一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条及制备方法和检测方法与流程

1.本发明涉及农药检测领域，尤其涉及一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条及制备方法和检测方法。


背景技术：

2.氟啶虫酰胺(flonicamid)，又名n-氰甲基-4-(三氟甲基)烟酰胺，是一种新型的有选择性的低毒吡啶酰胺类杀虫剂，对蚜虫等各种刺吸式口器害虫有效，该药剂通过阻碍害虫吮吸作用而致效，害虫摄入药剂后很快停止吮吸，最后饥饿而死。因为氟啶虫酰胺具有最小抵抗力交叉和哺乳动物急性毒性较低的特点，目前已被许多国家广泛使用在农作物上，如水稻、水果和蔬菜，用于控制蚜虫和其他刺吸式口器昆虫。氟啶虫酰胺作为一种较为新颖的杀虫剂具有广阔的未来市场，目前其单剂或复配制剂在我国的登记数量已达近三十种农作物。例如，专利号为zl 201210119923.x(授权公告号为cn102696607a)的中国发明专利公开的氟啶虫酰胺微乳剂；申请号为cn201310722767.0(公开号为cn104719294a)的中国发明专利公开的含氟啶虫酰胺与烯啶虫胺的杀虫组合物等。
3.嘧菌酯(azoxystrobin)是一种高效且广谱的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，对几乎所有真菌纲病害均有良好的活性。目前，嘧菌酯单剂及复配制剂在我国已被登记于黄瓜、苹果、水稻等多种农作物上。例如，申请号为cn201711164864.7(公开号为cn109805015a)的中国发明专利公开的含有氟啶虫酰胺和嘧菌酯的组合物等。
4.然而，氟啶虫酰胺和嘧菌酯均可携带到农产品中，并增加人类接触。为了保护消费者的健康，采用灵敏可靠的分析方法对氟啶虫酰胺的残留进行监测具有重要意义。近年来，许多氟啶虫酰胺残留的测定方法在不同类型的样本已被报道，这些方法包括气相色谱法(gc)、高效液相色谱(hplc)和高效液相色谱质谱(hplc-ms)。例如，申请号为cn202010953349.2(公开号为cn112114066a)的中国发明专利《共同基团法结合uplc-msms检测植物源农产品中氟啶虫酰胺及其代谢物的方法》；专利号为zl201510528547.3(授权公告号为cn105116090a)的中国发明专利《一种嘧菌酯检测方法》。
5.虽然这些方法具有很高的精度和灵敏度，但它们需要长时间的样品前处理程序和复杂的仪器分析程序，同时这些仪器也不适于大规模和现场分析。因此，要求采用更简单、更经济的方法来测定氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯的残留量，而免疫分析正好满足这些要求，是筛选分析的可靠分析工具。此外，相对于酶联免疫吸附检测方法，荧光免疫层析技术是在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术以及免疫层析技术的结合，具有快速、操作简便等优点。相对于传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，因此荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限，而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性，形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此荧光微球免疫层
析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点，易于在基层普及和推广，可满足快速分析检测的需要，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种灵敏度高、特异性强的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条。
7.本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种操作方便、成品率高的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法。
8.本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种有操作简便、灵敏度高、结果简单可视的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的检测方法。
9.本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板，该底板上依次设置有样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫，上述样品吸收垫、结合物释放垫和吸水垫分别叠压在硝酸纤维素膜检测垫的两端上，上述样品吸收垫、结合物释放垫上分别包被有时间分辨荧光微球标记的抗氟啶虫酰胺多克隆抗体、抗tfna和tfna-am多克隆抗体、抗tfng和tfng-am多克隆抗体、抗嘧菌酯多克隆抗体，
10.而上述硝酸纤维素膜检测垫上分别设有检测线t1、检测线t2、检测线t3、检测线t4和质控线c线，各检测线均为能与对应的上述多克隆抗体特异性结合的半抗原-卵清蛋白偶联物的涂层，其中，检测线t1用于检测氟啶虫酰胺的残留，检测线t2用于检测代谢物tfna和tfna-am的残留，检测线t3用于检测代谢物tfng和tfng-am的残留，检测线t4用于检测嘧菌酯的残留，质控线c线为包被有羊抗鼠igg。
