一种对牛肌肉中多种PPCPs的非靶标筛查方法与流程

一种对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法
技术领域
1.本发明涉及领域，特别是一种对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法。


背景技术：

2.食品安全与人类健康有着直接的关系，因此，该领域一直是科学研究的热点。随着消费者生活条件的提高，食品安全问题已经发展到了极其恶劣的程度，开发最新的科技手段来解决这些问题值得深入思考。
3.ppcps全称是pharmaceutical and personal care products，是一类新兴污染物，包括抗生素、人工合成麝香、止痛药、降压药、避孕药、催眠药、减肥药、发胶、染发剂和杀菌剂等。目前，现有的食品安全检测技术对于已知和预料之内的污染物相对成熟，而对于未知和预料之外的污染物则是不起作用的。随着现代化学工业的发展，出现了越来越多的合成化学品，而食品安全标准涵盖的化学品还不到1000种，这只是现有大量化学品的冰山一角。因此，未来的食品安全控制必须实施非靶标筛查技术和方法，以实现对未知和预料之外污染物的检测，正如2005年由欧盟委员会成立的norman网络系统(www.norman-network.net)所提出的，优先开发非靶标分析方法，用于快速识别不同基质中的未知和预料之外污染物。
4.非靶标筛查可从狭义和广义两个角度进行理解，前者是指依靠已建立的筛查数据库对污染物进行识别，虽然数据库中的化学物质是已知的，但基质中存在的化学物质仍是未知的，非靶标筛查的实用性取决于数据库的规模；后者是采用组学方法(如代谢组学、蛋白质组学等)筛查未知和预料之外的污染物，该方法可通过高分辨率质谱(hrms)等先进分析技术实现。理论上讲，通过正确选择色谱和质谱方法，可以对预处理过程中保留的所有污染物进行鉴定。实际上，食品基质复杂，存在的污染物数量多、种类杂，选取适当的样品前处理技术和质量控制过程、hrms参数设置和分析方法成为获得可靠的非靶标筛查结果的决定因素。在获得未知和预料之外污染物的色谱信息(如保留时间)以及hrms信息(精确分子质量和离子碎片)后，就可以对这些污染物进行识别，整个过程已被证明是非常繁琐和耗时的。如何优化分析技术和方法，简化工作流程，减少非靶标筛查的工作量，是今后值得考虑的重要问题。
5.目前，代谢组学分析方法在食品基质中某些污染物的非靶标筛查方面显示出优势。如tengstrand等建立了一种对橙汁中26种农药的非靶标筛查方法，目标物浓度为0.4～100μg g-1
。kunzelmann等通过代谢组学分析方法，考察了牛奶中19种农药在不同浓度下筛查结果，其中，100和400μg kg-1
浓度下可以筛查出所有19种农药，而在25和5μg kg-1
浓度下各只能筛查出17种和6种农药，说明农药浓度对非靶标筛查结果有显著影响。delaporte等提出，在添加浓度为10、50和100μg kg-1
时，基于代谢组学分析方法对茶叶中32种农药的筛查率可达到75％。inoue等采用代谢组学分析方法筛查出烟酸和烟碱作为评估婴儿配方奶粉降解的两个可能标志化合物。以上研究虽然取得了相对比较理想的结果，但提出的一些方法过于复杂，不利于推广。目前，基于非靶标代谢组学的分析仍然面临着许多巨大的挑
战。数据分析往往是代谢组学分析方法的瓶颈，通过获取高质量hrms数据和发展先进的数据处理工具可以改善这种不利情况。


技术实现要素：

6.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法，能够准确、快速、全面地筛查和识别动物源食品中潜在非靶标污染物。
7.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
8.一种对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法，包括以下步骤：
