一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种r-1,3-丁二醇的合成方法，特别涉及一种以利用生物酶催化合成r-1,3-丁二醇的方法。


背景技术：

2.(r)-1,3-丁二醇是一种重要的手性合成子，被广泛地用于碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮、香料、信息激素和杀虫剂等物质的合成。在这些化合物中，碳青霉烯类药物、青霉烯类药物和青霉素都同属于β-内酰胺类抗生素，而青霉素的滥用导致许多抗药性菌株产生，但碳青霉烯类药物能够有效地缓解这些抗药性菌株引起的症状，碳青霉烯类药物在国内被广泛的应用，因此，开发绿色、高效的(r)-1,3-丁二醇合成技术成为国内外重要研究的目的。
3.目前，国内外关于生物催化方法合成(r)-1,3-丁二醇的相关报道很少。1993年，eguchi等利用固定化sp382脂肪酶重复催化双酰基化反应拆分(r,s)-1,3-丁二醇工艺制备(r)-1,3-丁二醇，其光学纯度达98％以上，但其收率较低(tamotsu eguchi,kenichi mochida.lipase-catalyzed diacylation of 1,3-butanediol[j].biotechnol.lett.,1993,15(9):955-960.)。akinobu matsuyama报道了利用近平滑假丝酵母candiaparapsilosis ifo 1396拆分外消旋体制备(r)-1,3-丁二醇，其光学纯度达到94％，得率达到48％，但这两种反应的立体选择性较低，很难满足药物的合成需求(matsuyama a，kobayashi y，ohnishi h.microbial production of optically active 1,3-butanediol from 4-hydroxy-2-butanone.journal of the agricultural chemical society,1993,57(4):685-686.)。


技术实现要素：

[0004]
本发明所要解决的技术问题是合成手性r-1,3-丁二醇。
[0005]
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种r-1,3-丁二醇的合成方法，包括以下步骤：
[0006]
以4-羟基-2-丁酮为底物，利用醇脱氢酶或所述醇脱氢酶的突变体进行催化反应，反应产物为r-1,3-丁二醇。
[0007]
优选的，所述醇脱氢酶来源于：弓形脱硫菌(desulfallas arcticus)、马钱子脱硫弧菌(desulfonatronovibrio magnus)、消化球菌(peptococcaceae bacterium brh_c4b)、嗜热厌氧菌(thermoanaerobacteraceae bacterium)、磺基磺酸盐脱硫弧菌(desulfovibrio sulfodismutans)、斯氏假丝酵母(candidatus stahlbacteria)、硫氧化还原脱硫弧菌(desulfolutivibrio sulfoxidireducens)、脱硫杆菌(desulfobacterales bacterium)、假丝酵母亚细菌(candidatus abyssubacteria bacterium surf_5)、硝化螺旋菌(nitrospirales bacterium)、扁平菌科细菌(planctomycetaceae bacterium)或厌氧绳菌(anaerolineales bacterium)。
[0008]
优选的，来源于弓形脱硫菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；
[0009]
来源于马钱子脱硫弧菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.4所示；
[0010]
来源于消化球菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.6所示；
[0011]
来源于嗜热厌氧菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.8所示；
[0012]
来源于消化球菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.10所示；
[0013]
来源于磺基磺酸盐脱硫弧菌的醇脱氢酶的氨基酸序如seq id no.12所示；
[0014]
来源于斯氏假丝酵母的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.14所示；
[0015]
来源于硫氧化还原脱硫弧菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.16所示；
[0016]
来源于脱硫杆菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.18所示；
[0017]
来源于假丝酵母亚细菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.20所示；
[0018]
来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.22所示；
[0019]
来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.24所示；
[0020]
来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.26所示；
[0021]
来源于扁平菌科细菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.28所示；
[0022]
来源于厌氧绳菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.30所示。