11.进一步，所述检测线t1、检测线t2、检测线t3、检测线t4和质控线c线分别沿上述硝酸纤维素膜检测垫的长度方向依次设置且相互平行，其中，质控线c线与吸水垫的距离最近。
12.进一步，所述硝酸纤维素膜检测垫为硝酸纤维素膜且为孔径5～12μm的多孔膜，所述吸水垫的材质为吸水滤纸，所述样品吸收垫、结合物释放垫的材质均为玻璃纤维素膜。
13.为进一步解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：一种如上所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
14.(一)半抗原、完全抗原、包被原及多克隆抗体的制备；
15.(二)试纸条的制备：
16.(1)时间分辨荧光微球标记抗体；
17.(2)结合物释放垫的制备；
18.(3)样品吸收垫的制备；
19.(4)硝酸纤维素(nc)膜检测垫的制备；
20.(5)试纸条的组装；其中，上述半抗原包括第一半抗原、第二半抗原以及第三半抗原，上述各半抗原的制备分别包括以下步骤：
21.第一半抗原的制备：
22.a液的制备：称取适量tfng-am溶解于甲酸、盐酸、氰酸及水的混合液中，0～5℃冰浴反应30min，反应过程中，边搅拌边缓慢加入适量浓度为1mol/l的亚硝酸钠水溶液；
23.b液的制备：称取适量过硫化钠并加热溶解在水中，得所需的b液，冷却备用；
24.c液的制备：0～5℃条件下，将上述制备的b液加入至a液中并搅拌均匀，调节ph值为7～8，恒温反应2h得c液；
25.第一半抗原的制备：在上述c液中加入适量锌粉和冰乙酸，加热回流反应30min后冷却，ph为8、温度37℃的条件下，加入碘乙酰胺，得到的溶液放入冰箱中静置过夜，析出晶体；减压抽滤、洗涤，40℃下真空烘干，干燥后的粗产品重结晶得纯品第一半抗原；
26.第二半抗原的制备：
27.d液的制备：称取适量tfna-am溶解于乙醇，依次加入甲酸水溶液和甲醛水溶液，在室温下搅拌1.0h，加热升温至87℃使其回流，至薄层色谱跟踪无tfna-am后停止反应，得d液；
28.e液的制备：上述制备的d液自然冷却至室温，乙酸乙酯萃取，取水层，将水层降温后用氢氧化钠水溶液调至ph 9～10，乙酸乙酯萃取，静置分层后合并有机相，有机层经洗涤分出有机相，得e液；
29.在容器中依次加入上述e液、氰酸、n,n-二甲基甲酰胺以及碘化钠得混合液，将所得混合液在微波强度为300w及温度为100℃的条件下微波搅拌反应10min，反应结束后，用乙酸乙酯溶解反应物，饱和食盐水洗涤溶液，真空浓缩有机相液，真空干燥的所需的第二半抗原；
30.第三半抗原的制备：
31.f液：称取适量3-(6-羟基苯基)-丙酮，在0℃且干燥的条件下溶解于dmf中，加入到质量浓度60％的nah悬浮液中，搅拌45min后，在0℃下加入适量甲酸甲酯，在室温下继续搅拌1h后，在0℃下加入适量硫酸二甲酯，0℃条件下搅拌20min后，用饱和nh4cl溶液淬火反应；
32.g液：取适量上述制备的f液和k2co3的悬浊液中加入适量4,6-二氯嘧啶，室温下搅拌3天，得g液；
33.h液：称取适量4-(4-羟基-3-甲基苯基)-2-丁酮和k2co3加入dmf中，接着加入g液，室温下搅拌4天；
34.称取适量lioh溶解于thf/h2o(体积比1:1)溶液中，加入上述h液，搅拌2h，然后加入饱和的nh4cl溶液，用chcl3萃取，无水na2so4干燥，减压脱溶剂，得到第三半抗原。
35.进一步，所述氟啶虫酰胺及其代谢物完全抗原的制备包括以下步骤：
36.在适量bsa中加入浓度为0.01mmol的pbs而制备终浓度为10mg/ml的bsa蛋白溶液；
37.将适量sulfo-smcc溶于dmf中，充分溶解后获得sulfo-smcc溶液，将该sulfo-smcc溶液缓慢滴加至上述bsa蛋白溶液中，室温下垂直混匀1h，得bsa-smcc溶液；
38.将上述bsa-smcc溶液用浓度为0.01mmol、ph为7.4的pbs溶液4℃下透析6h，除去游离sulfo-smcc，取透析后的bsa-smcc溶液，加入溶解于0.01mmol pbs的半抗原，室温下垂直混匀反应4h，用浓度为0.01mmol、ph为7.4的pbs溶液4℃下透析过夜，即得所需的氟啶虫酰胺及其代谢物完全抗原；
39.所述嘧菌酯完全抗原的制备包括以下步骤：
40.称取适量第三半抗原，用无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，接着加入适量1-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6～7h；
41.将适量bsa用硼酸缓冲溶液溶解，室温条件下将半抗原活化液缓慢加入到牛血清白蛋白液中室温搅拌反应过夜，透析。
42.进一步，所述包被抗原通过以下步骤制备：
43.分别称取适量第二半抗原、tfna(第四半抗原)、tfng(第五半抗原)、第三半抗原，并分别用无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后分别加入适量1-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，分别混匀并室温持续搅拌反应6～7h分别得各半抗原活化液；