9.步骤一、选取多个ppcps标准品，对每个ppcps标准品配制浓度为1μg ml-1
的ppcps标准品的甲醇溶液；配制浓度为100ng ml-1
的环丙沙星-d8甲醇溶液；
10.步骤二、牛肌肉样品制备及前处理：
11.(a)将牛肌肉样品切成小块，用组织匀浆机将其打成肉糜；
12.(b)将2.0g、5.0g和10.0g肉糜分别加入到不同的50ml聚丙烯离心管中，然后再分别加入20μl、50μl和100μl的多种浓度为1μg ml-1
的ppcps标准品的甲醇溶液，每个样品中均加入0.5ml浓度为100ng ml-1
的环丙沙星-d8甲醇溶液；
13.(c)每个聚丙烯离心管中再加入8ml浓度为0.1mol l-1
的na2edta水溶液，涡旋30秒，继续加入8ml乙腈，搅拌1分钟，超声提取5分钟；
14.(d)每个聚丙烯离心管中再加入4g无水na2so4，涡旋5分钟，然后控制温度和离心速度分别为4℃和5000r min-1
下离心5分钟，将所有上清液加入quechers净化管，涡旋5分钟，在温度和离心速度分别为4℃和10000r min-1
下离心5分钟；
15.(e)将所有上清液经氮气吹至近干后，复溶于1ml 40％(v/v)甲醇-0.1％甲酸/水溶液，涡旋1min；
16.(f)经0.22μm滤膜过滤后，制得待分析样品，每个待分析样品平行9次，此时三组溶液理论浓度分别为20ng ml-1
、50ng ml-1
和100ng ml-1
；
17.(g)将3个浓度组，每组9个待分析样品，分别命名为20ng ml-1-1～20ng ml-1-9、50ng ml-1-1～50ng ml-1-9和100ng ml-1-1～100ng ml-1-9；每个待分析样品各抽取30μl混合得到质量控制qc样品；在每个浓度组样品检测之前和之后各进3次qc样品，共计12次，分别记为qc-1，qc-2，
……
，qc-12；
18.步骤三、采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱q exactive plus，配可加热电喷雾离子源esi分析每个待分析样品中的ppcps和环丙沙星-d8；
19.步骤四、使用trace finder 3.3软件对多个ppcps和环丙沙星-d8的lc-ms/ms输出结果进行分析，使用proteowizard软件将raw格式的lc-ms/ms输出文件转换为mzxml格式文件，然后上传到workflow4metabolomics即w4m平台，在w4m平台上进行峰检测、峰对齐和峰保留时间校准，并对峰强度进行归一化、中心化、尺度化和数据转换处理，获得横坐标和纵坐标分别为变量名称和样品名称的数据矩阵，并将qc组和3个浓度组中峰强度相对标准偏差》30％的无效变量删除；将数据矩阵导入simca 14.1软件中进行多变量分析，分别获得20ng ml-1
组和100ng ml-1
组的标志化合物，选择两组重叠的标志化合物进一步通过spss statistics v17.0软件进行单变量分析以验证标志化合物的有效性；最终，将获得的标志化合物与多个ppcps标准品的保留时间、精确分子量和加合物结构进行比较，确定标志化合
物为何种ppcps。
20.具体地，所述步骤三具体包括：
21.采用esi正模式，每次进样10μl，经accucore rp-ms液相色谱柱进行组分分离，流动相a为0.1％(v/v)甲酸-水溶液，流动相b为0.1％(v/v)甲酸-甲醇溶液，流速设定为0.3ml min-1
。分离梯度：5％b(2min)～30％b(7min)～90％b(25min)～5％b(16min)，柱温保持在40℃；q exactive plus参数设置如下：毛细管和加热温度均为320℃；鞘气和辅助气均为n2，流速分别为40arb和10arb；喷雾电压和透镜电压分别为3200v和50v；扫描方式：全扫描/数据依赖二级扫描full ms/dd-ms2；ms参数：全扫描分辨率70000，自动增益控制目标agc target 1
×