[0023]
优选的，在所述醇脱氢酶的n端和/或c端连接标签。
[0024]
优选的，所述醇脱氢酶的突变体包括：对seq id no.2所示的氨基酸序列进行以下点突变：r80v和/或y147n；
[0025]
对seq id no.4所示的氨基酸序列进行如下点突变中的至少一种：a84g、i85t、k110t、n198d。
[0026]
优选的，所述醇脱氢酶或所述醇脱氢酶的突变体以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式加入。
[0027]
优选的，所述催化反应的温度为20～35℃，所述催化反应的时间为24～48h。
[0028]
优选的，当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式加入时，所述醇脱氢酶在反应体系中的浓度为0.1g/l～10g/l；
[0029]
当所述醇脱氢酶以全细胞的形式加入时，所述全细胞的湿重为100g/l。
[0030]
优选的，所述催化反应在浓度为50～100mm，ph值为6.5～8.5的磷酸盐缓冲液中进行。
[0031]
优选的，当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式加入时，所述催化反应的反应体系中除了含有4-羟基-2-丁酮、所述醇脱氢酶和辅酶nad
+
外，还含有异丙醇。
[0032]
本发明所提供的合成r-1,3-丁二醇的方法中，存在辅因子再生系统。所述辅因子再生系统为醇脱氢酶催化异丙醇氧化促进辅因子再生。在本发明合成r-1,3-丁二醇的方法中，醇脱氢酶催化4-羟基-2-丁酮还原成r-1,3-丁二醇，nad(p)h被重新氧化成nad(p)
+
，同时，醇脱氢酶催化异丙醇氧化成丙酮，nad(p)+被还原成nad(p)h，生成的nad(p)h重新参与到4-羟基-2-丁酮还原成r-1,3-丁二醇的还原。
附图说明
[0033]
图1为醇脱氢酶制备催化4-羟基-2-丁酮合成r-1,3-丁二醇的反应原理图；
[0034]
图2为4-羟基-2-丁酮与r-1,3-丁二醇标准品气相检测峰图；
[0035]
图3为反应液气相检测峰图。
具体实施方式
[0036]
一种利用生物酶催化合成手性r-1,3-丁二醇的方法，可包括如下步骤(反应原理见图1)：以4-羟基-2-丁酮为底物，经醇脱氢酶及其辅酶催化反应生成r-1,3-丁二醇；
[0037]
进一步地，所述醇脱氢酶均可来源于如下任一微生物：弓形脱硫菌(desulfallas arcticus)、马钱子脱硫弧菌(desulfonatronovibrio magnus)、消化球菌(peptococcaceae bacterium brh_c4b)、嗜热厌氧菌(thermoanaerobacteraceae bacterium)、磺基磺酸盐脱硫弧菌(desulfovibrio sulfodismutans)、斯氏假丝酵母(candidatus stahlbacteria)、硫氧化还原脱硫弧菌(desulfolutivibrio sulfoxidireducens)、脱硫杆菌(desulfobacterales bacterium)、假丝酵母亚细菌(candidatus abyssubacteria bacterium surf_5)、硝化螺旋菌(nitrospirales bacterium)、扁平菌科细菌(planctomycetaceae bacterium)或厌氧绳菌(anaerolineales bacterium)；
[0038]
更进一步地，所述醇脱氢酶具体可为如下(a1)-(a15)中任一：
[0039]
(a1)来源于弓形脱硫菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.2；
[0040]
(a2)来源于马钱子脱硫弧菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.4；
[0041]
(a3)来源于消化球菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.6；
[0042]
(a4)来源于嗜热厌氧菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.8；
[0043]
(a5)来源于消化球菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.10；
[0044]
(a6)来源于磺基磺酸盐脱硫弧菌的醇脱氢酶，氨基酸序seq id no.12；
[0045]
(a7)来源于斯氏假丝酵母的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.14；
[0046]
(a8)来源于硫氧化还原脱硫弧菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.16；
[0047]
(a9)来源于脱硫杆菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.18；
[0048]
(a10)来源于假丝酵母亚细菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.20；
[0049]
(a11)来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.22；
[0050]
(a12)来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.24；
[0051]
(a13)来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.26；
[0052]
(a14)来源于扁平菌科细菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.28；
[0053]