44.将适量ova用硼酸缓冲溶液溶解，室温下分别将该该鸡卵清白蛋白液加入各半抗原活化液中，室温搅拌反应过夜，透析，即分别得到四种包被完全抗原。
45.进一步，所述多克隆抗体的制备包括以下步骤：
46.首免前7d，对实验雄性新西兰大白兔进行耳缘静脉取血，分离阴性血清；
47.首次免疫将浓度为2mg/ml的免疫原与等体积的弗氏完全佐剂进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；
48.二次免疫于首免两周后进行，浓度为1mg/ml的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂进行混合，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；
49.之后依次进行三次免疫、四次免疫、五次免疫、六次免疫以及七次免疫，各次免疫与上一次免疫之间均间隔两周，浓度为1mg/ml的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂进行混合，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，各次免疫中均对实验雄性新西兰大白兔进行耳缘采血，分离血清，测效价；
50.最后一次免疫，浓度为1mg/ml的免疫原与等体积的生理盐水混合，耳缘静脉注射；
51.一周后，动脉取血，分离血清，经亲和层析得纯化后的多克隆抗体。
52.为进一步解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种氟啶虫酰胺农药检测方法，其特征在于，利用如上所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条。
53.进一步，上述氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测方法包括以下步骤：
54.(1)将待测样品匀浆或切碎，取适量处理后的样品放入样品提取液中，加入一份配套研磨珠，震荡提取，静置后取上清液；
55.(2)取上述获得的上清液滴加至上述试纸条的点样区中进行层析反应，5～10min后，将试纸卡插入荧光检测仪中，荧光检测仪对试纸卡进行扫描测试，通过显示屏幕读取检测结果；
56.(3)检测结果采用半定量测试，仪器将根据检测得到的检测区时间分辨荧光强度与质控区时间分辨荧光强度的比值，自动计算出提取液中氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药各自的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断：
57.阴性(-)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示样本中不含有氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药或其浓度低于检测限；
58.阳性(+)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示样本中氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药浓度等于或高于检测限；
59.无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸卡已失效。
60.进一步，所述步骤(1)的样品提取液为含30％甲醇的醋酸－醋酸钠缓冲液。
61.与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条基于竞争性时间分辨荧光免疫层析法，可同时对氟啶虫酰胺及四种代
谢物和嘧菌酯农药残留进行半定量检测，具有检测所需样本量少、操作简单、检测背景信号低、灵敏度高以及特异性强且线性范围宽等优点。
62.本发明的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条试纸条的制备方法与现有技术相比具有以下优点：第一半抗原制备过程中采用的活性基团为巯基，柔性强，偶联方式温和，且用第一半抗原制备的完全抗原免疫可以同时获得氟啶虫酰胺与四种代谢物相对特异的抗体。第二半抗原的结构与氟啶虫酰胺更贴近能更好地识别识别氟啶虫酰胺母体。而用于识别嘧菌酯的第三半抗原的羧基的连接位置刚好有利于识别基团产生免疫效应。
63.此外，本发明的试纸条的四条检测线分别为能够与时间分辨荧光微球标记的抗体特异性结合的半抗原-卵清蛋白偶联物的涂层，四条检测线相互平行，且四条检测线中包被第二半抗原-ova用于检测氟啶虫酰胺的残留，包被tfna-ova用于检测代谢物tfna和tfna-am的残留，包被tfng-ova用于检测代谢物tfng和tfng-am的残留，包被第三半抗原-ova用于检测嘧菌酯的残留，从而能更加准确地显示检测结果，提高检测的准确性。
附图说明
64.图1是本发明中氟啶虫酰胺代谢物tfng-am的结构示意图；
65.图2是本发明中氟啶虫酰胺及其代谢物免疫半抗原合成示意图；
66.图3是本发明中氟啶虫酰胺包被半抗原合成示意图；
67.图4是本发明中嘧菌酯半抗原合成示意图；
68.图5是本发明中氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯时间分辨荧光免疫层析试纸条的结构示意图：40为样品吸收垫，1为结合物释放垫，2为硝酸纤维素膜检测垫，3为吸水垫，4为底板，t1、t2、t3以及t4分别为四条检测线，c为质控线；