106，最大驻留时间100ms，m/z扫描范围100～1000；二级质谱参数设置：分辨率17500，agc target 2
×
105，最大驻留时间50ms；
22.使用trace finder 3.3软件对多个ppcps和环丙沙星-d8的lc-ms/ms输出结果进行分析，具体筛查条件如下：(a)一级母离子，响应强度阈值10000，信噪比5.0，质量误差5ppm；(b)对于二级碎片离子，最小离子匹配数1，响应强度阈值10000，质量误差5ppm；然后基于目标物一级母离子峰面积，采用标准曲线法测定环丙沙星-d8的回收率。
23.具体地，所述步骤二中多变量分析包括主成分分析pca和正交偏最小二乘判别分析opls-da；正交偏最小二乘判别分析opls-da时，用空白牛肉基质提取液配制100ng ml-1
、50ng ml-1
、25ng ml-1
、10ng ml-1
、5ng ml-1
环丙沙星-d8标准曲线溶液，然后计算3个浓度组中环丙沙星-d8的回收率；最后，将每个样品中环丙沙星-d8的回收率乘以一个校准系数后将其回收率校准为100％，同一个样品中的其他变量峰强度也乘以该校准系数作为校准后变量峰强度，再进行变量峰强度比较。
24.具体地，所述单变量分析具体为：采用成对t检验法对获得的标志化合物在3个浓度组样品数据矩阵中的峰强度值进行检验；利用变量峰强度倍数变化fold changes》2判定标志化合物对应变量在3个浓度组之间是否具有高对比度峰强度：每个变量在任意一个浓度组中共有9个平行测定的峰强度，取其中位数，三个浓度水平下可得到该变量的三个中位数，通过中位数最高值除以中位数最低值，获得该变量的fold change值。
25.与现有技术相比，本发明基于超高效液相色谱串联质谱(uhplc-ms/ms)输出结果，采用代谢组学分析方法将筛查非靶标污染物的过程转变为寻找标志化合物过程，有效提高非靶标筛查效率。
附图说明
26.图1为牛肌肉样品中标准添加的34种ppcps在w4m平台上的总离子流图。
27.图2为牛肌肉样品组pca得分图。
28.图3为牛肌肉样品组opls-da得分图。
29.图4为牛肌肉样品组s-plot图。
30.图5为牛肌肉样品组permutation图。
具体实施方式
31.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
32.本实施例中所用化学品和材料如下：
33.牛肌肉样品购自于大连本地市场。甲醇和乙腈(高效液相色谱纯，德国merck公司)；甲酸(高效液相色谱纯，中国上海安谱实验科技股份有限公司)；乙二胺四乙酸二钠(na2edta)和无水硫酸钠(na2so4)(中国国药化学试剂有限公司)；过滤膜(0.22μm，美国agilent公司)；quechers清洁套件(吸附剂:c18和psa，美国agilent公司)；超纯水(milli-q超纯水系统，德国merck公司)；环丙沙星-d8盐酸溶液(100μg ml-1
，甲醇相，美国first standard公司)。34个ppcps分别购自sigma(美国)、first standard(美国)、dr.ehrenstorfer(德国)和trc(加拿大)公司，纯度均大于98.3％。关于34种ppcps标准品的详细信息见表1。
34.表1
[0035][0036]
溶液配制
[0037]
每个ppcps的甲醇溶液(100μg ml-1
)进行单独配制，然后各取1ml进行混匀，用甲醇继续稀释成1μg ml-1
溶液。将100μg ml-1
环丙沙星-d8甲醇溶液用甲醇稀释后获得100ng ml-1
溶液。
[0038]
样品制备及前处理过程
[0039]
(a)将牛肉样品切成小块，用组织匀浆机将其打成肉糜；(b)将2.0、5.0和10.0g肉
糜分别加入到不同的50ml聚丙烯离心管中，然后再分别加入20、50和100μl的34种ppcps混合溶液(1μg ml-1
)。每个样品中均加入0.5ml环丙沙星-d8甲醇溶液(100ng ml-1
