一种二苯壬烷类化合物与其组合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药化学领域，具体是涉及一种二苯壬烷类化合物与其组合物，以及上述二苯壬烷类化合物的植物提取分离制备方法或人工合成的制备方法，以及上述化合物与其组合物在预防/治疗胆汁酸、脂质代谢紊乱相关疾病中的应用，如胆汁淤积、胆汁淤积诱发的各种肝胆炎症如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪肝病，相关消化系统癌症如肝癌、胆管癌、肝胆管癌、结肠癌和胃腺癌等。


背景技术：

2.我国是一个“肝病大国”，如病毒性肝病、酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病包括原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎等，各种肝胆疾病可进一步恶化导致纤维化、肝胆硬化甚至癌症，如肝癌、胆管癌、胃腺癌和结肠癌等。流行病学显示，我国由于肝炎和肝硬化的患者众多，致使肝癌在我国的发病率和病死率均高于世界平均水平，全世界50%以上的原发性肝癌发生在我国，每年约23万人死于肝癌，位列我国癌症病死率第二位。治疗上述疾病的保肝利胆药物很多，如基础代谢类药物、肝细胞膜保护剂、解毒护肝药、降酶药、利胆退黄药、非特异性抗炎药等，但依然缺乏特效药物。肝胆炎症及诱发疾病的发病机制十分复杂，其发生、发展、转移和复是多基因参与、多因素影响。多阶段发展的复杂网络调控，与多种基因的突变、多个细胞信号传导通路的异常密切相关。核受体尤其是异二聚体型核受体是调控复杂基因网络的细胞转录因子。目前在肝胆炎症及消化系统癌症尤其是肝癌治疗药物研究方面已成为重要的靶标研究热点。fxr作为胆汁酸的异二聚体型核受体，在胆固醇代谢、胆酸代谢、脂代谢、糖代谢、肝脏的正常生理功能和肝脏保护中发挥着重要的作用。fxr在肝脏或肠中被激活或抑制后后，可激活或抑制体内fxr信号通路中相关受体，从而影响体内胆汁酸的合成，分泌，摄入，排泄等环节，从而调节胆汁酸的代谢，维持体内胆汁酸稳态，对肝脏起到保护作用。大量的药理学研究表明fxr激动剂对于肝脏相关疾病有着很好的治疗作用，如胆汁淤积、胆石症、肝脏损伤和手术切除后的再生、非酒精性脂肪肝（nafld)和肝硬化。fxr激动剂奥贝胆酸（ocaliva，oca）已于2016年通过fda认证用于治疗原发性胆汁性肝硬化，而且已继续进行开展用于治疗非酒精性脂肪肝的临床试验。有报道称慢性炎症和胆汁淤积可能是肝癌、胆管癌等恶性肿瘤形成的两大环节。fxr在肿瘤细胞中表达程度的差异可能是影响血清总胆汁酸浓度的重要原因，进而在不同侵袭性肝癌中调节胆汁酸代谢而发挥作用。激活fxr可抑制白细胞介素-6（il-6）、诱导型一氧化氮合成酶（inos）、核因子-κb（nf-κb）、环氧化酶-2（cox-2）等多种炎症因子的表达，而这些都是促癌生长的重要因素。在肝癌中，活化fxr可降低nf-κb的活性，调控相关抑癌基因的表达，抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡;结肠癌中，缺失fxr提高慢性结肠炎小鼠模型的癌变率，激活fxr还可降低该模型小鼠肠道上皮的增生及炎症，fxr的缺失会增加肠异型增生的发生率并起到促癌作用，活化fxr对结肠肿瘤细胞的生长有抑制作用。新近发现，喂食了牛黄胆酸钠的小鼠表现出回肠shp的高表达，以及fgf15和ibabp等其他fxr依赖基因；胆管上皮癌的发生与胆管慢性炎症和胆汁淤积这两大危险因子密切相关，胆管上皮癌的易感性可
部分归结于单元型atp8b1( fic1)，而在患癌病人中，v444a的表达有着相同的趋势，有可能在基因层面上，fxr可通过影响abcb11 ( bsep ) 和atp8b1 ( fic1) 而参与肿瘤的发生与发展；胃十二指肠之间的胆汁反流不仅造成炎症，还是胃食管癌的危险因子。fxr可增加胃上皮细胞对炎症介导损害的抵抗力，并且也由此对胃癌起到一定抑制作用，核受体在肿瘤不同阶段表达不同，fxr 可以将barret's 食管癌中没有恶性增生的情况从腺癌和恶性增生中区分出来，在pxr 的配合下，还可将高度恶化增生从低度恶化增生和没有恶化增生这两种情况中区分出来。
3.篦齿虎耳草saxifraga. umbellulata var. pectinata为藏药“蒂达”的主要基原植物之一，主要分布在西藏地区。“蒂达”是藏医药中治疗肝胆类疾病的一类药物的总称。据藏医药经典著作《晶珠本草》记载：“蒂达可清热，治胆病、血病等赤巴病症状”。“赤巴”系藏医学理论中与消化系统密切相关的维持人体正常生命活动的三大因素之一，现代各种肝胆类疾病症状与藏医临床上的“赤巴病”症状相似。篦齿虎耳草的现代研究报道较少，只有少量的化学成分研究报道，主要为黄酮类、姜黄素类和酚酸类成分，而与其临床应用相关的保肝利胆的活性研究几乎没有。笔者在前期活性筛选中，篦齿虎耳草的乙醇总提取物对anit诱导的小鼠急性肝内胆汁淤积型肝损伤以及四氯化碳诱导的小鼠急性化学性肝损伤都具有很好的抵抗作用。因此，本发明从该活性提取物中分离制备获得的二苯壬烷类化合物，经ca数据库网络版scifinder数据库检索均为新化合物，在现有技术中都没有涉及从篦齿虎耳草中或其他植物中分离得到的具有预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症作用的该类化合物的具体化合物、其化学结构、药理学数据及其制备方法。