69.图6为图5的俯视示意图；
70.图7是本发明中氟啶虫酰胺浓度对数值与荧光计数对数值标准曲线；
71.图8是本发明中tfna浓度对数值与荧光计数对数值标准曲线；
72.图9是本发明中tfna-am浓度对数值与荧光计数对数值标准曲线；
73.图10是本发明中tfng浓度对数值与荧光计数对数值标准曲线；
74.图11是本发明中tfng-am浓度对数值与荧光计数对数值标准曲线；
75.图12是本发明中嘧菌酯浓度对数值与荧光计数对数值标准曲线。
具体实施方式
76.以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
77.如图5和图6所示，一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药速测的试纸条，该试纸条是基于间接竞争时间分辨荧光免疫层析法的试纸条，包括底板4，该底板4上依次设置有样品吸收垫40、结合物释放垫1、硝酸纤维素膜检测垫2和吸水垫3，样品吸收垫40、结合物释放垫1和吸水垫3分别叠压在硝酸纤维素膜检测垫3的两端上。
78.进一步，上述样品吸收垫40、结合物释放垫1上分别包被有时间分辨荧光微球标记的抗氟啶虫酰胺多克隆抗体、抗tfna及tfna-am多克隆抗体、抗tfng及tfng-am多克隆抗体以及抗嘧菌酯多克隆抗体。
79.进一步，上述硝酸纤维素膜检测垫2上分别设有相互平行的检测线t1、t2、t3、t4和质控线c线，各检测线分别为能够与时间分辨荧光微球标记的抗体特异性结合的半抗原-卵清蛋白偶联物的涂层，其中，t1包被第二半抗原-ova用于检测氟啶虫酰胺的残留，t2包被tfna-ova用于检测代谢物tfna和tfna-am的残留，t3包被tfng-ova用于检测代谢物tfng和tfng-am的残留，t4包被第三半抗原-ova用于检测嘧菌酯的残留，质控线c包被有羊抗鼠igg。t1、t2、t3、t4和质控线c线分别沿硝酸纤维素膜检测垫2的长度方向依次设置且相互平行，质控线c离吸水垫3的距离最近。
80.进一步，硝酸纤维素膜检测垫2为硝酸纤维素膜且为孔径5～12μm的多孔膜，吸水垫3的材质为吸水滤纸，而样品吸收垫40和结合物释放垫1的材质分别为玻璃纤维素膜。
81.下面通过具体实施例对本发明的试纸条的制备过程及应用进行具体说明：
82.实施例1：各半抗原、各完全抗原以及各包被原与多克隆抗体的制备
83.1.如图2所示，第一半抗原的制备步骤如下：
84.称取24.7g tfng-am(4-三氟甲基烟酰胺，cas为158062-71-6，结构式如图1所示，购买于wako和光纯药)溶解于15ml甲酸、45ml水、15ml盐酸以及20ml氰酸的混合液中。在0～5℃冰浴中，边搅拌边缓慢加入20ml浓度为1mol/l的亚硝酸钠水溶液，反应30min。另称取26g过硫化钠在30ml水中加热溶解而得过硫化钠溶液，将该过硫化钠溶液冰上冷却。
85.在0～5℃条件下，将过硫化钠溶液边搅拌边加入tfng-am混合液中，并用饱和碳酸钠溶液调节混合液的ph值为7～8，恒温反应2h。加入3g锌粉和30ml冰乙酸，加热反应回流半h后冷却，得到的溶液在ph为8、温度37℃的条件下，以摩尔比1:10(半抗原：碘乙酰胺)的比例加入碘乙酰胺保护巯基，得到的溶液放入冰箱中静置过夜，析出晶体。减压抽滤，先后用水和乙醇多次洗涤，并放入真空干燥箱中40℃烘干。干燥后的粗产品用体积分数为95％的乙醇重结晶2次得纯品半抗原。
86.2.如图3所示，第二半抗原的制备步骤如下：
87.称取15.44g tfna-am(80mmol)溶解于100ml乙醇，再依次加入27.6g质量分数为80％的甲酸水溶液(480mmol)和33.34g质量分数为36％的甲醛水溶液(480mmol)，在室温下先搅拌1.0h后，再加热升温至87℃使其回流，至薄层色谱(tlc)跟踪无tfna-am后停止反应(12.0h)。
88.反应结束后将反应液自然冷却至室温，乙酸乙酯萃取(50ml
×
3)，弃去有机层，水层降温至0～5℃，用50％氢氧化钠水溶液调至ph 9～10。水层用乙酸乙酯萃取(100ml
×
3)，静置分层，合并有机相，有机层依次用饱和食盐水，蒸馏水洗涤，分出有机相，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，减压蒸除滤液，得到10.55g浅黄色固体的中间体。
89.在50ml圆底烧瓶中，依次加入上述制得的中间体、氰酸(30mmol，2.55g)、n,n-二甲基甲酰胺(30mmol，2.19g)，碘化钠(3mmol，0.45g)得混合液，将所得混合液在微波反应器中300w、控温100℃的条件下搅拌反应10min。反应结束后，用30ml乙酸乙酯溶解反应物，饱和食盐水洗涤溶液，分液，真空浓缩有机相液，真空干燥计算重量。
90.3.如图4所示，第三半抗原的制备步骤如下：
91.在0℃且干燥的条件下，将3-(6-羟基苯基)-丙酮(800.0mg，3.12mmol)溶解于dmf(7.0ml)中，并加入到质量分数为60％的nah(用己烷洗涤，249.7mg,6.24mmol)的悬浮液中。搅拌45min后，用注射器在0℃条件中加入甲酸甲酯(0.58ml,9.36mmol)。室温下搅拌1h，在0
℃条件下加入硫酸二甲酯(0.6ml，6.24mmol)。0℃条件下搅拌20min后，用饱和nh4cl溶液(5.0ml)淬火反应。