)用来控制样品前处理过程的回收率；(c)每个样品加入8ml na2edta水溶液(0.1mol l-1
)，涡旋30秒，继续加入8ml乙腈，搅拌1分钟，超声提取5分钟；(d)再加入4g无水na2so4，涡旋5分钟，然后控制温度和离心速度分别为4℃和5000r min-1
下离心5分钟，将所有上清液加入quechers净化管，涡旋5分钟，在温度和离心速度分别为4℃和10000r min-1
下离心5分钟；(e)将所有上清液经氮气吹扫装置(n-evap-112,美国organomation公司)吹至近干后，复溶于1ml 40％(v/v)甲醇-0.1％甲酸/水溶液，涡旋1min；(f)经0.22μm滤膜过滤后，制得样品。每个样品平行9次，此时三组溶液理论浓度分别为20、50和100ng ml-1
。
[0040]
样品分组和命名
[0041]
3个浓度组，每组9个样品，分别命名为20ng ml-1-1～20ng ml-1-9、50ng ml-1-1～50ng ml-1-9和100ng ml-1-1～100ng ml-1-9。每个净化后样品各抽取30μl混合得到质量控制(qc)样品。在每个浓度组样品检测之前和之后各进3次qc样品，共计12次，分别为qc-1,qc-2,
……
,qc-12，用于评价lc-ms/ms的稳定性。
[0042]
分析方法
[0043]
采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(q exactive plus，美国thermo公司)，配可加热电喷雾离子源(esi)分析34种ppcps和环丙沙星-d8。采用esi正模式。每次进样10μl，经accucore rp-ms液相色谱柱(100
×
2.1mm,2.6μm粒径，美国thermo fisher scientific公司)进行组分分离。流动相a为0.1％(v/v)甲酸-水溶液，流动相b为0.1％(v/v)甲酸-甲醇溶液。流速设定为0.3ml min-1
。分离梯度：5％b(2min)～30％b(7min)～90％b(25min)～5％b(16min)。柱温保持在40℃。q exactive plus参数设置如下：毛细管和加热温度均为320℃；鞘气和辅助气均为n2，流速分别为40和10arb；喷雾电压和透镜电压分别为3200和50v；扫描方式:全扫描/数据依赖二级扫描(full ms/dd-ms2)；ms参数：全扫描分辨率70000，自动增益控制目标(agc target)1
×
106，最大驻留时间(maximum it)100ms，m/z扫描范围100～1000；二级质谱参数设置：分辨率17500，agc target 2
×
105，最大驻留时间50ms。
[0044]
使用trace finder 3.3软件对34个ppcps和环丙沙星-d8的lc-ms/ms输出结果进行分析，具体筛查条件如下：(a)一级母离子，响应强度阈值10000，信噪比5.0，质量误差5ppm；(b)对于二级碎片离子，最小离子匹配数1，响应强度阈值10000，质量误差5ppm。基于目标物一级母离子峰面积，采用标准曲线法测定环丙沙星-d8的回收率。
[0045]
代谢组学数据处理
[0046]
使用proteowizard软件将raw格式的lc-ms/ms输出文件转换为mzxml格式文件，然后上传到workflow4metabolomics(w4m)平台(https://workflow4metabolomics.usegalaxy.fr/)进行下一步分析。在w4m平台上进行峰检测、峰对齐和峰保留时间校准，并对峰强度进行归一化、中心化、尺度化和数据转换处理，获得横坐标和纵坐标分别为变量名称和样品名称的数据矩阵。将数据矩阵导入simca 14.1软件中进行主成分分析(pca)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)等多变量统计分析。利用opls-da的permutation图来判断opls-da模型是否过拟合。s-plot图中变量置信度绝对值》0.9和变量投影重要性(vip)》1是筛查候选标志化合物的两个阈值。经筛查后，可以分别获得20和100ng ml-1
