一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒及其制备方法与流程

1.本发明涉及体外诊断技术领域，具体涉及一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.肌酸激酶(ck)是一种二聚体酶，具有四种同工酶形式：骨骼肌型(ck-mm)、脑型(ck-bb)、心肌型(ck-mb)和线粒体型(ckm)。ck是一个与细胞内能量运转、肌肉收缩、atp再生有直接关系的重要激酶，它可逆地催化肌酸与atp之间的转磷酰基反应。在临床上，ck活性的检测主要用于诊断和监控心肌损伤、肌肉萎缩等疾病。在心肌损伤发生时，ck会从受损细胞中释放入血，使血清ck水平迅速提高，例如急性心肌梗死发生后4小时，血清中ck的活性开始升高，24小时达到高峰，3-4日内恢复正常水平。
3.目前应用最为广泛的检测血清或血浆中ck活性的方法为ifcc推荐的方法，即磷酸肌酸底物法，该方法利用ck催化高能磷酸键在肌酸和atp之间转换，生成磷酸肌酸和adp的可逆反应，随后在葡萄糖、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等作用下，引发nadp向nadph的转化，使用生化分析仪检测340nm波长处吸光度的变化，可知被检测血清中的肌酸激酶的活性。反应方程式如下：
[0004][0005][0006][0007]
由于肌酸激酶活性检测试剂反应原理要经过三步反应，试剂中含有底物、酶、活化剂、稳定剂、激活剂等多种组成成分，在生化检测试剂盒中组分数量几乎是最多的。
[0008]
目前临床使用的全自动生化分析仪一般采用2种吸取试剂方式：一种为吸量方式，一种为分注方式。在试剂吸量方式中，试剂针在几秒钟的时间内从针前端吸一定量的试剂注入反应杯，然后对针进行清洗，继而进行下一次吸取，这种方式试剂针每次与试剂接触的时间很短，清洗频繁。在分注方式中，仪器软管长期插入试剂瓶，从软管的另一端吐出试剂至反应杯，整个管路需要与试剂长期接触，除非进行仪器维护，日常反应过程中并不对管路进行清洗。


技术实现要素：

[0009]
发明人在将市面上常见的肌酸激酶检测试剂盒与分注方式的生化分析仪配套使用时，由于软管长期插入试剂瓶中，管路要与试剂长期接触，经常会在管路内外壁和压重块上形成结晶，晶块随着试剂流路进入仪器内部，影响正常检测，或造成管路堵塞，导致仪器受损。试剂在管道中结晶的现象在配方组分越多越复杂的试剂中越明显。在吸量方式的全自动生化分析仪上可以使用的肌酸激酶试剂盒，应用在分注方式的仪器上时，最短1周左右即会出现结晶。
[0010]
结晶的出现非常影响检测结果，而临床科室在日常工作中，从收到样本到发出报告要求的时间很短，如果仪器出现结晶问题，则不得不拆卸模块进行手工疏通、清洁，一般需要1-2天的时间才能恢复正常使用。因此，需要提供一种新的、可配套分注方式生化分析仪、具有抗结晶性能的肌酸激酶检测试剂盒以解决上述问题。
[0011]
为了解决现有肌酸激酶检测试剂盒会存在堵塞生化分析仪管路的问题，本发明的目的是提供一种肌酸激酶活性检测试剂盒及其制备方法。
[0012]
本发明提供的制备方法可以稳定获得一种既具有抗结晶性能，其他性能也优异(稳定性强、精密度高、准确度好)的肌酸激酶活性检测试剂盒，所述试剂盒可以同时适配试剂吸量方式和试剂分注方式的全自动生化分析仪，适合临床应用推广。
[0013]
为了实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
[0014]
本发明的第一方面提供一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，所述试剂r1与所述试剂r2中含抗结晶组分，以体积百分数计，所述抗结晶组分的含量为2
‰‑5‰
；所述抗结晶组分为吐温-20、吐温-60、吐温-80、曲拉通x-100、曲拉通x-450、span20、span80中的一种或几种；
[0015]
优选地，所述抗结晶组分为曲拉通x-450、曲拉通x-100、span-20或吐温-20。
[0016]
肌酸激酶试剂盒中组分极多，试剂中要添加每一步所应所需的底物和酶。酶不稳定，极易失活，试剂中应配备酶的保护成分。大部分肌酸激酶在血液中以非活性形式存在，试剂中需添加酶的激活剂，通常为镁离子以及含巯基的化合物，如n-乙酰半胱氨酸、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽等，但此类化合物溶液稳定性差，试剂需具备适宜ph的缓冲体系，形成还原型缓冲液。此外，血液中含中内源性腺苷酸激酶(ak)，可以催化adp生atp，导致肌酸激酶的检测结果升高，在试剂中需要加入一磷酸腺苷和五磷酸二腺苷，来抑制反应体系中的ak干扰。
