一种从小鼠心脏分离提取纤维细胞的方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从小鼠心脏分离提取纤维细胞的方法。


背景技术：

2.纤维细胞和成纤维细胞是处于不同功能状态的细胞，在组织损伤后的修复过程中，纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞。纤维细胞较小，呈多角形，胞质较少，弱嗜酸性，胞核亦较小，染色较深，电镜下粗面内质网较少，高尔基复合体不发达。成纤维细胞较大，呈星形或梭形，有突起，细胞核呈卵圆形，染色质稀疏，染色淡，核仁明显，胞质较多。成纤维细胞能合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖，形成胶原纤维、弹性纤维和网状纤维以及基质成分，能够分化为成肌纤维细胞，分泌更多的细胞外基质，在组织重塑中发挥重要作用。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。
3.心脏是重要的生命器官，它与血管组成机体的循环系统。大量的研究资料表明，严重的高原低氧可以破坏心脏的结构，抑制心脏的功能，从而严重影响处于高原低氧环境中的人们的身体健康，甚至威胁人的生命。慢性低氧可引起心肌重塑，传统观念认为，参与组织重塑的间质细胞主要来源于局部组织，成纤维细胞、肌成纤维细胞一直被认为是组织重塑的主要细胞。近年来认为来自于造血干细胞的“纤维细胞”被募集于损伤灶，分化为间质细胞甚至实质细胞、分泌多种炎症因子与细胞外基质，在组织重塑中发挥重要作用。因此，能够快速的分离心脏中的纤维细胞对于研究缺氧引起的右心肥大极为重要。但是传统的分离方法，分离时间长，细胞损失严重，得率低。如果能够快速的分离心肌组织中的纤维细胞，揭示循环纤维细胞浸润至心肌组织中参与心肌重塑中的作用，对于研究缺氧引起心肌纤维化的机制有十分重要的作用，可为高原心脏病的防治提供新的靶点。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种从小鼠心脏分离提取纤维细胞的方法。该方法是一种改进的纤维细胞的分离方法，通过流式细胞术将纤维细胞的表面和胞内marker进行双重染色，该方法分离获得的纤维细胞可供建立稳定检测心脏纤维细胞的实验方法。
5.本发明的一种从小鼠心脏分离提取纤维细胞的方法，包括以下步骤：
6.1)取小鼠心脏组织，用含有10％胎牛血清的1640培养基清洗干净，加入ⅰ型和ⅱ型胶原酶溶液，将组织切或剪成细块，再加入30mmol/l牛磺酸、10mmol/l的hepes和0.5μg/ml dnase，在37℃下进行消化，消化5～30min；
7.2)将消化完的组织进行反复研磨，用细胞过滤器过滤，使细胞全部通过网筛，将滤液进行离心分离，弃上清液，加入红细胞裂解液，裂解后，加入含10％血清的1640培养基终
止裂解，离心；
8.3)弃上清液，加入样本稀释液重悬细胞，将细胞稀释成单细胞悬液，然后加入到组织白细胞分离液的液面上，离心,吸取环状乳白色的细胞层，用pbs缓冲液清洗细胞，离心，反复清洗2～3次，即得到纯化的心肌组织白细胞；
9.4)进行细胞计数，将上步得到的细胞在6孔板中以2
×
106在含有20％胎牛血清、2mmol/l的l-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素的dmem中培养(37℃，5％的co2)3天后，去除未贴壁的t细胞，更换新鲜培养基，继续培养十四天后，使用抗小鼠的cd14免疫磁珠对上述得到的细胞群体进行分选，去除cd14+的单核细胞群，得到心脏纤维细胞。