技术实现要素：

4.针对上述现有背景技术中存在的缺陷，本发明的有如下几个目的。
5.目的1：在于提供一类从篦齿虎耳草中提取分离的预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症的二苯壬烷类新化合物。
6.目的2：是提供一种含有治疗有效量的上述二苯壬烷类化合物有效部位的组合物。
7.目的3：是提供一种从篦齿虎耳草中提取和分离上述二苯壬烷类化合物及其药物组合物的制备方法。
8.目的4：是提供一种化学人工合成上述二苯壬烷类化合物的制备方法。
9.目的5：是提供上述二苯壬烷类化合物与其组合物在制备预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症中的应用。
10.上述的二苯壬烷类化合物与其组合物在制备预防/治疗肝胆炎症疾病及相关癌症中的应用为胆汁酸核受体-法尼醇x受体（fxr）通路相关受体的激动剂或抑制剂或者肝癌、胆管癌、结肠癌和胃腺癌等癌细胞增殖的抑制剂。
11.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案。
12.本发明提供了中从篦齿虎耳草中分离制备的4个新化合物结构，即化合物a、b、c和d，结构如下所示（s, r表示各位置立体构型）：
。
13.本发明提供了上述预防/治疗肝胆疾病及相关癌症的药物的单一或组合物来源的篦齿虎耳草活性部位提取物，该活性部位提取物制备包括如下步骤：(a)用醇、水或其混合物浸泡、渗漉或者回流提取篦齿虎耳草样品，过滤后得到提取液；其中所述的醇为甲醇或乙醇；(b)将得到的提取液中的溶剂蒸发形成流浸膏；(c)将水加入到该流浸膏中，得到总提取物的水混悬液；(d)用石油醚、类石油醚小极性溶剂或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到氯仿、石油醚、类石油醚的小极性溶剂或其混合物的萃取物；然后，进一步用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(e)将乙酸乙酯萃取物浓缩后，进行大孔树脂层析，分别用纯水、醇∶纯水溶液(30∶70，v/v)、醇∶纯水溶液(60∶40，v/v)进行洗脱；其中所述的醇为甲醇或乙醇；(f)将醇∶纯水溶液(60∶40，v/v)洗脱得到的洗脱液浓缩得到得粗馏分en3；(g)将粗馏分en3用小孔树脂进行柱层析，分别用醇∶纯水溶液(20∶80，v/v)、醇∶纯水溶液(50∶50，v/v)进行洗脱，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将体积比为醇∶纯水溶液(50∶50，v/v)洗脱得到的洗脱液蒸发至干，即得活性部位提取物en3m4。
14.本发明提供了上述预防/治疗肝胆疾病及相关癌症的药物的单一化合物的植物分离制备方法，可将上述得到的篦齿虎耳草活性部位提取物en3m4，经过进一步层析分离后，可以制得本发明中的二苯壬烷类新化合物a、b、c和d。具体包括如下步骤：(1)将活性部位提取物en3m4用硅胶h柱进行柱层析，依次用体积比为50∶1、40∶1、20∶1、10∶1、1:1的氯仿∶甲醇混合溶剂体洗脱，通过tlc板检测，根据tlc板显示，将相似组分合并并浓缩，根据rf值在0.6～0.2之间从大到小获得1～9九个组分；(2)将目标组分进行反相硅胶柱（ods柱）层析，分别用纯水、甲醇∶纯水体积比为20∶80～90∶10洗脱剂进行梯度洗脱；通过uplc-ms追踪分析，将分离分子量为372的化合物所
在的馏份合并并浓缩，得到1～3三个馏分；(3)将馏分1进行高效液相制备柱层析，采用甲醇∶纯水(40∶60，v/v)洗脱剂进行洗脱，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，收集其所在色谱馏份并合并并浓缩至干，得到化合物a；(4)将馏分2进行凝胶柱层析，采用纯甲醇冲洗，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，合并并浓缩至干其所在馏份，得到化合物b、c的混合物，将混合物上于正相手性制备柱，采用正己烷: 乙醇（60: 40，v/v）洗脱剂冲洗，在280nm下收集先后出来的两个色谱峰得到化合物b和化合物c；(5)将馏分3进行凝胶柱层析，采用纯甲醇冲洗，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，合并并浓缩至干其所在馏份，得到化合物d。