(a15)来源于厌氧绳菌的醇脱氢酶，氨基酸序列为seq id no.30；
[0054]
(a16)在(1)-(15)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白；
[0055]
进一步地，所述醇脱氢酶的突变体具体可为如下(b1)-(b3)：
[0056]
(b1)与seq id no.2所示来源于弓形脱硫菌的醇脱氢酶相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种:r80v、y147k；
[0057]
(b2)与seq id no.4所示来源于马钱子脱硫弧菌的醇脱氢酶相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种:a84g、i85t、k110t、n198d；
[0058]
(b3)在(b1)-(b2)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白。
[0059]
所述方法中，所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式发生催化作用的；
[0060]
进一步，所述粗酶液、粗酶液冻干粉和纯酶均按照包括如下步骤的方法制备得到:在宿主细胞中表达所述醇脱氢酶，得到重组细胞；裂解所述重组细胞获得所述粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶；
[0061]
进一步，所述全细胞均按照包括如下步骤的方法制备得到:在宿主细胞中表达所述醇脱氢酶，得到的重组细胞即为所述全细胞；
[0062]
再进一步，所述重组细胞是按照包括如下步骤的方法制备获得的：向所述宿主细胞导入能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子，经诱导培养后获得表达所述醇脱氢酶的所述重组细胞；
[0063]
更进一步，所述“能够表达所述醇脱氢酶的核酸分子”是通过重组载体的形式导入到所述宿主细胞中的；所述重组载体为携带有所述醇脱氢酶的编码基因的细菌质粒(如在细菌中表达的基于t7启动子的表达载体，具体如pet-28a等)、噬菌体、酵母质粒或逆转录病毒包装质粒；和/或所述宿主细胞为原核细胞或低等真核细胞；
[0064]
在本发明的一个实施例中，所述重组载体具体为将所述酶a或所述酶b的编码基因替换pet-28a载体的酶切位点ndei和xhoi之间的小片段后得到的重组质粒。
[0065]
进一步地，所述宿主细胞可为原核细胞或低等真核细胞。
[0066]
更进一步地，所述原核细胞具体可为细菌。所述低等真核细胞具体可为酵母细胞。
[0067]
在本发明的一个实施例中，所述宿主细胞具体为大肠杆菌，更加具体的为e.coli bl21(de3)。相应的，所述诱导培养为向培养体系中加iptg至终浓度0.1-0.5mm(具体如0.1mm)，20-37℃诱导培养12-24h(具体如16h)。
[0068]
所述来源于弓形脱硫菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.1或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0069]
所述来源于马钱子脱硫弧菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.3或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0070]
所述来源于消化球菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.5或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0071]
所述来源于嗜热厌氧菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.7或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0072]
所述来源于消化球菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.9或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0073]
所述来源于磺基磺酸盐脱硫弧菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.11或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0074]
所述来源于斯氏假丝酵母的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.13或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0075]
所述来源于硫氧化还原脱硫弧菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.15或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0076]
所述来源于脱硫杆菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.17或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0077]
所述来源于假丝酵母亚细菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.19或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0078]
所述来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.21或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0079]