10.5)心脏纤维细胞的流式细胞鉴定，包括以下过程：
11.a)将上步得到的心脏纤维细胞通过pbs清洗、常规胰酶消化后得到细胞沉淀，重悬细胞为单细胞悬液，在细胞悬液中加入抗体封闭液，重悬细胞，4℃下孵育10min，pbs缓冲液重悬细胞，离心；
12.b)弃上清液，加入pbs缓冲液重悬细胞，加入表面抗体和活细胞染色marker fixable viability dye efluor
tm
780，在室温下避光孵育15min，加入pbs缓冲液重悬细胞，离心；
13.c)弃上清液后涡旋，加入多聚甲醛固定液重悬细胞后，于4℃避光孵育20min，加入洗涤液，离心；
14.d)弃上清液,再加入洗涤液重悬细胞，加入胞内抗体，室温避光孵育25min，然后加入pbs缓冲液重悬细胞，离心；
15.e)弃上清液,加入稀释的间标二抗,室温避光孵育25min，然后加入pbs缓冲液重悬细胞，离心。弃上清液，加入pbs缓冲液重悬细胞即可上流式细胞仪进行检测。
16.6)心脏纤维细胞的免疫荧光染色鉴定，包括以下过程：
17.a)使用i型胶原抗体和cd45抗体对纤维细胞进行鉴定。
18.b)使用cxcr4抗体对纤维细胞进行鉴定。
19.上述本发明的述的方法，步骤1)中所述ⅰ型和ⅱ型胶原酶溶液为用hanks缓冲液配制的0.5mg/ml的ⅰ型和ⅱ型胶原酶，所述消化，消化时间5～30min；步骤2)中，所述离心，离心时间约7min；步骤3)中，所述样本稀释液为2％bsa的pbs，所述离心，第一次离心时间为25min,第二次离心时间为10min。上述本发明的方法，步骤4)中，所述离心，其离心温度为4℃，离心时间6～7min。过程a)中所述抗体封闭液为含5％fbs的pbs稀释的cd16/32抗体，按1:200倍稀释，孵育温度为4℃,孵育时间为10min；过程b)中所述表面抗体为大鼠抗小鼠cd45，用含有5％fbs的pbs对表面抗体进行1：100倍稀释；过程d)中所述抗体是兔抗小鼠i型胶原抗体,用含有5％fbs的pbs对胞内抗体进行1:500倍稀释；过程e)中所述间标二抗是alexa fluor 488goat anti-rabbit igg，用含有5％fbs的pbs对胞内二抗进行1:500倍稀释。
20.上述本发明的方法，各步骤中的pbs缓冲液的浓度为0.01mol/l。
21.上述本发明的方法，所有试剂、生化试剂和酶的用量和用法都是常规方法或按使用说明来操作和使用。
22.目前，分离心脏中的纤维细胞文献报道较少，文献报道较多的是分离外周血中循环纤维细胞。常规方法是通过心脏组织匀浆后，直接用胶原酶进行消化，消化时间相对较
长，耗时比较久，传统消化方法需要1h～2h，而本发明的方法通过加入常规的胶原酶(i型和ii型胶原酶)，再加入30mmol/l牛磺酸、10mmol/l的hepes、0.5μg/ml dnase后在37℃孵箱中孵育5～30min，孵育结束后，去除消化液。使用多种物质的混合消化液对心肌组织进行消化后，大大缩短了消化时间(由1～2h缩短到5～30min，最快5min即可消化完毕)，研磨时组织更容易匀浆，匀浆时对组织中细胞的伤害降低，细胞活性提高，消化后通过分离心肌组织中的白细胞，再通过差速贴壁、免疫磁珠等方法分离心肌中纤维细胞，所得的纤维细胞纯度和得率显著提高，获得的心肌纤维细胞死细胞相对较少，有利于后续实验分析。
23.另外，本发明使用国际上公认的marker对纤维细胞进行流式和免疫荧光鉴定(cd45+i型胶原)，所得的纤维细胞阳性率高，活性好，能够满足后续实验需求。