[0017]
在长期检测工作中，发明人发现，检测试剂盒各组分之间易发生同离子效应，即在两种或两种以上离子化合物溶质中含有同一种相同离子，会互相影响，易导致晶体析出；或盐析效应，即多种弱电解质、难容电解质或非电解质加入同一溶液中，能改变溶液的活度系数从而改变溶质的溶解度，溶解度降低时可能导致晶体析出。这些原因使得管路内外壁和压重块上形成结晶。
[0018]
为了获得具备抗结晶性能且稳定性强、精密度高、准确度好的肌酸激酶检测试剂盒，本发明的产品在组分选择上在保障试剂性能优良的情况下最大程度避免了同离子效应和盐析效应发生的可能，同时添加了抗结晶组分，使溶液中其他组分更为稳定。
[0019]
在抗结晶组分的选择过程中，考虑了表面活性剂，主要基于两点原因：一是由于表面活性剂分子中不同部分，分别对于两相亲和，分子排列在两相之间，使两相的表面相当于转入分子内部，从而降低了试剂表面张力和表面自由能。二是表面活性剂在水中形成胶束后，胶束提供了从非极性到极性全过渡的微环境，对各类物质均有不同程度的增溶作用。胶束内部为非极性或极性较小的区域，这使得原本不溶或微溶于水的有机化合物的溶解度显著增大，具有增溶作用。
[0020]
然而，当表面活性剂与试剂中的酶以及生物样本中的肌酸激酶混合后，表面活性剂有可能影响酶的分子结构，进而对酶在反应环境下的催化活性和活性的动力学稳定性产生影响。离子型表面活性剂由于其静电及疏水的协同作用，其带电基团与酶分子之间强烈
作用，使酶活性被抑制、激活或使其构象发生变化而失活。非离子表面活性剂与酶分子之间仅存在氢键和疏水作用，抑制性较弱。并且即使是同类别的不同表面活性剂仍有差别。不同类型的表面活性剂对酶活性的影响各不相同，同种表面活性剂对不同种类酶的影响也不相同。这种影响与具体的酶分子结构有关，也与环境条件相关，表面活性剂与酶的相互作用也非常复杂，机理解释尚不统一，未形成系统理论。
[0021]
由此可见，合适的表面活性剂对底物而言，是抗结晶剂、增溶剂；对酶而言，又可能是“激活剂”、“抑制剂”或“变性剂”。通过添加表面活性剂使试剂具备抗结晶性能，同时使溶液中包括酶在内的其他组分更为稳定，关键在于找到合适的表面活性剂。
[0022]
发明人在不断尝试中，发现向试剂r1和试剂r2加入2
‰‑5‰
的抗结晶组分，可以有效阻止结晶的生成，所述抗结晶组分可为吐温-20、吐温-60、吐温-80、曲拉通x-100、曲拉通x-450、span20、span80中的一种或几种。
[0023]
本发明所提供的肌酸激酶检测试剂盒，在所述试剂r1中，以体积百分数计，还加入了1-5％甘露醇、1-5％海藻糖、1-5％甘氨酸、1-5％牛血清白蛋白或1-5％aes中的一种或多种。
[0024]
甘露醇、海藻糖、甘氨酸、牛血清白蛋白或aes是有效的酶保护剂，但考虑到减少肌酸激酶检测试剂盒的组分，市面上一些试剂盒中并不添加酶保护剂，在本发明中，由于存在抗结晶组分，可在大分子酶保护剂成分存在时，仍有效防止检测试剂中结晶的生成。
[0025]
本发明所提供的肌酸激酶检测试剂盒中，所述试剂r1中还含生物缓冲液、络合物、酶激活剂。具体地，所述生物缓冲液为咪唑缓冲液、tris盐酸缓冲液或good’s生物缓冲液中的一种；所述络合物为edta钠盐或edta钾盐；所述酶激活剂为硫酸镁、醋酸镁或氯化镁中的一种。
[0026]
为了获得具备抗结晶性能且稳定性强、精密度高、准确度好的肌酸激酶检测试剂盒，本发明提供的肌酸激酶检测试剂盒中的组分，在保障试剂其他性能的情况下最大程度避免了同离子效应和盐析效应发生的可能，同时添加了抗结晶组分，使溶液中其他组分被包藏或吸附，增大溶解量。
[0027]
本发明所提供的肌酸激酶检测试剂盒中，所述试剂r1的成分浓度如下：10mm-250mm生物缓冲液、20mm-150mm还原剂、1％-5％酶保护剂、1mm-50mm离子络合物、2
‰‑5‰
抗结晶组分、6mm-50mm一磷酸腺苷、10μm-60μm五磷酸二腺苷、1mm-50mm二磷酸腺苷、1.5mm-20mm氧化型辅酶ii、1.6ku/l-3.2ku/l己糖激酶、0.9ku/l-1.9ku/l6-磷酸葡萄糖脱氢酶。
[0028]
试剂r1中各组分的作用为：
[0029]
(1)生物缓冲液：咪唑缓冲液、tris盐酸缓冲液或good’s生物缓冲液中的一种，为整体反应体系提供稳定的、适宜的ph环境；
[0030]
(2)酶保护剂：甘露醇、海藻糖、甘氨酸、牛血清白蛋白或复合酶稳定剂aes等中的一种或组合，作用为保护试剂中酶的催化效能；
