一种高果糖饲料诱导心衰模型的构建方法与应用与流程

1.本发明涉及动物模型构建技术领域，具体地说，涉及一种高果糖饲料诱导心衰模型的构建方法与应用。


背景技术：

2.由于受到医学伦理的限制，直接在人体上进行研究，受到很大限制，所以迫切需要建立心力衰竭的动物模型。建立与该病的病理生理以及血流动力学改变相似的动物模型是深入研究该病的基础。
3.根据文献报道心衰动物模型大体分为以下几种:(1)心室快速起搏致心衰模型；(2)心肌缺血/梗塞致心衰模型；(3)压力超负荷型心衰模型；(4)容量超负荷型心衰模型；(5)药物性心衰模型；(6)转基因心衰模型。现有的这几种心衰模型主要通过外科手术或药物诱导等手段造模，而且所用的实验动物大多数为大鼠/小鼠、犬、猪等。首先，以上这几种实验动物与人的同源性相对灵长类较低；其次，现实生活中心衰是一个复杂的病理性过程，多因素参与，通过上述常规方法构建得到的模型对于现有常见人心衰疾病发生发展过程仍有一定区别。
4.因此，仍有必要研究一种更加接近于人的心衰疾病发生发展过程的模型。
5.本发明以灵长类动物类似人饮食的方法诱导食蟹猴心衰模型，更接近于人的心衰疾病发生发展过程，有助于人们更好的研究心衰疾病发生发展机制。