附图说明
24.图1为为原代分离的心肌纤维细胞光镜照片图，其中a为实施例1的第5步的第(3)培养3天的原代分离的心肌纤维细胞，b为第5步的第(4)的原代分离的心肌纤维细胞贴壁生长14天后的光学显微镜照片；
25.图2为原代分离的心肌纤维细胞贴壁生长14天后的光镜下的10倍照片图即图中的a和b，c和d分别为a和b的20倍光镜照片图；
26.图3为使用免疫荧光对纤维细胞(cd45+i型胶原)进行鉴定结果图；
27.图4为使用免疫荧光对纤维细胞marker(cxcr4)进行鉴定结果图；
28.图5为使用western blot对纤维细胞marker(i型胶原)进行鉴定结果图；
29.图6为使用流式细胞术对纤维细胞进行鉴定和检测的结果图，其中，图6a是检测来自心肌组织中的纤维细胞,图6b是未进行免疫磁珠分选的心肌纤维细胞，图6c为阴性对照。
具体实施方式
30.以下实施例仅是代表性，用以进一步说明和理解本发明的实质，但不以任何方式限制本发明的范围。
31.实施例1小鼠心脏纤维细胞的分离提取
32.1.小鼠心脏组织的取材
33.1)成年健康小鼠颈椎脱臼法处死，浸泡在75％的乙醇中3～5min。
34.2)打开小鼠胸腔，连同心脏和肺组织一同剪下。
35.3)剔除肺组织和心耳部分，用0.01mol/l的pbs缓冲液清洗2～3遍。
36.4)用含有10％胎牛血清的1640培养基清洗1遍，去除结缔组织和心脏内多余的血液。
37.2.组织消化
38.1)将ⅰ型和ⅱ型胶原酶用hanks缓冲液配制0.5mg/ml的ⅰ型和ⅱ型胶原酶溶液，将心脏组织放入60mm的一次性塑料培养皿中，加入10ml配制好的ⅰ型和ⅱ型胶原酶溶液，用直剪将心脏组织剪成约1mm3大小的小块，再加入30mmol/l牛磺酸、10mmol/l的hepes、0.5μg/ml dnase。
39.2)将培养皿中的组织和液体一并加入15ml离心管中，放入37℃孵育箱中进行消化，消化时间5～30min,期间每隔5min进行颠倒混匀一次。
40.3.心脏单细胞悬液的制备
41.1)消化结束后，将15ml离心管从孵育箱中取出，将消化完的组织和消化液倒入装有70μm的细胞过滤器的60mm的一次性培养皿中，用研磨器进行反复研磨，边研磨边将研磨的液体再次加入细胞过滤器上，使细胞全部通过网筛。
42.2)弃去网筛，将组织研磨液全部加入到15ml离心管中，300g，离心7min。
43.3)弃上清，加入3ml红细胞裂解液，裂解1min后，加入6ml含有10％血清的1640培养基终止裂解，300g，离心7min。
44.4.心脏中白细胞的纯化
45.1)弃上清，加入5ml样本稀释液重悬细胞，将细胞稀释成单细胞悬液，备用。
46.2)取一只15ml离心管，加入5ml组织白细胞分离液(分离液不能少于5ml)
47.3)将本步骤第(1)步中得到的心脏单细胞悬液轻轻加到分离液页面上，注意动作一定要轻柔，以免影响分离效果，加完以后，800g，离心25min。
48.4)离心后用吸管小心吸取环状乳白色的细胞层，加入10ml 0.01mol/l的pbs缓冲液清洗细胞，250g，离心10min，反复清洗2～3次，即得到心脏中的白细胞。
49.5.进一步纯化
50.1)使用贝克曼细胞计数仪对细胞进行计数，调整细胞浓度为2
×
106/ml。
51.2)将细胞接种至6孔板中，在含有20％胎牛血清、2mmol/l的l-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素的dmem中培养(37℃，5％的co2)。
52.3)3天后，去除未贴壁的t细胞，(用显微镜拍照，结果见图1的a)更换新鲜培养基。