15.本发明提供了上述预防 / 治疗肝胆疾病及相关癌症的二苯壬烷类化合物a和化合物d的人工合成制备方法，具体包括如下步骤:步骤1： 将 3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酸（12g，66.6mmol，1当量）和pd/c（1.2g，0.1equiv）在35℃下，h2气氛下溶解于无水甲醇（150ml）中过夜，反应后，在真空中蒸发混合物，得到棕色固体s1（11.8g，98%）；步骤2： 将s1溶解于40ml无水甲醇中，并用冰浴冷却，通过搅拌逐滴添加乙酰氯，30分钟后移除冰浴，并在68℃下搅拌反应过夜，过滤和浓缩后，通过柱色谱法纯化粗产物，得到黄色油状产物s2（11.2 g，85%产率），将油状产物放入冰箱后变为固体， 步骤3：将干燥dmf（40 ml）中的s2（12.13 g，61.8 mmol，1当量）和咪唑缓慢添加到干燥dmf（10 ml）中的叔丁基二苯硅酰氯中，在n2气氛下：反应完成后，在rt下搅拌反应混合物5小时，用乙醇酸稀释混合物，用水冲洗混合物，然后用乙醇酸三次萃取水层；用盐水冲洗合并的有机层，用无水na2so4干燥，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=70:1）纯化粗产物，得到产品s3（21.32 g，85%产率），为黄色油状化合物；步骤4：将s3（8.13g，19.14mmol，1当量）溶解于干燥的thf（50ml）中并冷却至-20℃，然后在-20℃下缓慢添加lialh4，反应混合物在0℃下搅拌过夜，反应完成后，依次向混合物中添加h2o、sat.aq naoh、h2o进行淬火，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=30:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s4（7.2g，85%产率）步骤5：dess
–
martin periodinane混悬液在150 ml干ch2cl2的氮气气氛下冷却至0℃，将s4（13.99 g，32.9 mmol，1当量）在氮气气氛下于0℃添加至反应中，过夜，用150ml的etoac和50ml的sat稀释混合物，添加含有5%硫代硫酸钠的nahco3溶液，搅拌20分钟后，分离出透明的有机层，有机物在na2so4上干燥，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=100:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s5（11.32g，81%）；
步骤6：将s7（1.19 g，3.75 mmol，1.5当量）在0℃下添加到ch2cl2（0.5 m/l）中的s5（1g，2.5 mmol，1当量）溶液中，然后将反应混合物加热至室温并搅拌，直到tlc指示完全消耗，过滤和浓缩后，通过柱色谱法（石油醚/etoac=120:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s6（1.3 g，79%）；%）；步骤7：将二异丙胺溶解在无水thf中，并在氩气气氛下将溶液冷却至0℃，然后，将n-buli[1.6 m己烷]逐滴添加到混合物中
−
78℃，将酮溶解在无水thf[1.5 m]中，置于氩气气氛下，并在室温下冷却
−
78℃，搅拌30分钟后，将酮缓慢插入lda溶液中，并在适当温度下搅拌混合物
−
78℃30分钟，然后，将醛溶解在无水thf[1 m]中，置于氩气气氛下，冷却至
−
78℃，然后缓慢插管至烯醇盐溶液，并搅拌，直到tlc显示完全消耗，然后通过添加饱和nh4cl水溶液使反应停止，并使温和剂在室温下升高，用acoet提取混合物，用盐水洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥，过滤，真空浓缩，并通过柱色谱（石油醚/etoac=50:1）纯化，得到黄色油状产品s8（1.1 g，55%）；步骤8. 在吡啶（1.0 ml）中添加s8（500 mg，0.6 mmol，1.0当量）到3hf-et3n（1ml，6 mmol，10当量），将反应混合物在室温氮气下搅拌30分钟后，加入中和至中性的饱和碳酸氢钠水溶液，然后，用20ml etoac稀释混合物，用饱和nacl水溶液（10ml）洗涤合并的有机层，在mgso4上干燥，过滤，并在减压下浓缩以提供残留物，使用硅胶柱ch2cl2:meoh=40:1）通过色谱法纯化残留物得s9，即化合物d（185毫克，83%）；步骤9. 将干燥ch3cn（0.5 ml）中的s9（64 mg，172μmol，1当量）和bf3
•
et2o（在0℃下搅拌30-40 min，反应完成后（通过tlc监测），用乙酰乙酸乙酯稀释混合物，使用饱和含水nahco3使反应系统的ph为中性，然后用盐水（1
×
5 ml）洗涤最后，用etoac（3
×
5 ml）冲洗水层，分离有机相并在无水na2so4上干燥，有机物在na2so4上干燥，过滤并蒸发，通过硅胶上的快速色谱法纯化残余物得s10, 即化合物a（38 mg，60%），
ꢀ
。
[0016]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：上述化合物a、b、c和d是未见文献报道的新化合物；以及二苯壬烷类化合物a、b、c和d及其来源活性部位的制备方法和二苯壬烷类化合物a、d的人工合成制备方法均未见文献报道。
[0017]
本发明提供的4种二苯壬烷类化合物a、b、c和d，采用分子对接软件ledock软件，模拟分析a、b、c和d与fxr蛋白受体的相互作用，结果提示，4 种成分与 fxr蛋白具有较小的自由能，有较强的结合作用。
[0018]
