一种促进人外周血单核细胞糖基化的糖类衍生物及其应用

1.本发明属于免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种促进人外周血单核细胞糖基化的糖类衍生物及其应用。


背景技术：

2.人外周血单核细胞pbmc(peripheral blood mononuclear cell)，即人的血液中具有单个核的细胞，因含有单核细胞(monocytes)、巨噬细胞(macrophage)、淋巴t细胞、淋巴b细胞、自然杀伤细胞nk(natural killer cell)与树突状细胞dc(dendritic cell)等免疫细胞，故被应用于临床的肿瘤免疫细胞治疗。
3.传统的pbmc免疫疗法，即将pbmc从血液分离后，进行体外刺激与扩增培养，再给与临床回输治疗。这个过程操作复杂、费时费力，且驯化后的pbmc免疫活性低，临床治疗效果不显著。


技术实现要素：

4.本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种促进人外周血单核细胞糖基化的糖类衍生物及其应用。
5.本发明的技术方案之一如下：
6.一种促进人外周血单核细胞糖基化的糖类衍生物，
7.其结构式为
8.本发明的技术方案之二如下：
9.上述糖类衍生物在制备肿瘤免疫细胞治疗组合物中的应用。
10.本发明的技术方案之三如下：
11.上述糖类衍生物在制备促进人外周血单核细胞糖基化组合物中的应用。
12.本发明的技术方案之四如下：
13.一种肿瘤免疫细胞治疗组合物，其有效成分包括上述糖类衍生物。
14.在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述糖类衍生物。
15.在本发明的一个优选实施方案中，还包括药学上可接受的辅料。
16.本发明的技术方案之五如下：
17.一种促进人外周血单核细胞糖基化组合物，其有效成分包括上述糖类衍生物。
18.在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分为上述糖类衍生物。
19.在本发明的一个优选实施方案中，还包括药学上可接受的辅料。
20.本发明的技术方案之六如下：
21.上述糖类衍生物的制备方法，其合成路线如下：
[0022][0023]
本发明的有益效果是：本发明的糖类衍生物可促进人外周血单核细胞糖基化，并显著增强pbmc细胞杀伤肿瘤细胞毒活性。
附图说明
[0024]
图1为本发明实施例2中从健康人外周血分离获得的人外周血单核细胞质量控制结果图。
[0025]
图2为本发明实施例3中用浓度为1mm的糖类衍生物nactf处理pbmc细胞24h后，收集培养上清通过elisa实验检测ifn-γ的浓度对比图。
[0026]
图3为本发明实施例3中用浓度为1mm的糖类衍生物nactf处理pbmc细胞24h
[0027][0028]
后，收集培养上清通过elisa实验检测tnf-α的浓度对比图。
[0029]
图4为本发明实施例4中用浓度为1mm的糖类衍生物nactf处理pbmc细胞24h后，与靶细胞k562共孵育12h，通过ldh实验检测pbmc细胞对k562的杀伤活性对比图。
[0030]
图5为本发明实施例5中经过5ug/ml衣霉素预处理或正常培养3h的pbmc细胞再经过糖类衍生物nactf处理或正常培养24h后，与靶细胞k562共孵育12h，通过ldh实验检测pbmc细胞对k562的杀伤活性对比图。
具体实施方式
[0031]
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0032]
以下：
[0033]
实施例1
[0034]
本实施例制得的糖类衍生物的详细信息如下表所示：
[0035]
其具体合成路线如下：
[0036][0037]
具体包括如下步骤：
[0038]
1、将起始反应物，即化合物(1)(13g，60mmol)加入100ml反应瓶中，然后加入1.2equiv.叔丁基二甲基氯硅烷(tbscl)，在氮气保护下再加入20ml精制吡啶，在室温条件下反应过夜。使用tlc检测原料点消失。所得混合物使用二氯甲烷稀释后，使用水、饱和氯化钠溶液洗涤有机相，之后用无水硫酸镁干燥，过滤除去固体后浓缩，以乙酸乙酯/石油醚(v/v 1:1)为洗脱剂柱层析得到化合物(2)(15g，45.6mmol)，收率76％。
[0039]
2、取无水乙酸钠(4g)置入250ml反应瓶中，然后加入50ml乙酸酐，在剧烈搅拌条件下加热到120℃，并持续搅拌30分钟之后，缓慢分批次加入化合物(2)(20g，60mmol)粉末。继续加热2-3h，使用tlc检测原料点消失，显示反应完成。体系中加入饱和碳酸氢钠溶液进行淬灭。使用二氯甲烷萃取获得有机相，依次使用水、饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠清洗有机相，得到的有机相使用无水硫酸钠干燥，抽滤除去固体后浓缩，以石油醚/二氯甲烷(2:1)作为洗脱剂得到化合物(3)(22.5g，49mmol)，产率82％。
[0040]
3、取化合物(3)(23g，50mmol)，加入到100ml 80％的醋酸溶液，在43℃反应2h，使用tlc检测原料点消失。所得混合物用5％碳酸钠溶液洗涤，再用水洗涤，最后加入无水氯化钙，之后先进行常压蒸馏收集70～90℃馏分，将常压馏分再进行减压蒸馏，收集110～113℃/912pa馏分，得到化合物(4)(12g，34.5mmol)，产率为69％。
[0041]