53.4)继续培养十四天后，(用显微镜拍照，结果见图1的b，图2的a和b)，使用抗小鼠的cd14免疫磁珠对上述得到的细胞群体进行分选，去除cd14+的单核细胞群)即得心肌纤维细胞。
54.6.心脏纤维细胞的免疫荧光检测(cd45+i型胶原)
55.免疫荧光鉴定方法，使用纤维细胞markeri型胶原抗体和cd45抗体对纤维细胞进行鉴定，具体方法如下：
56.1)将细胞做适当稀释后接种于共聚焦培养皿中，用磷酸盐缓冲液(pbs))漂洗细胞，室温下，在4％多聚甲醛(溶于pbs中，ph 7.4)中孵育细胞10min，用冰pbs洗涤细胞3次，每次3min。
57.2)室温下，用封闭液(10％的山羊血清)孵育细胞30min。
58.3)室温下，用大鼠抗小鼠cd45一抗(溶于1％bsa的pbs中)在湿盒中4℃孵育过夜。
59.4)弃去一抗溶液，用pbs洗涤细胞3次，每次3min。
60.5)室温下，用第一种二抗(cy3标记的山羊抗大鼠ig g)(溶于1％bsa的pbs中)避光孵育细胞1h。
61.6)弃去第一种二抗溶液，用pbs避光洗涤细胞3次，每次3min。
62.7)用含0.1～0.25％triton x-100的pbs孵育细胞10min。
63.8)室温下，用兔抗小鼠col i一抗(溶于1％bsa或1％血清的pbs中)在湿盒中避光孵育细胞1h。
64.9)弃去第二种一抗溶液，用pbs避光洗涤细胞3次，每次3min。
65.10)室温下，用第二种二抗(fitc标记的山羊抗兔igg)(溶于1％bsa的pbs中)避光
孵育细胞1h。
66.11)弃去第二种二抗溶液，用pbs避光洗涤细胞3次，每次3min。
67.12)用0.1～1μg/ml的dapi(dna染色，染细胞核)孵育细胞1min。
68.13)用pbs漂洗细胞5次，每次3min。
69.14)用一滴封片介质封闭共聚焦培养皿，4℃下避光保存。
70.15)获得的细胞在奥林巴斯fv1000共聚焦显微镜镜下拍照，结果见图3。其中，图3左上角色偏浅的部分是没有进行免疫荧光染色的光镜下的照片。
71.7.心脏纤维细胞的免疫荧光检测(cxcr4)
72.免疫荧光鉴定方法，使用纤维细胞marker cxcr4抗体对纤维细胞进行鉴定，具体方法如下：
73.1)用磷酸盐缓冲液(pbs))漂洗细胞，室温下，在4％多聚甲醛(溶于pbs中，ph 7.4)中孵育细胞10min，用冰pbs洗涤细胞3次，每次3min。
74.2)室温下，用封闭液(10％的山羊血清)孵育细胞30min。
75.3)用含0.1～0.25％triton x-100的pbs孵育细胞10min。
76.4)室温下，用兔抗小鼠cxcr4一抗(溶于1％bsa的pbs中)在湿盒中4℃孵育过夜。
77.5)弃去一抗溶液，用pbs洗涤细胞3次，每次3min。
78.6)室温下，加入fitc标记的山羊抗兔ig g二抗(溶于1％bsa的pbs中)避光孵育细胞1h。
79.7)弃去二抗溶液，用pbs避光洗涤细胞3次，每次3min。
80.8)用0.1～1μg/ml的dapi(dna染色，细胞核染料)孵育细胞1min。
81.9)用pbs漂洗细胞5次，每次3min。
82.10)用一滴封片介质封闭共聚焦培养皿，4℃下避光保存。
83.11)获得的细胞用奥林巴斯fv1000共聚焦显微镜进行拍照，结果见图4。
84.8.心脏纤维细胞的western blot鉴定(i型胶原)
85.采用常规western blot，使用纤维细胞特异性marker i型胶原对分离得到的纤维细胞进行鉴定，结果见图5。
86.9.心脏纤维细胞的流式细胞染色