[0031]
(3)络合物：edta钠盐或edta钾盐，可以螯合金属离子，减少对反应酶的影响，有利于试剂的准确性和稳定性；
[0032]
(4)防腐剂：n3防腐剂或proclin300防腐剂，用于防止溶液中微生物生长，有利于试剂的稳定保存；
[0033]
(5)激活剂：酶的激活剂，通常为镁离子，硫酸镁、醋酸镁、氯化镁等，可以激活肌酸
激酶；
[0034]
(6)还原剂：n-乙酰半胱氨酸、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽等，肌酸激酶的巯基很容易失活，要加入带巯基的物质激活；
[0035]
(7)抗结晶组分：吐温-20、吐温-60、吐温-80、曲拉通x-100、曲拉通x-450、span20、span80中的一种或几种；
[0036]
(8)抗干扰组分：一磷酸腺苷和五磷酸二腺苷，抑制反应体系中的ak干扰；
[0037]
(9)反应底物：
[0038]
二磷酸腺苷(adp)：二磷酸肌酸和adp在肌酸激酶的作用下生成肌酸和三磷酸腺苷(atp)；
[0039]
氧化型辅酶ii(nadp)：葡萄糖六磷酸和nadp在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pdh)的作用下生成6-磷酸-葡萄糖酸和还原型辅酶ii；
[0040]
酶：催化底物，启动生化反应，在本发明试剂盒中有hk、g6pdh。
[0041]
反应底物的作用是，试剂初始的组成成分，参与一系列生化反应，在酶的催化作用下形成产物。
[0042]
本发明所提供的肌酸激酶检测试剂盒中，试剂r2成分浓度如下：10mm-250mm生物缓冲液、20mm-60mm磷酸肌酸、5mm-25mm葡萄糖、2
‰‑5‰
抗结晶组分、1
‰‑5‰
防腐剂。
[0043]
具体地，试剂r2中各组分的作用为：
[0044]
生物缓冲液：capso缓冲液、amp缓冲液、ches缓冲液或caps缓冲液中的一种，为整体反应体系提供稳定的、适宜的ph环境；
[0045]
防腐剂：n3防腐剂或proclin300防腐剂，用于防止溶液中微生物生长，有利于试剂的稳定保存；
[0046]
抗结晶组分：吐温-20、吐温-60、吐温-80、曲拉通x-100、曲拉通x-450、span20、span80中的一种或几种；
[0047]
目前市售合成的表面活性剂有近6000种，广泛应用于乳化，分散，增溶，发泡，洗涤，柔软等各个方面。本发明中所述的抗结晶组分为在大量表面活性剂中经充分筛选、研究、实验所得到的。通过实验证实，除了本发明中提供的表面活性剂，其他大部分表面活性剂添加后会对试剂以及生物样本中的酶产生明显的抑制作用，降低试剂的灵敏度、准确度等性能指标，同时抗结晶效果不如本发明的效果。
[0048]
作为本发明的一个具体实施例，本发明提供的肌酸激酶检测试剂盒中，试剂r1成分及浓度如下：
[0049][0050]
作为本发明的一个具体实施例，本发明提供的肌酸激酶检测试剂盒中，试剂r2成分及浓度如下：
[0051][0052]
本发明第二方面提供，上述肌酸激酶检测试剂盒的制备方法。
[0053]
包括如下步骤：
[0054]
(1)制备试剂r1：向玻璃或不锈钢容器内加入制备总量60％-80％的去离子水；依次加入咪唑缓冲液、酶保护剂、络合物、防腐剂、激活剂、还原剂、抗结晶组分、抗干扰成分及各反应底物，最后加入酶；混合均匀后定容至所需总量，继续搅拌至混合均匀，即得试剂r1。
[0055]
(2)制备试剂r2：向玻璃或不锈钢容器内加入制备总量60％-80％的去离子水；依次加入生物缓冲液、防腐剂、抗结晶组分、磷酸肌酸、葡萄糖；混合均匀后定容至所需总量，继续搅拌至混合均匀，即得试剂r2。
[0056]
本发明的有益效果至少在于：
[0057]
(1)本发明所提供的肌酸激酶检测试剂盒，具有良好的抗结晶性能，可以同时适配试剂吸量方式和试剂分注方式的全自动生化分析仪，适合临床应用推广。
[0058]
(2)本发明所提供的试剂盒中，其相应组分随着时间的推移表现稳定，没有显著的
变化，酶的保护剂对于反应体系中的酶、还原剂对于巯基起到持续的保护作用。
[0059]
(3)本发明所提供的试剂盒重复性良好，在20天内连续检测样本的室内精密度情况良好，测值稳定可靠。
[0060]
(4)本发明所提供的试剂盒具有良好的准确度，配套市售肌酸激酶校准品定标后检测准确度验证物质，测值准确可靠。
具体实施方式
[0061]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0062]