组的标志化合物，选择
两组重叠的标志化合物(代表它们在20和100ng ml-1
组中分别显著低于和显著高于其他组浓度)进一步通过spss statistics v17.0软件进行成对t检验和峰强度倍数变化(fold change)分析等单变量分析。最终，将获得的标志化合物与34个ppcps标准品的保留时间、精确分子量(误差绝对值小于5ppm)和加合物结构(表1)进行比较，确定标志化合物为何种ppcps。
[0047]
结果与讨论
[0048]
数据预处理
[0049]
从图1可以看到，在w4m平台上，34个ppcps在不同浓度样品中显示出具有明显可区分的峰强度，为每个浓度组样品寻找标志化合物提供了可能性。将qc组和3个浓度组中峰强度相对标准偏差》30％的无效变量删除，最终获得一个7072
×
39的数据矩阵进行下一步分析。
[0050]
多变量分析
[0051]
pca分析
[0052]
从图2可知，所有样品可信度均在95％置信区间内。12个qc样品紧密聚集，表明本实施例获得的数据质量高，可以用于进一步分析。三个浓度组在第一主成分上即可达到完全分离。每一个浓度组样品紧密聚集，说明9个样品平行性好，但每组样品均与其他两组样品分离明显(图2)，表明组间存在较大差异，为从每个浓度组寻找独特的标志化合物提供了可能。
[0053]
opls-da分析
[0054]
由于本研究设计了三个浓度水平(20、50和100ng ml-1
)，基于代谢组学分析获得的标志化合物在20和100ng ml-1
浓度组中应具有理论上的最小和最大峰强度。为避免样品前处理过程中ppcps不同回收率对变量峰强度变化造成较大误差，采用环丙沙星-d8(母离子m/z 340.19132；碎片离子m/z 296.20156、253.15933和239.14367；保留时间6.73min)作为回收率内标进行校准后，再进行变量峰强度比较。首先，用空白牛肉基质提取液配制100、50、25、10、5ng ml-1
环丙沙星-d8标准曲线溶液，然后计算3个浓度组中环丙沙星-d8的回收率。最后，将每个样品中环丙沙星-d8的回收率乘以一个校准系数后将其回收率校准为100％，同一个样品中的其他变量峰强度也乘以该校准系数作为校准后变量峰强度，用于下一步使用。
[0055]
如图3所示，将特定浓度组与其他两个浓度组分为两个阵营(分别为绿色和蓝色部分)，得到opls-da得分图。两个阵营在第一主成分轴上明显分离，说明两个阵营之间存在显著差异的变量。在图4中，每个点代表一个变量，x轴和y轴分别代表变量的贡献和置信度。距离原点更远，意味着该变量对组间分组贡献和组间差异越大。s-plot曲线两端的点代表了对两个阵营之间差异贡献最大和置信度最高的变量，被认为是最有可能成为标志化合物的变量。在s-plot曲线中，置信度绝对值》0.9的变量通常被认为是候选标志化合物。在图4a中，在s-plot曲线的右端搜索20ng ml-1
浓度组显著低于50和100ng ml-1
浓度组的标志化合物，在图4b中，在s-plot曲线的左端搜索100ng ml-1
组显著高于20和50ng ml-1
浓度组的标志化合物。
[0056]
通过图5置换检验200次的permutation图判断opls-da模型是否过拟合。r2y和q2是验证模型是否过拟合的最常用的两个参数，分别代表模型在y轴方向的解释率和模型的预
ms/ms仪器提取分子量)
[0062]
本发明与以往研究最大的不同在于将未知和预料之外污染物作为潜在的标志化合物，并应用寻找标志化合物的代谢组学分析策略实现动物源食品中非靶标污染物的筛查。传统代谢组学的目的是确定实验组和对照组之间哪些代谢物(即生物标志物)具有统计学上的显著差异，为了更好地模拟传统代谢组学的分析过程，在本发明中，有意设计了三个浓度梯度组(20、50和100ng ml-1