4、将化合物(4)(12g，40mmol)加入到100ml二氯甲烷中，加入三乙胺(net3，8.34ml，60mmol)后，0℃条件下逐滴加入三光气(triphosgene，7.425g，25mmol)的二氯甲烷(125ml)溶液，25℃条件下搅拌反应20小时。tlc检测原料完全消失后，加入饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应。分离出有机相后，水相用二氯甲烷萃取4次，合并有机相，并用饱和食盐水洗
涤，无水硫酸钠干燥。减压浓缩后，以乙酸乙酯/石油醚(v/v 1:1)为洗脱剂柱层析得到化合物(5)(8.7g，21.2mmol)，产率53％。
[0042]
5、将化合物(5)(18.5g，40mmol)在加入到含碳酸氢钠的四氢呋喃中加入，再加入苯基氨基甲酸(8g，60mmol),在室温条件下反应45min，反应完全后将反应液旋去四氢呋喃溶剂，加入饱和饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后，以二氯甲烷/石油醚(1:1)为洗脱剂柱层析得到化合物(6)(9.3g，20mmol)，产率50％。
[0043]
6、将氢氧化钠(2.4g)加入到120ml甲醇溶液(甲醇/水，1:1)中，再加入化合物(6)(18.6g，40mmol)，在45℃搅拌反应2h，所得混合物加入纯甲醇洗涤，无水硫酸镁干燥，减压浓缩后，以氯仿/甲醇(3:2)为洗脱剂柱层析得到化合物(7)(9.8g，28.8mmol)，产率72％。
[0044]
实施例2
[0045]
人外周血单核细胞pbmc分离：
[0046]
利用肝素抗凝采血管采集健康人的血液共30ml，利用外周血ficoll分离液进行离心。具体如下：先将ficoll分离液加入15ml离心管中，用3ml巴氏吸管小心吸取血液滴加到分离液上方，进行第一次离心(600g，30min)；离心完毕，观察血液分层情况，中间白膜层即是目的细胞pbmc；小心吸取白膜层pbmc细胞，用countstar对细胞进行质量控制(结果如图1所示，br为明场，fl1、fl2均为荧光通道，此时未添加细胞染料，融合为明场与荧光通道叠加形成的图像)，最后用t75细胞培养瓶进行培养备用(培养体系：人外周血单核细胞完全培养基，procell，cm-h182-500)。
[0047]
实施例3
[0048]
收集实施例2分离扩增培养后的pbmc，用人外周血单核细胞完全培养基进行重悬，调整细胞密度为4
×
106/ml，分别加入到6孔板的2个孔中，每孔1ml。配制浓度为1mm的nactf(制备于实施例1)1ml及不含nactf的人外周血单核细胞完全培养基，将其加入到6孔板相应的培养孔中，充分混匀后，放入培养箱继续培养。24h后，收集相应孔中细胞液，200g离心5min，收集上清，按照试剂盒说明书，检测培养上清液中ifn-γ与tnf-α表达水平，结果分别如图2和图3所示，由图2可知经nactf诱导24h后，pbmc培养上清中ifn-γ的水平显著上升；由图3可知经nactf诱导24h后，pbmc培养上清中tnf-α的水平也显著上升。
[0049]
实施例4
[0050]
收集处于良好生长状态的k562细胞，用含10％fbs的rpmi-1640培养基调整细胞浓度为1
×
106/ml，台盼蓝染色存活率大于95％，接种0.5ml到相应的12孔板；分别收集生长状态良好并经过1mm实施例1制得的nactf刺激24h的pbmc细胞和对照细胞，用人外周血单核细胞完全培养基调整细胞浓度为5
×
106/ml，台盼蓝染色存活率大于95％，接种0.5ml到相应的12孔板，使得效靶比为5:1；由于效应细胞、靶细胞都会有自发性释放ldh的情况，培养基中也可能含有可使四唑盐转化为甲臜的物质，因此，除了上述不同效靶比的实验组，实验还设置多个对照组，分别为：
[0051]
对照组1：靶细胞最大释放ldh；
[0052]
对照组2：靶细胞自发释放ldh；
[0053]
对照组3：效应细胞自发释放ldh。
[0054]
最后，细胞毒性计算公式如下：
[0055]
％细胞毒性＝(实验孔ldh-效应细胞ldh-靶细胞ldh)/(靶细胞最大ldh-靶细胞自
发ldh)
[0056]
结果如图4所示，经nactf诱导刺激后，pbmc对k562的杀伤活性显著上升。
[0057]
实施例5
[0058]
收集处于良好生长状态的k562细胞，用含10％fbs的rpmi-1640培养基调整细胞浓度为1
×
106/ml，台盼蓝染色存活率大于95％，接种0.5ml到相应的12孔板；分别收集生长状态良好未经过处理培养24h的pbmc细胞、经过1mm实施例1制得的nactf刺激24h的pbmc细胞、经过5ug/ml衣霉素预处理3h再正常培养24h的pbmc细胞和经过5ug/ml衣霉素预处理3h再经过1mm糖类衍生物nactf刺激24h的pbmc细胞，用人外周血单核细胞完全培养基调整细胞浓度为5
×
106/ml，台盼蓝染色存活率大于95％，接种0.5ml到相应的12孔板，使得效靶比为5:1；由于效应细胞、靶细胞都会有自发性释放ldh的情况，培养基中也可能含有可使四唑盐转化为甲臜的物质，因此，除了上述不同效靶比的实验组，实验还需要设置多个对照组，分别为：
[0059]
对照组1：靶细胞最大释放ldh；
[0060]
对照组2：靶细胞自发释放ldh；
[0061]
对照组3：效应细胞自发释放ldh。
[0062]
最后，细胞毒性计算公式如下：
[0063]
％细胞毒性＝(实验孔ldh-效应细胞ldh-靶细胞ldh)/(靶细胞最大ldh-靶细胞自发ldh)
[0064]
结果如图5所示，由图5可知pbmc经nactf诱导后能够显著杀伤k562细胞，而经衣霉素(tun，tunicamycin)预处理后，其杀伤活性显著降低，且与对照组比无显著性差异，表明nactf促进pbmc细胞杀伤k562细胞毒活性与细胞糖基化相关。
[0065]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