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0063]
实施例1
[0064]
本实施例提供一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒。本实施例中r1所用抗结晶组分为2
‰
的曲拉通x-450；r2所用抗结晶组分为2
‰
的曲拉通x-450。
[0065]
试剂r1由以下配比的成分组成：
[0066][0067]
试剂r2由以下配比的成分组成：
[0068]
[0069][0070]
本实施例中，试剂盒的制备步骤如下：
[0071]
(1)制备试剂r1：向玻璃或不锈钢容器内加入制备总量60％-80％的去离子水；依次加入生物缓冲液、酶保护剂、络合物、防腐剂、激活剂、还原剂、抗结晶组分、抗干扰成分及各反应底物，最后加入酶；混合均匀后定容至所需总量，继续搅拌至混合均匀，即得试剂r1。
[0072]
(2)制备试剂r2：向玻璃或不锈钢容器内加入制备总量60％-80％的去离子水；依次加入capso缓冲液、防腐剂、抗结晶组分、磷酸肌酸、葡萄糖；混合均匀后定容至所需总量，继续搅拌至混合均匀，即得试剂r2。
[0073]
实施例2
[0074]
本实施例提供一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒的配方。本实施例中r1所用抗结晶组分为2.5
‰
的吐温20；r2所用抗结晶组分为2.5
‰
的曲拉通x-100。
[0075]
试剂r1由以下配比的成分组成：
[0076][0077][0078]
试剂r2由以下配比的成分组成：
[0079][0080]
实施例3
[0081]
本实施例提供一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒的配方。本实施例中r1所用抗结晶组分为5
‰
的吐温20；r2所用抗结晶组分为5
‰
的span-20。
[0082]
试剂r1由以下配比的成分组成：
[0083][0084]
试剂r2由以下配比的成分组成：
[0085][0086]
对比例1
[0087]
本实施例提供一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒的配方。试剂r1由如下成分组成：
[0088][0089]
试剂r2由如下成分组成：
[0090][0091]
对比例2
[0092]
本实施例提供一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒的配方。试剂r1由如下成分组成：
[0093][0094]
试剂r2由如下成分组成：
[0095][0096]
对比例3
[0097]
本实施例提供一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒的配方。试剂r1由以下配比的成分组成：
[0098][0099]
试剂r2由如下成分组成：
[0100][0101]
实验例1产品性能测试
[0102]
对实施例1-3和对比例1-3的试剂性能进行了测试。
[0103]
(1)试剂出现结晶的时间
[0104]
测试方法为：同时置于hitachi 7600-p模块(试剂吸量方式)和d模块(试剂分注方式)仪器中每日进行肌酸激酶活性的样本检测，观察试剂是否出现结晶及出现的时间。
[0105]
测试结果显示：hitachi 7600-p模块(吸量式)60天内，实验例与对比例所提供的试剂均无结晶出现；实施例1-3在hitachi7600-d模块(分注式)60天内无结晶出现；对比例1
所述组分制备的试剂在第15天开始出现结晶；对比例2所述组分制备的试剂在第25天出现结晶，结果如表1所示。
[0106]
表1 hitachi 7600-d模块结晶情况
[0107]
天数实施例1-3对比例1对比例2对比例35d无结晶无结晶无结晶无结晶10d无结晶无结晶无结晶无结晶15d无结晶有结晶无结晶无结晶20d无结晶有结晶无结晶无结晶25d无结晶有结晶有结晶有结晶35d无结晶有结晶有结晶有结晶45d无结晶有结晶有结晶有结晶60d无结晶有结晶有结晶有结晶
[0108]
(2)试剂准确度
[0109]
测试方法为：实施例1-3与对比例1-3采用同一校准物同时定标同时测试国家标准物质gbw(e)090593，计算测值与国家标准物质靶值的偏差情况。
[0110]
测试结果显示，实施例1-3测试国家标准物质相对偏差不超过
±
1％，准确度良好；对比例1测试国家标准物质相对偏差不超过
±