技术实现要素：

6.针对现有技术的问题，本发明的目的在于提供一种与人的心衰疾病发生发展过程更加接近，且构建方法简单，成功率高，模型持续时间长的心衰模型的构建方法。
7.为了实现该目的，本发明的技术方案如下：
8.一种高果糖饲料诱导心衰模型的构建方法，其通过向非人灵长类动物饲喂特殊饲料的方式进行构建，所述饲料中按质量比包含14～16％的猪油和19～21％的果糖。
9.优选，所述饲料中按质量比包含15％的猪油和20％的果糖。
10.非人灵长类实验动物是人类的近亲，与人类的遗传物质相似性约为75％-98.5％。利用其建立心衰模型，其疾病发展过程、临床症状、发病机制具有与人类高度相似性的基础。本发明根据目前常见的人心衰疾病成因和特征，以非人灵长类动物作为对象，进行了模型构建。其中，特别发现，通过果糖和猪油的特定配合对动物进行饲喂可构建理想的人类心衰疾病模型。如将果糖替换为传统的蔗糖，则成模时间一般在1年以上，1年时的成模率小于5％。
11.具体通过检测心脏功能指标和血脂变化情况，对其心脏功能指标和血脂变化趋势进行分析，进行心衰模型筛选，为人类心衰疾病的研究提供理想的动物模型。其成功率高，与人类心衰疾病高度相似，模型持续时间长，能够提供较好的给药窗口期。该模型可用于心力衰竭的病因学，病理学和药理学，以及在对人类心衰发病机制的研究、新药开发研究中具
有极高的应用价值。
12.本发明中，所述饲料中还包含其他饲料组分，所述其他饲料组分按重量份包括玉米粉48-52份、豆粕含量为30-32份、鱼粉2-3份、复合维生素0.5-1份、沸石粉2-3份、矿物质9-11份、蛋氨酸0.2-0.4份。
13.矿物质的组成为富马酸亚铁4.3％、硫酸锰1.57％、益环铜2％、益环锌4％、碘酸钙1％、有机硒3％、有机铬2％、维生素c 3.2％、赖氨酸5％、沸石粉73.93％。
14.本发明中，所述饲喂方式为：上午、下午各投喂所述饲料一次；中午投喂水果。
15.本发明中，每日投喂三次，上午在8：30～9:00点进行投喂，下午在16:00～16:30点进行投喂，中午在13:00～13:30点进行投喂。
16.该投喂方式兼顾了模型构建的速度和持续时间，既能保证高效的模型产出，又能提供较好的给药窗口期，有利于模型的应用。
17.本发明中，每次按照10-15g/(kg.bw)投喂所述饲料。
18.本发明中，按照10-15g/(kg.bw)投喂水果。
19.本发明中，所述水果为苹果。
20.本发明中，非人灵长类动物的饲养温度为18-29℃，湿度为30％-70％，按12小时进行昼夜交替循环。
21.本发明方法中，分别在饲喂上述饲料期结束后，麻醉所述非人灵长类动物，收集空腹血液进行血脂指标检测和心脏b超扫描以判断成模结果。优选，当所述血脂指标满足tc＞6.2mmol/l、hdl＜0.9mmol/l、ldl＞3.1mmol/l、tg＞1.7mmol/l中的2-3个时，则进一步判断射血分数，当射血分数低于60％时，则初步判断建模成功，之后若心脏检测结果满足edv＜10.2ml、esv＜2.1ml、sv＜7.5ml中的1-2个时，则最终判断建模成功。
22.本发明中，所述非人灵长类动物为食蟹猴。
23.本发明还提供一种上述构建方法在药物筛选中的应用。
24.本发明的有益效果至少在于：
25.1、本发明通过高脂高果糖饲料饲喂非人灵长类动物，操作简单，不需要手术或转基因等专业技术操作。
26.2、模型动物与人的同源性很高，疾病的发展和病因与人类疾病高度相似。
27.3、筛选和判定方法简单易掌握。只需要采血检测血脂变化和用超声心电图扫描分析心功能。
28.4、本发明制作模型过程无创，对动物伤害小，符合国际国内动物福利原则。
29.5、传统的高脂高糖(蔗糖)饲料成模时间一般在1年以上，1年时的成模率小于5％，而本发明的饲料成模时间可为6个月，大大提高了造模效率。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
31.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
32.实施例1
33.本实施例提供一种本发明的心衰模型构建方法。具体如下：
34.1材料与方法
35.1.1材料
36.1.1.1实验动物
37.成年健康食蟹猴雄性237只，体重7～16kg。其中饲喂正常饲料组25只，饲喂高脂高果糖饲料6个月组118只，饲喂高脂高果糖饲料12个月组94只。
38.1.1.2实验饲料
39.正常饲料和高脂高果糖饲料均由昆明亚灵生物科技有限公司提供，正常饲料按重量份包括：玉米粉50份、豆粕含量为31份、鱼粉2.5份、复合维生素0.6份、沸石粉2.5份、矿物质10份、蛋氨酸0.3份。复合维生素为生长育肥猪用维生素预混合饲料m202，由帝斯曼维生素(上海)有限公司生产；矿物质的组成为富马酸亚铁4.3％、硫酸锰1.57％、益环铜2％、益环锌4％、碘酸钙1％、有机硒3％、有机铬2％、维生素c 3.2％、赖氨酸5％、沸石粉73.93％。
40.高脂高果糖饲料按质量百分比包括65％上述正常饲料、15％猪油和20％果糖。
41.1.1.3主要试剂及仪器设备
42.血清总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)、甘油三脂(tg)检测试剂盒由罗氏诊断产品(上海)有限公司提供。使用罗氏全自动生化分析仪(c 501)检测血清样品。射血分数(ef)、心率(hr)、舒张末期容量(edv)和收缩末期容量(esv)、心脏每分钟搏出量(sv)，使用迈瑞(mandray)m9cv超声心电图机扫描分析。
43.1.2方法
44.1.2.1将食蟹猴饲养于室内85cm
×
85cm
×
100cm的不锈钢单笼内，室温保持在18-29℃，湿度保持在30％-70％。饲喂方法：上午8:30～9:00点、下午16:00～16:30点按照每餐12g/(kg.bw)投喂高脂高果糖饲料，中午13:00～13:30点按照15g/(kg.bw)投喂苹果，自由饮水，每天12小时的昼夜循环。
45.1.2.2随机挑选饲喂正常饲料的25只健康动物作为对照组，实验组分别饲喂6个月和12个月高脂高果糖饲料。并禁食12小时后用盐酸氯胺酮10mg/kg肌肉注射麻醉，收集空腹血清和心脏b超扫描。