92.在上述悬浊液中加入k2co3(49.8mg,0.36mmol)和4,6-二氯嘧啶(107.1mg,0.72mmol)，在室温下搅拌3天。产物经乙醚萃取后加入溶解于dmf(0.3ml)的k2co3(24.9mg,0.18mmol)和4-(4-羟基-3-甲基苯基)-2-丁酮(37.6mg,0.12mmol)悬浮液中，在室温下搅拌4天。产物经乙醚萃取后加入溶解于thf/h2o(1:1v/v,0.6ml)中的lioh(1.0mg,0.04mmol)，搅拌2h，然后加入饱和的nh4cl溶液(1滴)。用chcl3萃取，无水na2so4干燥，减压脱溶剂，得到纯度为80％的纯羧酸衍生物。
93.4.氟啶虫酰胺及其代谢物完全抗原的制备步骤如下：
94.称量300mg bsa(牛血清蛋白，默克)，加入50ml离心管中，加0.01mmol的pbs使bsa终浓度为10mg/ml。将3mg sulfo-smcc(4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，赛默菲)溶于2ml dmf，将溶解好的sulfo-smcc溶液缓慢滴加到bsa蛋白溶液中，室温垂直混匀器混匀反应1h。
95.用1l 0.01mmol的pbs(ph 7.4)溶液于4℃下透析6h，除去游离sulfo-smcc。将透析后的bsa溶液倒入50ml离心管中，将溶解于0.01mmol pbs的第二半抗原.4mg滴加到bsa-smcc管中，室温下用垂直混匀器混匀反应4h。用1l 0.01mmol的pbs(ph 7.4)溶液于4℃下透析过夜，即得所需的完全抗原。
96.5.嘧菌酯完全抗原的制备步骤如下：
97.称取6.2
±
0.1mg第三半抗原用200
±
5ul无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后分别加入6.7
±
0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐和4.0
±
0.1mg n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6
±
1h(称为半抗原活化液)。将牛血清白蛋白10
±
1mg，用3
±
0.1ml硼酸缓冲溶液溶解(称为牛血清白蛋白液)，在室温条件，将半抗原活化液缓慢加入到牛血清白蛋白液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得嘧菌酯完全抗原。
98.6.氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯包被原的制备步骤为：
99.称取4.5
±
0.1mg第二半抗原、3.0
±
0.1mg tfna(第四半抗原，wako生产)、3.9
±
0.1mg tfng(第五半抗原，wako生产)，7.2
±
0.1mg第三半抗原分别用200
±
5ul无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后分别加入6.7
±
0.1mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐和4.0
±
0.1mg n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6
±
1h(称为半抗原活化液)；将鸡卵清白蛋白10
±
1mg，用3
±
0.1ml硼酸缓冲溶液溶解(称为鸡卵清白蛋白液)；在室温条件，将半抗原活化液缓慢加入到鸡卵清白蛋白液中，室温搅拌反应过夜，透析，即得三种包被完全抗原。
100.7.多克隆抗体的制备：
101.实验动物选择雄性新西兰大白兔(6只，8周龄，体重约2.5kg，购于南京大学模式动物研究所)。首免前7天，耳缘静脉取血，分离阴性血清。首次免疫将免疫原(2mg/ml)与等体积的弗氏完全佐剂进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫。间隔两周，二次免疫，免疫原(1mg/ml)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫。从第三次免疫开始直到第七次，免疫原(1mg/ml)与等体积的弗氏不完全佐剂制备免疫原，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，以两周为间隔期，进行耳缘采血，分离血清，测效价。最后一次免疫，将佐剂用生理盐水替代，耳缘静脉注射，一周后，动脉取血，分离血清。经亲和层析纯化多克隆抗体。
102.用间接酶联免疫及竞争酶联免疫法筛选高灵敏度抗体，板中包被第二半抗原-ova用于筛选氟啶虫酰胺对应抗体(抗体1)，包被tfna-ova用于筛选代谢物tfna和tfna-am对应抗体(抗体2)，包被tfng-ova用于筛选代谢物tfng和tfng-am对应抗体(抗体3)，包被第三半抗原-ova用于筛选嘧菌酯对应抗体(抗体4)。
103.实施例2：试纸条制备
104.1.时间分辨荧光微球标记抗体
105.活化：取微球(包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团)悬液100μl混悬于900μl活化缓冲液中，于4℃、10000r/min离心10min，弃上清，重悬微球于1ml活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温振荡活化10min。其中，上述活化缓冲液为ph值为5.5～6.5、0.05mol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸(mes)缓冲液，上述活化剂为水溶性碳二亚胺，其中摩尔质量比edc∶nhs∶cooh＝(1.5～3)∶(8～20)∶1，临用前用活化缓冲液稀释至所需浓度。