本发明提供的4种二苯壬烷类化合物a、b、c和d在体外癌细胞细胞毒实验中，表现出不同程度的对肝癌细胞、肝胆管癌细胞、胆管癌细胞、胃腺癌细胞增殖的抑制作用。
[0019]
本发明提供的二苯任烷类化合物a、d对体外人肝癌细胞hepg2中fxr信号通路的相关蛋白表达具有调控作用。
附图说明
[0020]
图1本发明所述化合物 a、 b、c和d的化学结构式；图2本发明所述化合物a、b、c和d结构中关键的1h-1
h cosy (
▬
)和hmbc(h
→
c) 相关信号；图3本发明所述化合物a的核磁共振氢谱(1h nmr)；图4本发明所述化合物a的核磁共振碳谱(
13
c nmr)；图5本发明所述化合物a的hmqc谱；图6本发明所述化合物a的1h-1
h cosy谱；图7本发明所述化合物a的hmbc谱；图8本发明所述化合物b/c的核磁共振碳谱(1h nmr)；图9本发明所述化合物b/c的核磁共振碳谱(
13
c nmr)；图10本发明所述化合物b/c的hmqc谱；图11本发明所述化合物b/c的1h-1
h cosy谱；图12本发明所述化合物b/c的hmbc谱；图13本发明所述化合物c的x-单晶衍射结构图（cu kα）；图14本发明所述化合物d的核磁共振碳谱(1h nmr)；图15本发明所述化合物d的核磁共振碳谱(
13
c nmr)；图16本发明所述化合物d的hmqc谱；图17本发明所述化合物d的1h-1
h cosy谱；图18本发明所述化合物d的hmbc谱；图19本发明所述fxr受体蛋白结构（来源于www.rcsb.ogr，提取码：3dct）；图20本发明所述化合物a和化合物d与fxr受体蛋白对接交互作用的二维平面图；图21化合物a和化合物d对hepg2细胞中fxr信号通路相关受体的激活作用。
[0021] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022]
实施例1本发明实施例中，篦齿虎耳草中二苯壬烷类化合物a、b、c、d与其组合物来源活性部位的制备过程：用醇、水或其混合物浸泡、渗漉或者回流提取篦齿虎耳草样品，过滤后得到提取液，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将得到的提取液中的溶剂蒸发形成流浸膏；将水加入到该流浸膏中，得到总提取物的水混悬液；石油醚、类石油醚小极性溶剂或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到石油醚、类石油醚小极性溶剂或其混合物的萃取物；然后，进一步用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物浓缩后，进行大孔树脂层析，分别用纯水、体积比为30∶70醇/纯水混合物、体积比为60∶40醇/纯水混合物进行洗脱，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将体积比为60∶40醇/纯水混合物洗脱得到的洗脱液蒸浓缩，得粗馏分en3；将粗馏分en3用小孔树脂进行柱层析，分别用纯水、体积比为20∶80醇/纯水混合物、体积比从50∶50醇/纯水混合物进行洗脱，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将体积比为50∶50醇/纯水混合物洗脱得到的洗脱液蒸发至干，即得活性部位en3m4； 将活性部位提取物en3m4用硅胶h柱进行柱层析，依次用体积比为50∶1、40∶1、20∶1、10∶1、1:1的氯仿∶甲醇混合溶剂体洗脱，通过tlc板检测，根据tlc板显示，将相似组分合并并浓缩，根据rf值在0.6～0.2之间从大到小获得1～9九个组分；将目标组分进行反相硅胶柱（ods柱）层析，分别用纯水、甲醇∶纯水体积比为20∶80～90∶10洗脱剂进行梯度洗脱；通过uplc-ms追踪分析，将分离分子量为372的化合物所在的馏份合并并浓缩，得到1～3三个馏分；将馏分1进行高效液相制备柱层析，采用甲醇∶纯水(40∶60，v/v)洗脱剂进行洗脱，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，收集其所在色谱馏份并合并并浓缩至干，得到化合物a；将馏分2进行凝胶柱层析，采用纯甲醇冲洗，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，合并并浓缩至干其所在馏份，得到化合物b、c的混合物，将混合物上于正相手性制备柱，采用正己烷:乙醇（60:40，v/v）洗脱剂冲洗，在280nm下收集先后出来的两个色谱峰得到化合物b和化合物c；将馏分3进行凝胶柱层析，采用纯甲醇冲洗，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，合并并浓缩至干其所在馏份，得到化合物d。
[0023] 实施例2本发明实施例中，二苯壬烷类成分化合物a和d的人工合成制备过程：步骤1：将3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酸（12g，66.6mmol，1当量）和pd/c（1.2g，0.1equiv）在35℃下，h2气氛下溶解于无水甲醇（150ml）中过夜，反应后，在真空中蒸发混合物，得到棕色固体s1（11.8g，98%）；步骤2：将s1溶解于40ml无水甲醇中，并用冰浴冷却，通过搅拌逐滴添加乙酰氯，30分钟后移除冰浴，并在68℃下搅拌反应过夜，过滤和浓缩后，通过柱色谱法纯化粗产物，