1％，准确度良好；对比例2-3测试国家标准物质相对偏差超过-90％以上，准确度极差，结果见表2。
[0111]
表2实施例1-3与对比例1-3的试剂准确度情况
[0112][0113][0114]
(3)试剂稳定性
[0115]
测试方法为：实施例1-3与对比例1-3放置于同一2℃-8℃环境下，每隔一段时间检测质控品，计算测值与初测值的偏差，观察试剂存放过程中的稳定性情况。
[0116]
测试结果显示，实施例1-3放置15个月内稳定性较初测值相对偏差不超过
±
3％，稳定性良好；对比例1放置12个月时较初测值相对偏差已超过5％，稳定性较差；对比例2-3放置15个月内稳定性较实施例稍差，整体稳定性较好较对比例1较好，结果见表3。
[0117]
表3实施例1-3与对比例1-3的稳定性情况
[0118][0119]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒，包括试剂r1和试剂r2，其特征在于，所述试剂r1与所述试剂r2中含有抗结晶组分，以体积百分数计，所述抗结晶组分的含量为2
‰‑5‰
；所述抗结晶组分为吐温-20、吐温-60、吐温-80、曲拉通x-100、曲拉通x-450、span20、span80中的一种或几种。2.根据权利要求1所述肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂r1中，以体积百分数计，还包括1-5％甘露醇、1-5％海藻糖、1-5％甘氨酸、1-5％牛血清白蛋白或1-5％aes中的一种或多种。3.根据权利要求2所述肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂r1中还含生物缓冲液、络合物、酶激活剂。4.根据权利要求3所述肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述生物缓冲液为咪唑缓冲液、tris盐酸缓冲液或good’s生物缓冲液中的一种；所述络合物为edta钠盐或edta钾盐；所述酶激活剂为硫酸镁、醋酸镁或氯化镁中的一种。5.根据权利要求4所述肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂r1成分浓度如下：10mm-250mm生物缓冲液、20mm-150mm还原剂、1％-5％酶保护剂、1mm-50mm离子络合物、2
‰‑5‰
抗结晶组分、6mm-50mm一磷酸腺苷、10μm-60μm五磷酸二腺苷、1mm-50mm二磷酸腺苷、1.5mm-20mm氧化型辅酶ⅱ、1.6ku/l-3.2ku/l己糖激酶、0.9ku/l-1.9ku/l6-磷酸葡萄糖脱氢酶。6.根据权利要求1-5任一项所述肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂r2成分浓度如下：10mm-250mm生物缓冲液、20mm-60mm磷酸肌酸、5mm-25mm葡萄糖、2
‰‑5‰
抗结晶组分、1
‰‑5‰
防腐剂。7.根据权利要求6所述肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂r1成分及浓度如下：
8.根据权利要求7所述的肌酸激酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂r2成分及浓度如下：9.一种肌酸激酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括：制备试剂r1：向容器内加入去离子水；依次加入生物缓冲液、酶保护剂、络合物、防腐剂、激活剂、还原剂、抗结晶组分、抗干扰成分及各反应底物，最后加入酶；混合均匀后定容至所需总量，继续搅拌至混合均匀，即得试剂r1；制备试剂r2：向玻璃或不锈钢容器内加入去离子水；依次加入生物缓冲液、防腐剂、抗结晶组分、磷酸肌酸、葡萄糖；混合均匀后定容至所需总量，继续搅拌至混合均匀，即得试剂r2。10.根据权利要求9所述制备方法，其特征在于，所述试剂r1或所述试剂r2中，所述去离子水的含量为试剂制备总量的60-80％。

技术总结
本发明涉及一种抗结晶的肌酸激酶检测试剂盒及其制备方法。本发明所述肌酸激酶检测试剂盒包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1与所述试剂R2中含有抗结晶组分，以体积百分数计，所述抗结晶组分的含量为2


技术研发人员：金玲
受保护的技术使用者：中生北控生物科技股份有限公司
技术研发日：2021.11.12
技术公布日：2022/3/8