106.偶联：将上述活化步骤混悬液于4℃、10000r/min离心10min，弃上清，重悬于偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入20μl抗体1、抗体2、抗体3溶液(蛋白浓度1mg/ml)，混匀后室温震荡偶联120min。其中，上述偶联缓冲液为ph值为7.5～8.5、0.05mol/l的硼酸盐缓冲液(避免使用存在游离胺的溶剂)。
107.封闭：将上述偶联步骤混悬液于4℃、10000r/min离心10min后弃上清，重悬于封闭缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温震荡封闭30min。其中，上述封闭缓冲液为含0.1～0.4mol/l伯胺(盐酸羟胺、乙醇胺或氨基乙醇)、1％～10％bsa的ph值为7.4的pb缓冲液。
108.贮存：将上述封闭步骤混悬液于4℃、10000r/min离心10min后弃上清，重悬于贮存缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。其中，上述贮存缓冲液为含0.01％nan3、0.1％bsa的ph值为7.4的pb缓冲液。
109.2.结合物释放垫的制备
110.将荧光微球标记抗体用含0.01％nan3、0.1％bsa的ph值为7.4的pb缓冲液稀释，将结合物释放垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用。其中，上述结合物释放垫的材质为玻璃纤维素膜。
111.3.样品吸收垫的制备
112.称取60
±
1mg牛血清白蛋白(bsa)、60
±
1mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、1000
±
10mg蔗糖，加入20
±
1ml 0.1m的磷酸缓冲溶液(pbst)中。
113.将上述试剂和溶液充分涡旋混匀，直至完全溶解；将样品垫浸入封闭液中，待完全吸附封闭液(即封闭液的余量不再改变，一般为20-30s)后取出，并在37
±
1℃烘箱中干燥3
±
0.5h；放入封口袋，并保存于玻璃干燥器中。其中，上述样品吸收垫的材质为玻璃纤维素膜或无纺布。
114.4.硝酸纤维素(nc)膜检测垫的制备
115.用0.01mol/l、ph值为7.4的pbs缓冲液分别将第二半抗原-卵清蛋白、第四半抗原-卵清蛋白、半抗原5-卵清蛋白、第三半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到200μg/ml，用点膜仪分别喷涂于nc膜上的检测区，喷膜量为2.0μl/cm。用0.01mol/l、ph值为7.4的pbs缓冲液将羊抗兔抗体稀释到500μg/ml，用点膜仪将其喷涂于nc膜上的质控区，喷膜量为1.0μl/cm。将制备好的nc膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
0.2809x+0.5527，r2＝0.9937。tfng-am的标准曲线见图11。
129.同理，按操作步骤测定嘧菌酯的6个不同浓度标准品的荧光值(a：0ppm、b:0.5ppm、c:2ppm、d:10ppm、e:50ppm、f:200ppm、g:500ppm)，以标准品浓度的对数为横坐标，t/c荧光强度为纵坐标，由双对数数学模型log～log函数处理，线性回归方程为y＝-1.1583x+3.0485，r2＝0.9902。嘧菌酯的标准曲线见图12。
130.实施例4：时间分辨荧光免疫层析试纸条在苹果上的检测实例
131.取已知氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药随机阳性(某一种农药为阳性)的苹果样本50份，已知不含氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药的阴性苹果样本50份，用同一批次生产的本发明中的时间分辨荧光免疫层析试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率，结果如表1所述。
132.表1本实施例中对苹果中氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药标准工作液的检测结果
133.农药阳性苹果样本(50份)阴性苹果样本(50份)氟啶虫酰胺1150tfna850tfna-am750tfng550tfng-am950嘧菌酯1050
134.结果表明：用同一批次生产的试纸条检测阳性样本时，与实际样本相符，符合率为100％；检测阴性样本时，结果全为阴性，符合率为100％，可见本发明的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条具有较高的准确性和实用性。

技术特征：