得到黄色油状产物s2（11.2 g，85%产率），将油状产物放入冰箱后变为固体， 步骤3：将干燥dmf（40 ml）中的s2（12.13 g，61.8 mmol，1当量）和咪唑缓慢添加到干燥dmf（10 ml）中的叔丁基二苯硅酰氯中，在n2气氛下：反应完成后，在rt下搅拌反应混合物5小时，用乙醇酸稀释混合物，用水冲洗混合物，然后用乙醇酸三次萃取水层；用盐水冲洗合并的有机层，用无水na2so4干燥，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=70:1）纯化粗产物，得到产品s3（21.32 g，85%产率），为黄色油状化合物；步骤4：将s3（8.13g，19.14mmol，1当量）溶解于干燥的thf（50ml）中并冷却至-20℃，然后在-20℃下缓慢添加lialh4，反应混合物在0℃下搅拌过夜，反应完成后，依次向混合物中添加h2o、sat.aq naoh、h2o进行淬火，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=30:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s4（7.2g，85%产率）步骤5：dess
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martin periodinane混悬液在150 ml干ch2cl2的氮气气氛下冷却至0℃，将s4（13.99 g，32.9 mmol，1当量）在氮气气氛下于0℃添加至反应中，过夜，用150ml的etoac和50ml的sat稀释混合物，添加含有5%硫代硫酸钠的nahco3溶液，搅拌20分钟后，分离出透明的有机层，有机物在na2so4上干燥，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=100:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s5（11.32g，81%）；步骤6：将s7（1.19 g，3.75 mmol，1.5当量）在0℃下添加到ch2cl2（0.5 m/l）中的s5（1g，2.5 mmol，1当量）溶液中，然后将反应混合物加热至室温并搅拌，直到tlc指示完全消耗，过滤和浓缩后，通过柱色谱法（石油醚/etoac=120:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s6（1.3 g，79%）；79%）；步骤7：将二异丙胺溶解在无水thf中，并在氩气气氛下将溶液冷却至0℃，然后，将n-buli[1.6 m己烷]逐滴添加到混合物中
−
78℃，将酮溶解在无水thf[1.5 m]中，置于氩气气氛下，并在室温下冷却
−
78℃，搅拌30分钟后，将酮缓慢插入lda溶液中，并在适当温度下搅拌混合物
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78℃30分钟，然后，将醛溶解在无水thf[1 m]中，置于氩气气氛下，冷却至
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78℃，然后缓慢插管至烯醇盐溶液，并搅拌，直到tlc显示完全消耗，然后通过添加饱和nh4cl水溶液使反应停止，并使温和剂在室温下升高，用acoet提取混合物，用盐水洗涤合并的有
机层，用无水na2so4干燥，过滤，真空浓缩，并通过柱色谱（石油醚/etoac=50:1）纯化，得到黄色油状产品s8（1.1 g，55%）；步骤8. 在吡啶（1.0 ml）中添加s8（500 mg，0.6 mmol，1.0当量）到3hf-et3n（1ml，6 mmol，10当量），将反应混合物在室温氮气下搅拌30分钟后，加入中和至中性的饱和碳酸氢钠水溶液，然后，用20ml etoac稀释混合物，用饱和nacl水溶液（10ml）洗涤合并的有机层，在mgso4上干燥，过滤，并在减压下浓缩以提供残留物，使用硅胶柱ch2cl2:meoh=40:1）通过色谱法纯化残留物得s9，即化合物d（185毫克，83%）；步骤9. 将干燥ch3cn（0.5 ml）中的s9（64 mg，172μmol，1当量）和bf3
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et2o（在0℃下搅拌30-40 min，反应完成后（通过tlc监测），用乙酰乙酸乙酯稀释混合物，使用饱和含水nahco3使反应系统的ph为中性，然后用盐水（1
×
5 ml）洗涤最后，用etoac（3
×
5 ml）冲洗水层，分离有机相并在无水na2so4上干燥，有机物在na2so4上干燥，过滤并蒸发，通过硅胶上的快速色谱法纯化残余物得s10, 即化合物a（38 mg，60%）， 。
[0024]
实施例3本发明实施例中，二苯壬烷类化合物a、 b、c和d的结构鉴定：化合物a，淡黄色颗粒，易溶于甲醇。高分辨质谱信息m/z 371.1517 [m-h]
+
(calcd. for c
21h23
o6: 371.1500)给出其分子式为c
21h24