)，然后搜索特定浓度组与其他两个浓度组之间在统计学上具有显著差异的物质(即标志化合物)。值得一提的是，本发明是第一个将寻找标志化合物的代谢组学分析方法成功应用于非靶标污染物筛查。虽然本发明只考虑了34个ppcps和牛肌肉基质，但鉴于这些ppcps的代表性以及牛肉作为一种全球范围广泛接受的动物源食品，本发明提出的筛查方法仍然具有广泛的适用性。随着越来越多的未知和预料之外ppcps可能被用于畜牧业，开发一种能够准确、快速、全面地确定动物源食品基质中存在哪些ppcps的高通量筛查方法至关重要。基于此，本发明开发了这种基于代谢组学分析方法，用于动物源性食品中ppcps的非靶标筛查。
[0063]
建立的代谢组学分析方法可成功应用于牛肌肉基质中10μg kg-1
浓度的34个ppcps的非靶标筛查。为了充分利用传统代谢组学分析方法寻找实验组和对照组之间的生物标志物，本研究有意识地设计了3个浓度组(20ng ml-1
、50ng ml-1
和100ng ml-1
)用于模仿代谢组学分析过程。w4m数据处理平台、simca14.1和spss statistics v17.0软件具有自动处理色谱和质谱信息，分析多变量和单变量结果的功能，可以有效减少人为干扰，简化工作流程，提高筛查效率。本研究首次将寻找标志化合物的代谢组学分析方法，应用于动物源食品中ppcps非靶标筛查。
[0064]
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、选取多个ppcps标准品，对每个ppcps标准品配制浓度为1μg ml-1
的ppcps标准品的甲醇溶液；配制浓度为100ng ml-1
的环丙沙星-d8甲醇溶液；步骤二、牛肌肉样品制备及前处理：(a)将牛肌肉样品切成小块，用组织匀浆机将其打成肉糜；(b)将2.0g、5.0g和10.0g肉糜分别加入到不同的50ml聚丙烯离心管中，然后再分别加入20μl、50μl和100μl的多种浓度为1μg ml-1
的ppcps标准品的甲醇溶液，每个样品中均加入0.5ml浓度为100ng ml-1
的环丙沙星-d8甲醇溶液；(c)每个聚丙烯离心管中再加入8ml浓度为0.1mol l-1
的na2edta水溶液，涡旋30秒，继续加入8ml乙腈，搅拌1分钟，超声提取5分钟；(d)每个聚丙烯离心管中再加入4g无水na2so4，涡旋5分钟，然后控制温度和离心速度分别为4℃和5000r min-1
下离心5分钟，将所有上清液加入quechers净化管，涡旋5分钟，在温度和离心速度分别为4℃和10000r min-1
下离心5分钟；(e)将所有上清液经氮气吹至近干后，复溶于1ml 40％(v/v)甲醇-0.1％甲酸/水溶液，涡旋1min；(f)经0.22μm滤膜过滤后，制得待分析样品，每个待分析样品平行9次，此时三组溶液理论浓度分别为20ng ml-1
、50ng ml-1
和100ng ml-1
；(g)将3个浓度组，每组9个待分析样品，分别命名为20ng ml-1-1～20ng ml-1-9、50ng ml-1-1～50ng ml-1-9和100ng ml-1-1～100ng ml-1-9；每个待分析样品各抽取30μl混合得到质量控制qc样品；在每个浓度组样品检测之前和之后各进3次qc样品，共计12次，分别记为qc-1，qc-2，
……
，qc-12；步骤三、采用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱q exactive plus，配可加热电喷雾离子源esi分析每个待分析样品中的ppcps和环丙沙星-d8；步骤四、使用trace finder 3.3软件对多个ppcps和环丙沙星-d8的lc-ms/ms输出结果进行分析，使用proteowizard软件将raw格式的lc-ms/ms输出文件转换为mzxml格式文件，然后上传到workflow4metabolomics即w4m平台，在w4m平台上进行峰检测、峰对齐和峰保留时间校准，并对峰强度进行归一化、中心化、尺度化和数据转换处理，获得横坐标和纵坐标分别为变量名称和样品名称的数据矩阵，并将qc组和3个浓度组中峰强度相对标准偏差>30％的无效变量删除；将数据矩阵导入simca14.1软件中进行多变量分析，分别获得20ng ml-1
