7～11所示。
65.1.实时荧光定量pcr反应体系为(pcr检测方法是两个独立反应分别检测cfim25和内参照gapdh mrna的表达，因而下面的正向引物和反向引物分别为各自反应中所使用的特异性引物)：
66.试剂体积sybr green pcr master mix(2x)5μl特异性正向引物(10μm)0.5μl特异性反向引物(10μm)0.5μl无酶水2μlcdna产物2μl总计10μl
67.2.实时荧光定量pcr反应条件
[0068][0069]
3.反应结束后，确认实时荧光定量pcr的扩增曲线和熔解曲线后，根据ct值用内参基因gapdh标准化计算cfim25的相对定量值，计算敲除cfim25和对照组细胞增殖标记物ccnd1、igf1r表达量差异以及是否存在apa现象。结果如图3所示，细胞增殖标记物ccnd1、igf1r随cfim25敲除而升高且存在apa现象。
[0070]
本发明通过western blot检测发现cfim25在动脉粥样硬化患者主动脉组织中表达量低(图1)，提示cfim25可能在动脉粥样硬化的发生发展中有意义。进一步研究发现，沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达后，动脉粥样斑块区域大小增大。更深入研究显示，细胞增殖标记物ccnd1、igf1r随cfim25敲除而升高且存在apa现象。本发明操作简单，快速而稳定。本发明提出cfim25可作为动脉粥样硬化的新治疗靶标，为临床动脉粥样硬化患者的预测和诊断提供有力的依据，以及提供治疗参考价值。
[0071]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0072]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术
人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]

技术特征：
1.动脉粥样硬化的治疗靶点的检测试剂，其特征在于，包括：检测cfim25在动脉粥样硬化患者的主动脉组织中表达变化的试剂一与检测是否出现选择性多聚腺苷酸化的试剂二。2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述试剂一为western blot检测试剂。3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，所述western blot检测试剂包括cfim25特异性抗体和内参照gapdh特异性抗体。4.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述cfim25特异性抗体如antibody no.1所示。5.根据权利要求3所述的检测试剂，其特征在于，所述内参照gapdh特异性抗体如antibody no.2所示。6.一种小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：检测cfim25在动脉粥样硬化患者的主动脉组织中表达变化，腺病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达后动脉粥样斑块的病变区域大小的改变，以及细胞增殖标记物ccnd1、igf1r表达量随cfim25的表达变化以及是否存在选择性多聚腺苷酸化。7.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述腺病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达后动脉粥样斑块的病变区域大小的检测包括油红染色和主动脉ct成像。8.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述腺病毒沉默小鼠主动脉平滑肌cfim25表达包括cfim25腺病毒序列如seq no.1所示。9.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述细胞增殖标记物ccnd1、igf1r表达量随cfim25的表达变化及是否存在可选择性多聚腺苷酸化现象包括通过cfim25、ccnd1及igf1r的特异性引物和内参照18s的特异性引物进行实时荧光定量pcr检测。10.根据权利要求1所述的小鼠模型构建方法，其特征在于，所述cfim25、ccnd1及igf1r的特异性引物包括cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的正向引物与反向引物；cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的正向引物的序列分别如seq no.2～6所示，所述cfim25、ccnd1、ccnd1_long、igf1r及igf1r_long的反向引物的序列如seq no.7～11所示。

技术总结
本发明涉及CFIm25在检测或治疗动脉粥样硬化中的应用，属于分子生物学领域。该检测方法包括蛋白质印迹法(Western Blot)和实时荧光定量PCR技术，以及油红染色及主动脉CT成像检测。本发明利用Western Blot技术检测了CFIm25在动脉粥样硬化患者的主动脉组织中表达水平，利用油红染色及主动脉CT成像检测CFIm25敲除小鼠的动脉粥样斑块的病变区域大小以及利用实时荧光定量PCR技术检测细胞增殖标记物CCND1、IGF1R表达量随CFIm25沉默而增高且存在选择性多聚腺苷酸化。从而得出CFIm25可作为动脉粥样硬化的治疗靶点的判断，操作简单，重复性好。重复性好。重复性好。


技术研发人员：黄菁菁 翁婷婷 高伟 李晓庆 姜磊 陈丹
受保护的技术使用者：南京市浦口医院
技术研发日：2021.08.12
技术公布日：2022/3/8