所述来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.23或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0080]
所述来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.25或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0081]
所述来源于扁平菌科细菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.27或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0082]
所述来源于厌氧绳菌的醇脱氢酶的编码基因的序列为seq id no.29或在其5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列或保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0083]
所述来源于短小乳杆菌的醇脱氢酶的突变体的编码基因的序列为如下(c1)-(c3)中任一：(c1)与seq id no.1相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种:g239t、t439a；(c2)在(c1)所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；(c3)与(c1)或(c2)所限定的序列相比保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0084]
所述来源于高温厌氧杆菌的醇脱氢酶的突变体的编码基因的序列为如下(d1)-(d3)中任一：(d1)与seq id no.3相比，存在或仅存在如下突变中的至少一种：c251g、t253c、a329c、g593a；(d2)在(d1)所限定序列的5’端和/或3’端连接标签编码序列后得到的融合序列；(d3)与(d1)或(d2)所限定的序列相比保有功能且编码相同蛋白的随机或/和定点诱变序列；
[0085]
在催化反应中，所述催化反应的温度均可为20～35℃，如25～30℃，具体如25℃。所述催化反应的时间均可为24～48h，如24h。
[0086]
当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，所述
催化反应可在浓度为50～100mm，ph值为6.5～8.0的磷酸盐缓冲液中进行，具体如:浓度为50mm，ph值为7.0的磷酸盐缓冲液；当所述醇脱氢酶以全细胞的形式发生催化作用时，催化反应可在浓度为50～100mm，ph值为7.5～8.5的磷酸盐缓冲液，具体如:浓度为50mm，ph值为7.5的磷酸盐缓冲液。
[0087]
当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，所述醇脱氢酶在各自反应体系中的浓度均可为0.1g/l～10g/l，如10g/l。当所述醇脱氢酶以全细胞的形式发生催化作用时，所述反应体系中所述全细胞的浓度为100g/l(每升反应体系中含有所述全细胞的湿重为100g)。
[0088]
在本发明中，所述醇脱氢酶的辅酶具体可为氧化型辅酶i(即nad+)或氧化型辅酶ii(即nadp+)。
[0089]
在本发明中，当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，所述醇脱氢酶的辅酶在其各自的反应体系中的浓度均可为0.1～5mm(具体如5mm)。
[0090]
当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式发生催化作用时，所述催化反应的反应体系中除了含有4-羟基-2-丁酮和所述醇脱氢酶及其辅酶外，还含有异丙醇。
[0091]
具体的，所述催化反应的反应体系组成如下:浓度为50mm，ph值为7.0的磷酸盐缓冲、终浓度为500mm的4-羟基-2-丁酮、终浓度为5mm的氧化型辅酶i(即nad+)或氧化型辅酶ii(即nadp+)、终浓度为10％的异丙醇(v/v)、终浓度为10g/l的所述醇脱氢酶的粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶。
[0092]
当所述醇脱氢酶以全细胞的形式发生催化作用时，所述反应体系中还含有异丙醇。
[0093]
具体的，所述反应体系的组成可为如下：浓度为50mm、ph值为7.5的磷酸盐缓冲液；终浓度为500mm的4-羟基-2-丁酮、终浓度为10％的异丙醇(v/v)、终浓度为100g/l的所述全细胞(即每升反应体系中含有所述全细胞的湿重为100g)。
[0094]
本发明还提供了一种酶及其相关产品。
[0095]
本发明所提供的酶为前文所述醇脱氢酶。当然，也可以包括所述脱氢酶各自的辅酶。
[0096]
所述相关产品可为能够表达所述酶系统中各酶的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
[0097]
所述酶或所述相关产品在合成r-1,3-丁二醇中的应用也属于本发明的保护范围。
[0098]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0099]
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
[0100]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0101]
实施例1醇脱氢酶或其突变体工程菌的制备
[0102]
将醇脱氢酶的编码基因分别进行全基因合成(根据需要以大肠杆菌为宿主进行密码子优化)，将合成的基因连接于pet28a(+)表达载体上，并经测序验证正确后得到重组载体。利用定点突变方法得到其相关基因突变体。