组和100ng ml-1
组的标志化合物，选择两组重叠的标志化合物进一步通过spss statistics v17.0软件进行单变量分析以验证标志化合物的有效性；最终，将获得的标志化合物与多个ppcps标准品的保留时间、精确分子量和加合物结构进行比较，确定标志化合物为何种ppcps。2.根据权利要求1所述的对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法，其特征在于，所述步骤三具体包括：采用esi正模式，每次进样10μl，经accucore rp-ms液相色谱柱进行组分分离，流动相a为0.1％(v/v)甲酸-水溶液，流动相b为0.1％(v/v)甲酸-甲醇溶液，流速设定为0.3ml min-1
，分离梯度：5％b(2min)～30％b(7min)～90％b(25min)～5％b(16min)，柱温保持在40℃；q exactive plus参数设置如下：毛细管和加热温度均为320℃；鞘气和辅助气均为n2，流速
分别为40arb和10arb；喷雾电压和透镜电压分别为3200v和50v；扫描方式：全扫描/数据依赖二级扫描full ms/dd-ms2；ms参数：全扫描分辨率70000，自动增益控制目标agc target 1
×
106，最大驻留时间100ms，m/z扫描范围100～1000；二级质谱参数设置：分辨率17500，agc target 2
×
105，最大驻留时间50ms；使用trace finder 3.3软件对多个ppcps和环丙沙星-d8的lc-ms/ms输出结果进行分析，具体筛查条件如下：(a)一级母离子，响应强度阈值10000，信噪比5.0，质量误差5ppm；(b)对于二级碎片离子，最小离子匹配数1，响应强度阈值10000，质量误差5ppm；然后基于目标物一级母离子峰面积，采用标准曲线法测定环丙沙星-d8的回收率。3.根据权利要求1所述的对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法，其特征在于，所述步骤二中多变量分析包括主成分分析pca和正交偏最小二乘判别分析opls-da；正交偏最小二乘判别分析opls-da时，用空白牛肉基质提取液配制100ng ml-1
、50ng ml-1
、25ng ml-1
、10ng ml-1
、5ng ml-1
环丙沙星-d8标准曲线溶液，然后计算3个浓度组中环丙沙星-d8的回收率；最后，将每个样品中环丙沙星-d8的回收率乘以一个校准系数后将其回收率校准为100％，同一个样品中的其他变量峰强度也乘以该校准系数作为校准后变量峰强度，再进行变量峰强度比较。4.根据权利要求3所述的对牛肌肉中多种ppcps的非靶标筛查方法，其特征在于，所述单变量分析具体为：采用成对t检验法对获得的标志化合物在3个浓度组样品数据矩阵中的峰强度值进行检验；利用变量峰强度倍数变化fold changes>2判定标志化合物对应变量在3个浓度组之间是否具有高对比度峰强度：每个变量在任意一个浓度组中共有9个平行测定的峰强度，取其中位数，三个浓度水平下可得到该变量的三个中位数，通过中位数最高值除以中位数最低值，获得该变量的fold change值。

技术总结
本发明公开了一种对牛肌肉中多种PPCPs的非靶标筛查方法，基于超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)输出结果，采用代谢组学分析方法将筛查非靶标污染物的过程转变为寻找所谓的“标志化合物”过程，有效提高非靶标筛查效率。率。率。


技术研发人员：薛伟锋 褚莹倩 王玫 秦朝秋 曹文军 刘莹 刘水琳 石楠
受保护的技术使用者：大连海关技术中心
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8