o6，计算其不饱和度为10。在c谱（附图4）中只显示11个碳信号，包括6个芳基碳、1个联氧碳，3个亚甲基碳和1个羰基碳，推测其可能为一对称结构，碳信号除羰基外重叠在一起。而氢谱的数据同样印证了这一点。氢谱中（附图3），一组芳香基质子信号[dh6.67 (h-5', 5'', d, j = 8.0 hz, 2h), 6.63 (h-2', 2'', d, j = 2.1 hz, 2h), 6.50 (h-6', 6'', dd, j = 8.0, 2.1 hz, 2h)]证明结构中苯环存在一个abx氢质子偶合系统,。除了羰基和2个苯环贡献的9个不饱和度，氢碳谱数据中无烯碳信号，推测剩下的一个不饱和度由一个环装结构贡献。通过1h
–1h cosy，hmqc和hmbc二维谱解析(附图2，5，6，7)，证明了这一点。hmbc相关信号h-2
→ꢀ
c-3 (d
c 93.4), c-1 (d
c 32.2)和c-4 (d
c 48.0); h-4
ꢀ→ꢀ
c-3 (d
c 93.4)和c-5 (d
c 210.5); h-3
ꢀ→ꢀ
c-7 (d
c 93.4)和c-5 (d
c 210.5)证明该环由3位和7位c之间通过一个醚健构成一个吡喃酮杂环；hmbc相关信号h-1
→ꢀ
c-1' (d
c 134.6), c-2' (d
c 116.7)和c-6' (d
c 120.9)证明双羟基取代的abx偶合系统苯环连接在c-1位上。至此，该化合物的平面结构得以确立. 其绝对构型的确立可根据文献中类似化合物的一组氢碳的化学位移判断，化合物a结构中，3位（或
co2培养箱，避光孵育48小时。结束孵育后，细胞加入mtt (储存浓度：5mg/ml) ，10
µ
l/孔，置于37℃，5% co2培养箱中孵育4小时。然后每孔加入120
ꢀµ
l dmso，震荡10 min后，在flexstation上测定570nm波长处的吸光度，按计算细胞存活率：cell growth % control = ods / aver(od
nc
)
×
100%，其中：ods：样品（待测化合物）孔的吸光值；od
nc
：阴性孔吸光值（细胞+培养基+dmso）。结果表明（见下表），化合物a、b、c、d对gbc-sd、hccc-9810、hepg2、ht29、bgc-823细增殖有不同程度的抑制作用，其中化合物d抑制作用较强；。
[0026] 实施例5本发明实施例中，mtt法检测化合物d对人肝癌细胞（hepg2）、人肝内胆管癌细胞（hccc-9810）、人结肠癌细胞（ht-29）、人胃腺癌细胞（bgc-823）的增殖影响及ic50值；mtt法检测化合物细胞毒试验方法同实施例3，化合物d给药浓度设置0.5，1.5，5，15，50，100μmol6个浓度梯度。结果表明（见下表）化合物d抑制人肝癌细胞（hepg2）、人肝内胆管癌细胞（hccc-9810），人结肠癌细胞（ht-29）和人胃腺癌细胞（bgc-823）的ic50值依次为6.24μmol，5.4μmol，6.77μmol和10.04μmol；。
[0027]
实施例6基于虚拟筛选方法，在蛋白质数据库晶体结构数据库( http: / /www.rcsb.org) 中找寻蛋白受体的结构: fxr的结构，见附图19，提取码为3dct; 配体化合物a、d结构由chemdraw绘制，所有配体提交至chem3d，使用mmp2进行能量最小化，最后提交至gaussian09，在b3lyp/6-31g*理论水平进行结构优化，小分子拟合resp电荷，采用ledock软件计算2种二苯壬烷类化合物a、d和阳性药fxr受体激动剂gw4064和上市新药奥贝胆酸（obeticholic acid）与法尼醇x受体（fxr）的结合能力。按结合能力从大到小排序，结果（附图20，下表）显示化合物a、d可能为潜在的fxr受体激动剂；
。
[0028]
实施例7本发明实施例中，srb法检测化合物d对人肝癌细胞（hepg2）的细胞毒作用，计算细胞存活率，确定最佳给药浓度。最终确定化合物a和化合物d的给药浓度梯度设置为50，25，12.5 μg/ml。将各浓度药物作用于hepg2细胞后，通过western blot实验，检测对fxr信号通路相关蛋白表达的影响，结果如附图21。测得化合物a对fxr呈浓度依赖的激活作用，化合物d对bsep呈浓度依赖的激活作用。
[0029] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
[0030]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种二苯壬烷烃类化合物或其药学上可接受的酯、氘代物、
14