1.一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板(4)，该底板(4)上依次设置有样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)、硝酸纤维素膜检测垫(2)和吸水垫(3)，上述样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)和吸水垫(3)分别叠压在硝酸纤维素膜检测垫(2)的两端上，上述样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)上分别包被有时间分辨荧光微球标记的抗氟啶虫酰胺多克隆抗体、抗tfna和tfna-am多克隆抗体、抗tfng和tfng-am多克隆抗体、抗嘧菌酯多克隆抗体，而上述硝酸纤维素膜检测垫(2)上分别设有检测线t1、检测线t2、检测线t3、检测线t4和质控线c线，各检测线均为能与对应的上述多克隆抗体特异性结合的半抗原-卵清蛋白偶联物的涂层，其中，检测线t1用于检测氟啶虫酰胺的残留，检测线t2用于检测代谢物tfna和tfna-am的残留，检测线t3用于检测代谢物tfng和tfng-am的残留，检测线t4用于检测嘧菌酯的残留，质控线c线为包被有羊抗鼠igg。2.如权利要求1所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述检测线t1、检测线t2、检测线t3、检测线t4和质控线c线分别沿上述硝酸纤维素膜检测垫(2)的长度方向依次设置且相互平行，其中，质控线c线与吸水垫(3)的距离最近。3.如权利要求1所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜(2)检测垫为硝酸纤维素膜且为孔径5～12μm的多孔膜，所述吸水垫(3)的材质为吸水滤纸，所述样品吸收垫(40)、结合物释放垫(1)的材质均为玻璃纤维素膜。4.一种如权利要求1～3任一项所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(一)半抗原、完全抗原、包被原及多克隆抗体的制备；(二)试纸条的制备：(1)时间分辨荧光微球标记抗体；(2)结合物释放垫的制备；(3)样品吸收垫的制备；(4)硝酸纤维素(nc)膜检测垫的制备；(5)试纸条的组装；其中，上述半抗原包括第一半抗原、第二半抗原以及第三半抗原，上述各半抗原的制备分别包括以下步骤：第一半抗原的制备：a液的制备：称取适量tfng-am溶解于甲酸、盐酸、氰酸及水的混合液中，0～5℃冰浴反应30min，反应过程中，边搅拌边缓慢加入适量浓度为1mol/l的亚硝酸钠水溶液；b液的制备：称取适量过硫化钠并加热溶解在水中，得所需的b液，冷却备用；c液的制备：0～5℃条件下，将上述制备的b液加入至a液中并搅拌均匀，调节ph值为7～8，恒温反应2h得c液；第一半抗原的制备：在上述c液中加入适量锌粉和冰乙酸，加热回流反应30min后冷却，ph为8、温度37℃的条件下，加入碘乙酰胺，得到的溶液放入冰箱中静置过夜，析出晶体；减压抽滤、洗涤，40℃下真空烘干，干燥后的粗产品重结晶得纯品第一半抗原；第二半抗原的制备：d液的制备：称取适量tfna-am溶解于乙醇，依次加入甲酸水溶液和甲醛水溶液，在室温
下搅拌1.0h，加热升温至87℃使其回流，至薄层色谱跟踪无tfna-am后停止反应，得d液；e液的制备：上述制备的d液自然冷却至室温，乙酸乙酯萃取，取水层，将水层降温后用氢氧化钠水溶液调至ph 9～10，乙酸乙酯萃取，静置分层后合并有机相，有机层经洗涤分出有机相，得e液；在容器中依次加入上述e液、氰酸、n,n-二甲基甲酰胺以及碘化钠得混合液，将所得混合液在微波强度为300w及温度为100℃的条件下微波搅拌反应10min，反应结束后，用乙酸乙酯溶解反应物，饱和食盐水洗涤溶液，真空浓缩有机相液，真空干燥的所需的第二半抗原；第三半抗原的制备：f液：称取适量3-(6-羟基苯基)-丙酮，在0℃且干燥的条件下溶解于dmf中，加入到质量浓度60％的nah悬浮液中，搅拌45min后，在0℃下加入适量甲酸甲酯，在室温下继续搅拌1h后，在0℃下加入适量硫酸二甲酯，0℃条件下搅拌20min后，用饱和nh4cl溶液淬火反应；g液：取适量上述制备的f液和k2co3的悬浊液中加入适量4,6-二氯嘧啶，室温下搅拌3天，得g液；h液：称取适量4-(4-羟基-3-甲基苯基)-2-丁酮和k2co3加入dmf中，接着加入g液，室温下搅拌4天；称取适量lioh溶解于thf/h2o(体积比1:1)溶液中，加入上述h液，搅拌2h，然后加入饱和的nh4cl溶液，用chcl3萃取，无水na2so4干燥，减压脱溶剂，得到第三半抗原。5.如权利要求4所述的氟啶虫酰胺及嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法，其特征在于，所述氟啶虫酰胺及其代谢物完全抗原的制备包括以下步骤：在适量bsa中加入浓度为0.01mmol的pbs而制备终浓度为10mg/ml的bsa蛋白溶液；将适量sulfo-smcc溶于dmf中，充分溶解后获得sulfo-smcc溶液，将该sulfo-smcc溶液缓慢滴加至上述bsa蛋白溶液中，室温下垂直混匀1h，得bsa-smcc溶液；将上述bsa-smcc溶液用浓度为0.01mmol、ph为7.4的pbs溶液4℃下透析6h，除去游离sulfo-smcc，取透析后的bsa-smcc溶液，加入溶解于0.01mmol pbs的半抗原，室温下垂直混匀反应4h，用浓度为0.01mmol、ph为7.4的pbs溶液4℃下透析过夜，即得所需的氟啶虫酰胺及其代谢物完全抗原；所述嘧菌酯完全抗原的制备包括以下步骤：称取适量第三半抗原，用无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，接着加入适量1-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，混匀，室温持续搅拌反应6～7h；将适量bsa用硼酸缓冲溶液溶解，室温条件下将半抗原活化液缓慢加入到牛血清白蛋白液中室温搅拌反应过夜，透析。