87.1)用pbs清洗细胞一次，加入0.25％的胰酶消化细胞，待细胞变圆后，加入含有10％胎牛血清的dmem培养基终止消化，800g，离心6min收集细胞。
88.2)将细胞转入1.5ml离心管中，加入100μl抗体封闭液(cd16/32抗体1:200倍稀释)，轻轻重悬细胞，4℃冰箱孵育10min，孵育结束后，直接加入1.5ml 0.01mol/l的pbs缓冲液重悬细胞。
89.3)4℃，300g，离心7min，弃上清。
90.4)加入100μl的0.01mol/l的pbs缓冲液重悬细胞，加入相应的表面抗体1μl和染死细胞的marker fixable viability dye efluor
tm
780，每孔加入0.5μl,室温下避光孵育15min，孵育结束后，直接加入1.5ml 0.01mol/l的pbs缓冲液重悬细胞。
91.5)4℃，300g，离心7min，弃上清。
92.6)用涡旋避免细胞聚集，涡旋15～20s，加入200μl 4％的多聚甲醛固定液，重悬细胞后，于冰上避光孵育20min。
93.7)加入1.5ml 1
×
洗涤液(5ml胎牛血清+0.01mol/l的pbs 45ml),650g,离心6min。
94.8)弃上清，加入100μl洗涤液(5ml胎牛血清+0.01mol/l的pbs 45ml)重悬细胞。
95.9)加入胞内抗体，室温避光孵育25min，孵育结束后，直接加入1.5ml洗涤液(5ml胎牛血清+0.01mol/l的pbs 45ml)重悬细胞。
96.10)4℃，650g,离心6min，弃上清。
97.11)加入稀释的间标二抗(1:500稀释)，室温避光孵育25min，孵育结束后，直接加入1.5ml 0.01mol/l的pbs缓冲液重悬细胞。
98.12)4℃，650g,离心6min，弃上清。
99.13)加入200μl 0.01mol/l的pbs缓冲液重悬，立即上流式检测或放在4℃冰箱备用。
100.10.心脏纤维细胞的流式细胞检测
101.1)设置电压，在流式细胞仪上先圈定单个细胞，通过fsc和ssc去除黏连细胞和细胞碎片。
102.2)用fixable viability dye efluor
tm
780圈出阴性的活细胞群。
103.3)圈出纤维细胞双阳性(cd45+i型胶原阳性)的细胞群，也可通过流式分选直接得到双阳性的纤维细胞用于后续实验。
104.结果见图6a、6b和6c，其中，图6a是检测来自心肌组织中的纤维细胞,细胞纯度达到70％，图6b是未进行免疫磁珠分选的心肌纤维细胞，没有使用免疫磁珠分选的细胞纯度仅有57.4％，图6c为阴性对照。

技术特征：
1.一种从小鼠心脏分离提取纤维细胞的方法，包括以下步骤：1)取小鼠心脏组织，用含有10％胎牛血清的1640培养基清洗干净，加入ⅰ型和ⅱ型胶原酶溶液，将组织切或剪成小块，再加入30mmol/l牛磺酸、10mmol/l的hepes和0.5μg/ml dnase，在37℃下进行消化，消化5～30min；2)消化结束后，将组织和消化液进行反复研磨，用细胞过滤器过滤，使细胞全部通过网筛，将滤液进行离心分离，弃上清液，加入红细胞裂解液，裂解后，加入含10％血清的1640培养基终止裂解，离心；3)弃上清液，加入样本稀释液重悬细胞，轻轻吹打细胞团，将细胞稀释成单细胞悬液，然后加入到组织白细胞分离液的液面上，离心,吸取环状乳白色的细胞层，用pbs缓冲液清洗细胞，离心，反复清洗2～3次，即得到纯化的心脏中的白细胞；4)进行细胞计数:将上步的细胞接种在6孔板中，以2
×