技术特征：
1.一种促进人外周血单核细胞糖基化的糖类衍生物，其特征在于：其结构式为2.权利要求1所述糖类衍生物在制备肿瘤免疫细胞治疗组合物中的应用。3.权利要求1所述糖类衍生物在制备促进人外周血单核细胞糖基化组合物中的应用。4.一种肿瘤免疫细胞治疗组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述糖类衍生物。5.如权利要求4所述的一种肿瘤免疫细胞治疗组合物，其特征在于：其有效成分为权利要求1所述糖类衍生物。6.如权利要求4或5所述的一种肿瘤免疫细胞治疗组合物，其特征在于：还包括药学上可接受的辅料。7.一种促进人外周血单核细胞糖基化组合物，其特征在于：其有效成分包括权利要求1所述糖类衍生物。8.如权利要求6所述的一种促进人外周血单核细胞糖基化组合物，其特征在于：其有效成分为权利要求1所述糖类衍生物。9.如权利要求7或8所述的一种促进人外周血单核细胞糖基化组合物，其特征在于：还包括药学上可接受的辅料。10.权利要求1所述的糖类衍生物的制备方法，其特征在于：其合成路线如下：

技术总结
本发明公开了一种促进人外周血单核细胞糖基化的糖类衍生物及其应用，其结构式为本发明的糖类衍生物可促进人外周血单核细胞糖基化，并显著增强PBMC细胞杀伤肿瘤细胞毒活性。强PBMC细胞杀伤肿瘤细胞毒活性。强PBMC细胞杀伤肿瘤细胞毒活性。


技术研发人员：曾子晏 杨长明 郑炳义 王薛婷 曾晓玲 曾才英
受保护的技术使用者：厦门大学
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8