c标记物、溶剂化物、代谢产物或前药，其特征在于具有如下结构的化合物a，b，c和d（r，s表示所在位置的绝对构型）；。2.一种如权利要求1所述化合物a、b、c和d的植物分离制备方法，其特征是该方法包括：用醇、水或其混合物浸泡、渗漉或者回流提取篦齿虎耳草样品，过滤后得到提取液，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将得到的提取液中的溶剂蒸发形成流浸膏；将水加入到该流浸膏中，得到总提取物的水混悬液；石油醚、类石油醚小极性溶剂或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到石油醚、类石油醚小极性溶剂或其混合物的萃取物；然后，进一步用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物；将乙酸乙酯萃取物浓缩后，进行大孔树脂层析，分别用纯水、醇∶纯水溶液(30∶70，v/v)、醇∶纯水溶液(60∶40，v/v)进行洗脱，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将醇∶纯水溶液(60∶40，v/v)进行洗脱得到的洗脱液蒸浓缩，得粗馏分en3；将粗馏分en3用小孔树脂进行柱层析，分别用纯水、醇∶纯水溶液(20∶80，v/v)进行洗脱、醇∶纯水溶液(50∶50，v/v)进行洗脱，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将醇∶纯水溶液(50∶50，v/v)洗脱得到的洗脱液蒸发至干，即得活性部位提取物en3m4；将活性部位提取物en3m4用硅胶h柱进行柱层析，依次用体积比为50∶1、40∶1、20∶1、10∶1、1:1的氯仿∶甲醇混合溶剂体洗脱，通过tlc板检测，根据tlc板显示，将相似组分合并并浓缩，根据rf值在0.6～0.2之间从大到小获得1～9九个组分；将目标组分进行反相硅胶柱（ods柱）层析，分别用纯水、甲醇∶纯水体积比为20∶80～90∶10洗脱剂进行梯度洗脱；通过uplc-ms追踪分析，将分离分子量为372的化合物所在的馏份合并并浓缩，得到1～3三个馏分；将馏分1进行高效液相制备柱层析，采用甲醇∶纯水(40∶60，v/v)洗脱剂进行洗脱，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，收集其所在色谱馏份并合并并浓缩至干，得到化合物a；
将馏分2进行凝胶柱层析，采用纯甲醇冲洗，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，合并并浓缩至干其所在馏份，得到化合物b、c的混合物，将混合物上于正相手性制备柱，采用正己烷: 乙醇（60: 40，v/v）洗脱剂冲洗，在280nm下收集先后出来的两个色谱峰得到化合物b和化合物c；将馏分3进行凝胶柱层析，采用纯甲醇冲洗，通过uplc-ms追踪分离分子量为372的化合物，合并并浓缩至干其所在馏份，得到化合物d。3.一种如权利要求1所述化合物a和d的人工合成制备方法，其特征是该方法包括：步骤1： 将 3-（3，4-二羟基苯基）丙烯酸（12g，66.6mmol，1当量）和pd/c（1.2g，0.1equiv）在35℃下，h2气氛下溶解于无水甲醇（150ml）中过夜，反应后，在真空中蒸发混合物，得到棕色固体s1（11.8g，98%）；步骤2： 将s1溶解于40ml无水甲醇中，并用冰浴冷却，通过搅拌逐滴添加乙酰氯，30分钟后移除冰浴，并在68℃下搅拌反应过夜，过滤和浓缩后，通过柱色谱法纯化粗产物，得到黄色油状产物s2（11.2 g，85%产率），将油状产物放入冰箱后变为固体， 步骤3：将干燥dmf（40 ml）中的s2（12.13 g，61.8 mmol，1当量）和咪唑缓慢添加到干燥dmf（10 ml）中的叔丁基二苯硅酰氯中，在n2气氛下：反应完成后，在rt下搅拌反应混合物5小时，用乙醇酸稀释混合物，用水冲洗混合物，然后用乙醇酸三次萃取水层；用盐水冲洗合并的有机层，用无水na2so4干燥，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=70:1）纯化粗产物，得到产品s3（21.32 g，85%产率），为黄色油状化合物；步骤4：将s3（8.13g，19.14mmol，1当量）溶解于干燥的thf（50ml）中并冷却至-20℃，然后在-20℃下缓慢添加lialh4，反应混合物在0℃下搅拌过夜，反应完成后，依次向混合物中添加h2o、sat.aq naoh、h2o进行淬火，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=30:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s4（7.2g，85%产率）步骤5：dess
–
martin periodinane混悬液在150 ml干ch2cl2的氮气气氛下冷却至0℃，将s4（13.99 g，32.9 mmol，1当量）在氮气气氛下于0℃添加至反应中，过夜，用150ml的etoac和50ml的sat稀释混合物，添加含有5%硫代硫酸钠的nahco3溶液，搅拌20分钟后，分离出透明的有机层，有机物在na2so4上干燥，过滤和浓缩后，通过柱层析（石油醚/etoac=100:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s5（11.32g，81%）；步骤6：将s7（1.19 g，3.75 mmol，1.5当量）在0℃下添加到ch2cl2（0.5 m/l）中的s5（1g，2.5 mmol，1当量）溶液中，然后将反应混合物加热至室温并搅拌，直到tlc指示完全消耗，过滤和浓缩后，通过柱色谱法（石油醚/etoac=120:1）纯化粗产物，得到黄色油状产物s6（1.3 g，79%）；