106在含有20％胎牛血清、2mmol/l的l-谷氨酰胺、100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素的dmem培养基中，在37℃，5％的co2条件下培养3天后，去除未贴壁的t细胞，更换新鲜培养基，继续培养十四天后，使用抗小鼠的cd14免疫磁珠对上述得到的细胞群体进行分选，去除cd14+的单核细胞群,即得到纯化后的心肌纤维细胞。2.如权利要求1所述的方法，步骤1)中所述ⅰ型和ⅱ型胶原酶溶液为用hanks缓冲液配制0.5mg/ml的ⅰ型和ⅱ型胶原酶，所述消化，消化时间5～30min。3.如权利要求1所述的方法，步骤2)中，所述离心，离心时间为7min。4.如权利要求1所述的方法，步骤3)中，所述样本稀释液为含有2％bsa的pbs，所述离心，第一次离心时间是25min,第二次离心时间为10min。5.如权利要求1所述的方法，进一步包括对所得心肌纤维细胞进行流式细胞染色鉴定，包含以下过程：a)在去除cd14+的单核细胞的细胞悬液中加入抗体封闭液，重悬细胞，4℃下孵育10min，pbs缓冲液重悬细胞，离心；b)弃上清液，加入pbs缓冲液重悬细胞，加入表面抗体和活细胞染色marker fixable viability dye efluor
tm
780，在室温下避光孵育15min，加入pbs缓冲液重悬细胞，离心，所述表面抗体是大鼠抗小鼠cd45；c)弃上清液后涡旋，加入多聚甲醛固定液，重悬细胞后，于4℃避光孵育20min，加入洗涤液，离心；d)弃上清液,再加入洗涤液重悬细胞，加入胞内抗体，室温避光孵育25min，然后加入pbs缓冲液重悬细胞，离心，所述抗体是兔抗小鼠i型胶原抗体；e)弃上清液,加入稀释的间标二抗,室温避光孵育25min，然后加入pbs缓冲液重悬细胞，离心,弃上清液，加入pbs缓冲液重悬细胞，制备单细胞悬液，置于4℃冰箱保存或直接上流式细胞仪检测；f)将权利要求1的步骤4所得心肌纤维细胞采用免疫荧光染色鉴定和/或免疫印迹鉴定。6.如权利要求5所述的方法，各过程中，所述离心，其离心温度为4℃，离心时间6～7min。7.如权利要求5所述的方法，过程a)中所述抗体封闭液为cd16/32抗体1:200倍稀释液，
孵育温度为4℃,孵育时间为10min。8.如权利要求5所述的方法，过程e)中所述间标二抗是alexa fluor 488goat anti-rabbit 1:500倍稀释液。9.如权利要求7和8所述的方法，所述稀释液，稀释剂为含有2％bsa的pbs。10.如权利要求1所述的方法，各步骤中的pbs缓冲液的浓度为0.01mol/l。

技术总结
一种从小鼠心脏分离提取纤维细胞的方法，包括取小鼠心脏组织，用含有10％胎牛血清的1640培养基清洗干净，加入Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶、牛磺酸、HEPES和DNase进行消化，加入红细胞裂解液裂解红细胞，加入样本稀释液重悬细胞，将细胞稀释成单细胞悬液，然后加入到组织白细胞分离液的液面上，得到纯化的心脏中的白细胞，将分离的细胞置于培养箱中培养3天后，去除未贴壁细胞，更换新鲜培养基，继续培养十四天后，使用CD14免疫磁珠去除CD14+的单核细胞群,得到心肌纤维细胞，最后使用免疫荧光、流式细胞术和免疫印迹对纤维细胞进行鉴定，用于构建稳定的心肌纤维细胞的的检测方法。的心肌纤维细胞的的检测方法。


技术研发人员：李晓栩 黄缄 矫力 崔宇 阳一栋 殷骏 周晓英 钟志风 周思敏
受保护的技术使用者：中国人民解放军陆军军医大学
技术研发日：2021.12.29
技术公布日：2022/3/8