46.2结果
47.2.1实验组和对照组血脂指标中tc和ldl存在差异极显著(p＜0.01)，在实验组间饲喂高脂高果糖饲料6个月和12个月同样存在差异极显著及差异。hdl在对照组和实验组间存在差异(p＜0.05)，同样在实验组(6个月和12个月组)间也存在差异(p＜0.05)。具体结果参见表1。
48.表1实验组与对照组血脂指标监测结果
49.[0050][0051]
2.2心超指标各项结果表明，射血分数(ef)和心率(hr)在对照组和实验组间存在差异显著(p＜0.05)，舒张末期容量、收缩末期容量和心脏每分钟搏出量(sv)在对照组和实验组间存在差异极显著(p＜0.01)，说明饲喂高脂高果糖饲料时间越长心腔的容积越小，心脏每分钟搏出量也越小。具体结果参见表2。
[0052]
表2实验组与对照组心脏b超指标监测结果
[0053][0054]
2.3成模判断与统计
[0055]
首先根据血液数据进行初步筛选：血清总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白(hdl)、低密度脂蛋白(ldl)、甘油三脂(tg)分别为tc＞6.2mmol/l、hdl＜0.9mmol/l、ldl＞3.1mmol/l、tg＞1.7mmol/l时，容易导致冠心病、心肌梗塞、动物粥样硬化、慢性心功能不全的发生。当上述参数中有2-3个达到上述易犯病参数指标时，则对实验动物的心脏参数进行进一步考察。
[0056]
若射血分数(ef)＜60％则初步判断建模成功。
[0057]
接着，通过舒张末期容量(edv)和收缩末期容量(esv)、心脏每分钟搏出量(sv)的指标进行进一步验证。验证标准为edv＜10.2ml、esv＜2.1ml、sv＜7.5ml。若这3个条件中有1-2个符合，则最终判断建模成功。
[0058]
根据上述标准，最终对照组中有1只成模，占比4％，实验组中诱导6个月后成模14只，占比11.86％，诱导12个月后成模12只，占比12.77％。具体结果见表3。
[0059]
表3实验组与对照组成模数量及比例
[0060][0061]
2.4数据统计分析
[0062]
上述表1和表2中的数据用spss17.0统计软件进行方差分析，
[0063]
数值以表示，以p《0.05，表示差异显著，p《0.01为差异极显著。组内(6个月和12个月组)比较：
▲
代表p》0.01且p《0.05，表示差异显著,
▲▲
代表p《0.01，表示差异极显
著；组间比较：*代表p》0.01且p《0.05，表示差异显著,**代表p《0.01，表示差异极显著。
[0064]
3结论
[0065]
3.1高脂高果糖饮食可以用于心衰模型的诱导，加速心衰的形成，提高心衰模型的成模率。
[0066]
3.2饲喂高脂高果糖饲料时间越长，心腔的容积越小，心脏每分钟搏出量、射血分数、心率、舒张末期血容量、收缩末期血容量逐渐下降，动物的心功能随之下降。6个月饲喂组已满足模型构建需要。
[0067]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种心衰模型的构建方法，其特征在于，通过向非人灵长类动物饲喂饲料的方式进行构建，所述饲料中按质量比包含14～16％的猪油和19～21％的果糖。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述饲料中按质量比包含15％的猪油和20％的果糖。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述饲料中还包含其他饲料组分，所述其他饲料组分按重量份包括玉米粉48-52份、豆粕含量为30-32份、鱼粉2-3份、复合维生素0.5-1份、沸石粉2-3份、矿物质9-11份、蛋氨酸0.2-0.4份。4.根据权利要求1-3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述饲喂方式为：上午、下午各投喂所述饲料一次；中午投喂水果。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，每次按照10-15g/(kg.bw)投喂所述饲料。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，按照10-15g/(kg.bw)投喂水果。7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述水果为苹果。8.根据权利要求1-7任一项所述的构建方法，其特征在于，非人灵长类动物的饲养温度为18-29℃，湿度为30％-70％，按12小时进行昼夜交替循环；和/或，分别在饲喂饲料期结束后，麻醉所述非人灵长类动物，收集空腹血液进行血脂指标检测和心脏b超扫描以判断成模结果；当所述血脂指标满足tc＞6.2mmol/l、hdl＜0.9mmol/l、ldl＞3.1mmol/l、tg＞1.7mmol/l中的2-3个时，则进一步判断射血分数，当射血分数低于60％时，则初步判断建模成功，之后若心脏检测结果满足edv＜10.2ml、esv＜2.1ml、sv＜7.5ml中的1-2个时，则最终判断建模成功。9.根据权利要求1-8任一项所述的构建方法，其特征在于，所述非人灵长类动物为食蟹猴。10.权利要求1-9任一项所述的构建方法在药物筛选中的应用。

技术总结
本发明涉及动物模型构建技术领域，具体公开了一种高果糖饲料诱导心衰模型的构建方法与应用。本发明的心衰模型的构建方法，通过向非人灵长类动物饲喂饲料的方式进行构建，所述饲料中按质量比包含14～16％的猪油和19～21％的果糖。该模型构建方法操作简单，不需要手术或转基因等专业技术操作，成功率高，模型持续时间长，获得的模型与人类心衰疾病高度相似，在心力衰竭的病因学，病理学和药理学，以及在对人类心衰发病机制的研究、新药开发研究中具有极高的应用价值。具有极高的应用价值。


技术研发人员：李锋 张龙 李绍东 朱正华 罗萨里奥
受保护的技术使用者：昆明科灵生物科技有限公司
技术研发日：2021.11.12
技术公布日：2022/3/8