6.如权利要求5所述的氟啶虫酰胺及嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法，其特征在于，所述包被抗原通过以下步骤制备：分别称取适量第二半抗原、tfna(第四半抗原)、tfng(第五半抗原)、第三半抗原，并分别用无水n,n-二甲基甲酰胺溶解，然后分别加入适量1-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，分别混匀并室温持续搅拌反应6～7h分别得各半抗原活化液；将适量ova用硼酸缓冲溶液溶解，室温下分别将该该鸡卵清白蛋白液加入各半抗原活化液中，室温搅拌反应过夜，透析，即分别得到四种包被完全抗原。
7.如权利要求6所述的氟啶虫酰胺及嘧菌酯农药检测用试纸条的制备方法，其特征在于，所述多克隆抗体的制备包括以下步骤：首免前7d，对实验雄性新西兰大白兔进行耳缘静脉取血，分离阴性血清；首次免疫将浓度为2mg/ml的免疫原与等体积的弗氏完全佐剂进行混合，充分乳化，形成油包水的状态，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；二次免疫于首免两周后进行，浓度为1mg/ml的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂进行混合，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫；之后依次进行三次免疫、四次免疫、五次免疫、六次免疫以及七次免疫，各次免疫与上一次免疫之间均间隔两周，浓度为1mg/ml的免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂进行混合，背部皮下6点，后腿肌肉2点免疫，各次免疫中均对实验雄性新西兰大白兔进行耳缘采血，分离血清，测效价；最后一次免疫，浓度为1mg/ml的免疫原与等体积的生理盐水混合，耳缘静脉注射；一周后，动脉取血，分离血清，经亲和层析得纯化后的多克隆抗体。8.一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测方法，其特征在于，利用如权利要求1～3任一项所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条。9.如权利要求8所述的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)将待测样品匀浆或切碎，取适量处理后的样品放入样品提取液中，加入一份配套研磨珠，震荡提取，静置后取上清液；(2)取上述获得的上清液滴加至上述试纸条的点样区中进行层析反应，5～10min后，将试纸卡插入荧光检测仪中，荧光检测仪对试纸卡进行扫描测试，通过显示屏幕读取检测结果；(3)检测结果采用半定量测试，仪器将根据检测得到的检测区时间分辨荧光强度与质控区时间分辨荧光强度的比值，自动计算出提取液中氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药各自的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断：阴性(-)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示样本中不含有氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药或其浓度低于检测限；阳性(+)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示样本中氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药浓度等于或高于检测限；无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸卡已失效。10.如权利要求9所述的所述的氟啶虫酰胺农药检测方法，其特征在于，所述步骤(1)的样品提取液为含30％甲醇的醋酸－醋酸钠缓冲液。

技术总结
本发明涉及一种氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条及制备方法和检测方法，试纸条包括底板，底板上设置有样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜检测垫和吸水垫，样品吸收垫、结合物释放垫和吸水垫分别叠压在硝酸纤维素膜检测垫的两端上，样品吸收垫、结合物释放垫上分别包被有抗氟啶虫酰胺多克隆抗体、抗TFNA和TFNA-AM多克隆抗体、抗TFNG和TFNG-AM多克隆抗体、抗嘧菌酯多克隆抗体。本发明中的氟啶虫酰胺及其代谢物和嘧菌酯农药检测用试纸条基于竞争性时间分辨荧光免疫层析法，可同时对氟啶虫酰胺及四种代谢物和嘧菌酯农药残留进行半定量检测，具有检测所需样本量少、操作简单、检测背景信号低、灵敏度高以及特异性强且线性范围宽等优点。异性强且线性范围宽等优点。异性强且线性范围宽等优点。


技术研发人员：贾惠言 吴银良 陈道定 付岩 张亮
受保护的技术使用者：宁波市农业科学研究院
技术研发日：2021.12.12
技术公布日：2022/3/8