[0103]
将上述测序验证正确的重组表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)的微生物宿主
中，得到本发明的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳的为电转法或化学转化法。
[0104]
本实施例中所涉及的醇脱氢酶或其突变体详见表1。
[0105]
表1醇脱氢酶及其突变体
[0106]
编号菌种基因序列蛋白序列a1弓形脱硫菌(desulfallas arcticus)seqid no.1seqid no.2a2马钱子脱硫弧菌(desulfonatronovibrio magnus)seqid no.3seqid no.4a3消化球菌(peptococcaceae bacterium brh_c4b)seqid no.5seqid no.6a4嗜热厌氧菌(thermoanaerobacteraceae bacterium)seqid no.7seqid no.8a5消化球菌(peptococcaceae bacterium brh_c4b)seqid no.9seqid no.10a6磺基磺酸盐脱硫弧菌(desulfovibrio sulfodismutans)seqid no.11seqid no.12a7斯氏假丝酵母(candidatus stahlbacteria)seqid no.13seqid no.14a8硫氧化还原脱硫弧菌(desulfolutivibrio sulfoxidireducens)seqid no.15seqid no.16a9脱硫杆菌(desulfobacterales bacterium)seqid no.17seqid no.18a10假丝酵母亚细菌(candidatus abyssubacteria)seqid no.19seqid no.20a11硝化螺旋菌(nitrospirales bacterium)seqid no.21seqid no.22a12硝化螺旋菌(nitrospirales bacterium)seqid no.23seqid no.24a13硝化螺旋菌(nitrospira sp.)seqid no.25seqid no.26a14扁平菌科细菌(planctomycetaceae bacterium)seqid no.27seqid no.28a15厌氧绳菌(anaerolineales bacterium)seqid no.29seqid no.30b1弓形脱硫菌(desulfallas arcticus)seqid no.31seqid no.32b2马钱子脱硫弧菌(desulfonatronovibrio magnus)seqid no.33seqid no.34
[0107]
实施例2醇脱氢酶或其突变体的表达及粗酶制备
[0108]
将实施例1构建的醇脱氢酶或突变体的重组表达载体转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，37℃培养12-16h，待转化子长出，将单个转化子接种到含有卡纳霉素(50μg/ml)的5ml lb培养基中，37℃、220rmp培养过夜(12-16h)。然后按照1％(体积百分含量)的比例接种到lb培养基中，37℃、220rmp培养到od600nm为0.6左右，添加终浓度为0.1mm的iptg，25℃诱导培养16h，于4℃，6000rpm离心20min收集菌体，用50mm，ph值为7.0的磷酸盐缓冲重悬清洗一次，之后超声破菌并制备酶冻干粉。
[0109]
实施例3利用醇脱氢酶或突变体的粗酶制备r-1,3-丁二醇
[0110]
在反应体系中依次加入浓度为50mm，ph值为7.0的磷酸盐缓冲液、终浓度为500mm的4-羟基-2-丁酮、终浓度为5mm的氧化型辅酶i(即nad+)、终浓度为10％(v/v)的异丙醇和终浓度为10g/l的醇脱氢酶冻干粉或酶液组成反应体系。将该反应体系在25℃的条件下反应24h。
[0111]
反应结束后，反应液中加入等体积乙酸乙酯萃取，涡旋振荡10min，离心(14000rpm，2min)。取上相过0.22μm膜，进行气相色谱检测。气相检测条件为：手性柱supelcoβ-120(250*2.5mm)，柱温：140℃，进样口温度：250℃，fid检测器温度：300℃。
[0112]
气相色谱检测结果如图2～3所示。图2为4-羟基-2-丁酮和r-1,3-丁二醇标准品气相检测峰图，4-羟基-2-丁酮保留时间在7.6min左右，r-1,3-丁二醇的保留时间在8.3min左右；图3为醇脱氢酶或突变体粗酶制备r-1,3-丁二醇的气相检测图，表2为醇脱氢酶或其突变体粗酶制备r-1,3-丁二醇的结果。
[0113]
表2醇脱氢酶或其突变体粗酶制备r-1,3-丁二醇的结果
[0114][0115][0116]
实施例4利用醇脱氢酶或突变体的全细胞制备r-1,3-丁二醇
[0117]
在反应体系中依次加入浓度为50mm，ph值为7.5的磷酸盐缓冲液、终浓度为500mm的4-羟基-2-丁酮、终浓度为5mm的氧化型辅酶i(即nad+)、终浓度为10％(v/v)的异丙醇和终浓度为100g/l的醇脱氢酶全细胞组成反应体系。将该反应体系在25℃的条件下反应24h。
[0118]
反应结束后，反应液中加入等体积乙酸乙酯萃取，涡旋振荡10min，离心(14000rpm，2min)。取上相过0.22μm膜，进行气相色谱检测。气相检测条件为：手性柱supelcoβ-120(250*2.5mm)，柱温：140℃，进样口温度：250℃，fid检测器温度：300℃。表3为醇脱氢酶或其突变体全细胞制备r-1,3-丁二醇的结果。
[0119]
表3醇脱氢酶或其突变体全细胞制备r-1,3-丁二醇的结果
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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技术特征：