步骤7：将二异丙胺溶解在无水thf中，并在氩气气氛下将溶液冷却至0℃，然后，将n-buli[1.6 m己烷]逐滴添加到混合物中
−
78℃，将酮溶解在无水thf[1.5 m]中，置于氩气气氛下，并在室温下冷却
−
78℃，搅拌30分钟后，将酮缓慢插入lda溶液中，并在适当温度下搅拌混合物
−
78℃30分钟，然后，将醛溶解在无水thf[1 m]中，置于氩气气氛下，冷却至
−
78℃，然后缓慢插管至烯醇盐溶液，并搅拌，直到tlc显示完全消耗，然后通过添加饱和nh4cl水溶液使反应停止，并使温和剂在室温下升高，用acoet提取混合物，用盐水洗涤合并的有机层，用无水na2so4干燥，过滤，真空浓缩，并通过柱色谱（石油醚/etoac=50:1）纯化，得到黄色油状产品s8（1.1 g，55%）；步骤8. 在吡啶（1.0 ml）中添加s8（500 mg，0.6 mmol，1.0当量）到3hf-et3n（1ml，6 mmol，10当量），将反应混合物在室温氮气下搅拌30分钟后，加入中和至中性的饱和碳酸氢钠水溶液，然后，用20ml etoac稀释混合物，用饱和nacl水溶液（10ml）洗涤合并的有机层，在mgso4上干燥，过滤，并在减压下浓缩以提供残留物，使用硅胶柱ch2cl2:meoh=40:1）通过色谱法纯化残留物得s9，即化合物d（185毫克，83%）；步骤9. 将干燥ch3cn（0.5 ml）中的s9（64 mg，172μmol，1当量）和bf3
•
et2o（在0℃下搅拌30-40 min，反应完成后（通过tlc监测），用乙酰乙酸乙酯稀释混合物，使用饱和含水nahco3使反应系统的ph为中性，然后用盐水（1
×
5 ml）洗涤最后，用etoac（3
×
5 ml）冲洗水层，分离有机相并在无水na2so4上干燥，有机物在na2so4上干燥，过滤并蒸发，通过硅胶上的快速色谱法纯化残余物得s10, 即化合物a（38 mg，60%），。4.一种具有治疗消化系统中胆汁酸代谢相关疾病如胆汁淤积性肝炎、原发性胆汁性胆
管、原发性、非酒精性肝炎以及相关的癌症如肝癌，胆管癌，肝胆管癌、结肠癌及胃腺癌等的药物组合物，其特征是，所述的组合物包含治疗有效量的权利要求1所述的化合物中的一种或多种。5.根据权利要求4 所述的药物组合物，其特征是，所述的化合物来自篦齿虎耳草活性部位提取物，该活性部位提取物通过如下步骤制得：(a) 用醇、水或其混合物浸泡、渗漉或者回流提取篦齿虎耳草样品，过滤后得到提取液；其中所述的醇为甲醇或乙醇；(b) 将得到的提取液中的溶剂蒸发形成流浸膏；(c) 将水加入到该流浸膏中，得到总提取物的水混悬液；(d) 用石油醚、类石油醚小极性溶剂或其混合物对上述混悬液进行液液萃取，得到氯仿、石油醚、类石油醚的小极性溶剂或其混合物的萃取物；然后，进一步用乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯萃取物；(e) 将乙酸乙酯萃取物浓缩后，进行大孔树脂层析，分别用纯水、醇∶纯水溶液(30∶70，v/v)、醇∶纯水溶液(60∶40，v/v)进行洗脱；其中所述的醇为甲醇或乙醇；(f) 将醇∶纯水溶液(60∶40，v/v)洗脱得到的洗脱液浓缩得到得粗馏分en3 ；(g) 将粗馏分en3用小孔树脂进行柱层析，分别用醇∶纯水溶液(20∶80，v/v)、醇∶纯水溶液(50∶50，v/v)进行洗脱，其中所述的醇为甲醇或乙醇；将体积比为醇∶纯水溶液(50∶50，v/v)洗脱得到的洗脱液蒸发至干，即得活性部位提取物en3m4。6.权利要求2和5所述的篦齿虎耳草为虎耳草科虎耳草属植物篦齿虎耳草（拉丁名：saxifraga. umbellulata var. pectinata）。7.权利要求1 所述的二苯壬烷类化合物在制备药物预防/ 治疗胆汁酸、脂质代谢紊乱相关疾病中的应用，如胆汁淤积、胆汁淤积诱发的各种肝胆炎症如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪肝病，相关消化系统癌症如肝癌、胆管癌、肝胆管癌、结肠癌和胃腺癌等。8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的二苯壬烷类化合物为体内胆汁酸受体-核受体法尼醇x受体（fxr）信号通路中相关受体的激动剂或抑制剂。9.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的二苯壬烷类化合物为消化系统中肝癌、胆管癌、结肠癌和胃腺癌等癌细胞增殖的抑制剂。

技术总结
本发明属于医药化学领域，具体公开了一种二苯壬烷类化合物与其组合物及其制备方法和其在预防/治疗胆汁酸、脂质代谢紊乱相关疾病中的应用，如胆汁淤积、胆汁淤积诱发的各种肝胆炎症如原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、非酒精性脂肪肝等，相关癌症如肝癌、胆管癌、肝胆管癌、结肠癌和胃腺癌等。本发明公开的二苯壬烷类化合物为从藏药篦齿虎耳草（拉丁名：Saxifraga.umbellulata var.pectinata）中分离得到的化合物A，B，C和D，其结构如下所示。其结构如下所示。其结构如下所示。


技术研发人员：蒋伟 钟国跃 任刚 胡祥国 魏荣锐 阿都莫子力 刘建群
受保护的技术使用者：江西中医药大学
技术研发日：2021.12.13
技术公布日：2022/3/8