1.一种r-1,3-丁二醇的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：以4-羟基-2-丁酮为底物，利用醇脱氢酶或所述醇脱氢酶的突变体进行催化反应，反应产物为r-1,3-丁二醇。2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述醇脱氢酶来源于：弓形脱硫菌(desulfallas arcticus)、马钱子脱硫弧菌(desulfonatronovibrio magnus)、消化球菌(peptococcaceae bacterium brh_c4b)、嗜热厌氧菌(thermoanaerobacteraceae bacterium)、磺基磺酸盐脱硫弧菌(desulfovibrio sulfodismutans)、斯氏假丝酵母(candidatus stahlbacteria)、硫氧化还原脱硫弧菌(desulfolutivibrio sulfoxidireducens)、脱硫杆菌(desulfobacterales bacterium)、假丝酵母亚细菌(candidatus abyssubacteria bacterium surf_5)、硝化螺旋菌(nitrospirales bacterium)、扁平菌科细菌(planctomycetaceae bacterium)或厌氧绳菌(anaerolineales bacterium)。3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，来源于弓形脱硫菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.2所示；来源于马钱子脱硫弧菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.4所示；来源于消化球菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.6所示；来源于嗜热厌氧菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.8所示；来源于消化球菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.10所示；来源于磺基磺酸盐脱硫弧菌的醇脱氢酶的氨基酸序如seq id no.12所示；来源于斯氏假丝酵母的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.14所示；来源于硫氧化还原脱硫弧菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.16所示；来源于脱硫杆菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.18所示；来源于假丝酵母亚细菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.20所示；来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.22所示；来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.24所示；来源于硝化螺旋菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.26所示；来源于扁平菌科细菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.28所示；来源于厌氧绳菌的醇脱氢酶的氨基酸序列如seq id no.30所示。4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，在所述醇脱氢酶的n端和/或c端连接标签。5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述醇脱氢酶的突变体包括：对seq id no.2所示的氨基酸序列进行以下点突变：r80v和/或y147n；对seq id no.4所示的氨基酸序列进行如下点突变中的至少一种：a84g、i85t、k110t、n198d。6.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述醇脱氢酶或所述醇脱氢酶的突变体以粗酶液、粗酶液冻干粉、纯酶或全细胞的形式加入。7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述催化反应的温度为20～35℃，所述催化反应的时间为24～48h。8.根据权利要求1或6所述的合成方法，其特征在于，当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶
液冻干粉或纯酶的形式加入时，所述醇脱氢酶在反应体系中的浓度为0.1g/l～10g/l；当所述醇脱氢酶以全细胞的形式加入时，所述全细胞的湿重为100g/l。9.根据权利要求8所述的合成方法，其特征在于，所述催化反应在浓度为50～100mm，ph值为6.5～8.5的磷酸盐缓冲液中进行。10.根据权利要求1或6所述的合成方法，其特征在于，当所述醇脱氢酶是以粗酶液、粗酶液冻干粉或纯酶的形式加入时，所述催化反应的反应体系中除了含有4-羟基-2-丁酮、所述醇脱氢酶和辅酶nad
+
外，还含有异丙醇。

技术总结
本发明公开了一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用。该方法包括如下步骤：以4-羟基-2-丁酮为底物，经醇脱氢酶或醇脱氢酶酶的突变体催化反应生成R-1,3-丁二醇。本发明提供了一种以4-羟基-2-丁酮为原料，通过单酶催化合成R-1,3-丁二醇的合成方法。丁二醇的合成方法。丁二醇的合成方法。


技术研发人员：贾振华 李冉 宋聪 宋水山 张翔
受保护的技术使用者：河北省科学院生物研究所
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8