一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法

1.本发明属于医学实验模型研究技术领域，具体为一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法。


背景技术：

2.自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,aih)系由异常自身免疫反应所介导的肝实质炎性病变，可引发肝硬化及肝衰竭，全球总患病率介于4.0-42.9例/10万人
·
年，不同肤色及年龄段人群均可罹患。aih患者的10年累积死亡率为正常人群的2.29倍(32.3％vs 14.1％)；若合并肝硬化或门脉高压，患者的死亡风险显著升高。重症aih患者需进行肝移植以维持生命。据报道，1995年至2014年间，美国和英国进行肝移植的aih患者占全部肝移植患者的3.2％和3.6％。因此，aih被认为是除病毒性肝炎外，又一种严重危害人类健康的肝脏炎性疾病。本病的病因以及发病机制尚不清楚，目前认为是由于遗传易感性及环境诱发因素等共同作用引起的自身免疫耐受缺失，从而诱导产生以t细胞和巨噬细胞介导为主的针对肝脏抗原的免疫反应，造成肝脏组织的破坏及炎症的形成。
3.设计和建立符合人类发病过程的实验模型(包括用于在体内研究的动物模型和用于体外研究的细胞模型)是深入研究自身免疫性肝炎发病机制的基础。自身免疫性肝炎动物模型的相关研究持续了近半个世纪，已有部分动物模型得到了学界的公认。但由于自身免疫性肝炎的免疫炎性反应主要发生在肝脏，肝脏免疫微环境较为复杂，诱发自身免疫性肝炎的因素众多。对本病发病机制的研究仍需在细胞水平进行深入探讨，如研究某一个基因参与自身免疫性肝炎发病过程的机制，需对该基因进行沉默或过表达，通过回复实验，以证实该基因是否参与本病的发生发展；又如，探讨某种药物是否对自身免疫性肝炎肝损伤具有调控作用时，有必要探讨该药的作用靶点，同样需要体外细胞实验数据的支持。
4.研究发现，在自身免疫性肝炎发病过程中，巨噬细胞除可作为抗原呈递细胞参与诱导t细胞活化外，还可直接参与肝脏炎性损伤过程。因此，如果能够建立一种稳定的、易于复建且符合自身免疫性肝炎发病过程的“通过诱导巨噬细胞活化从而介导肝细胞损伤”的细胞模型，将大大地推进自身免疫性肝炎发病机制的研究进程。


技术实现要素：

5.针对目前自身免疫性肝炎的严重性以及细胞模型对自身免疫性肝炎研究的重要性，本发明提供了一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法。
6.为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
7.一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，包括以下步骤：
8.步骤1，巨噬细胞的诱导活化；
9.步骤2，建立巨噬细胞和肝细胞共培养模型。
10.进一步，所述巨噬细胞为小鼠raw 264.7巨噬细胞，肝细胞为小鼠brl3a肝细胞。
11.进一步，所述巨噬细胞和肝细胞共培养细胞模型包括巨噬细胞和肝细胞间接共培
养细胞模型、巨噬细胞和肝细胞直接共培养细胞模型。
12.进一步，所述步骤1中巨噬细胞通过刀豆蛋白a诱导活化。
13.更进一步，所述通过刀豆蛋白a诱导活化巨噬细胞的具体过程为：24孔板按照每孔1
×
106/个raw 264.7巨噬细胞进行细胞接种，每孔加入800μl高糖dmem培养基后，分别加入0-320μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a在37℃下诱导巨噬细胞0-24h。
14.所述用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a诱导巨噬细胞的最佳浓度为160μg/ml，最佳时间为12h。
15.所述巨噬细胞和肝细胞间接共培养细胞模型建立的具体方法为：将raw264.7巨噬细胞以2
×
105的密度接种到labselect transwell小室的上室，brl3a肝细胞以2
×
105的密度接种到transwell小室下室，然后将transwell小室在37℃和5％co2孵箱孵育过夜或孵育12h，将160μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a加入transwell小室的上室，诱导raw264.7巨噬细胞12h。
16.所述巨噬细胞和肝细胞直接共培养细胞模型的具体方法为：先将brl3a肝细胞以2.5
×
105的密度接种到24孔板，在37℃和5％co2孵箱孵育6h；然后将raw264.7巨噬细胞以2.5
×
105的密度接种于同一培养孔内，与brl3a肝细胞共同孵育，加入160μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a诱导12h。
17.与现有技术相比本发明具有以下优点：
18.1、本发明利用刀豆蛋白a体外诱导巨噬细胞活化以介导肝细胞损伤，在体外模拟自身免疫性肝炎的部分发病过程，以及模拟刀豆蛋白诱导的自身免疫性肝炎小鼠模型的发病机制，弥补了自身免疫性肝炎细胞模型研究的空白，有助于自身免疫性肝炎发病机制研究，以及治疗药物的筛选。
19.2、本发明将自身免疫性肝炎的发病过程进行分解，聚焦巨噬细胞诱导肝细胞损伤的机制，并通过模型的建立，发现巨噬细胞诱导活化的机制及其靶点。
20.3、本发明通过对实验条件的筛选，优化模型建立方法，使建立的模型更加稳定、有效。
21.4、本发明模型采用细胞系建立，易于复建。
附图说明
22.图1为本发明实施例方法流程图。
23.图2为con a与raw264.7巨噬细胞结合的浓度依赖性检测结果。(a)为流式细胞图；(b)为con a与raw 264.7细胞的结合率；(c)为raw 264.7细胞的活性。
24.图3为con a与raw264.7巨噬细胞结合的时间依赖性检测结果。(a)为80μg/ml cona-fitc作用的流式细胞图；(b)为80μg/ml con a与raw 264.7细胞的结合率；(c)160μg/ml cona-fitc作用的流式细胞图；(d)为160μg/ml con a与raw 264.7细胞的结合率；(e)为raw 264.7细胞的活性。
25.图4为cona对raw264.7巨噬细胞内活性氧(ros)、一氧化氮(no)和丙二醛(mda)生成的促进作用。图中(a)为cona激活raw264.7巨噬细胞，增加细胞内的ros，用活性氧分析试剂盒(dcfh-da)测定ros水平。数据以中位荧光强度(mfi)增加的百分比表示；(b)是以不同浓度的cona(0、80和160μg/ml)处理细胞12h，用griess法和tbars法测定no的含量；(c)是以
不同浓度的cona(0、80和160μg/ml)处理细胞12h，用griess法和tbars法测定mda的含量。数据显示为平均值
±
sd(n＝3,*p《0.05,**p《0.01)。
26.图5为cona对raw264.7巨噬细胞tnf-α表达的影响。(a)为不同浓度cona诱导巨噬细胞表达tnf-α的流式细胞图；(b)为不同浓度cona诱导raw264.7细胞表达tnf-α的量。
27.图6为甘露聚糖对cona与raw264.7巨噬细胞的结合的抑制作用。(a)为不同浓度甘露聚糖抑制80μg/ml cona与raw264.7巨噬细胞结合的流式细胞图；(b)为不同浓度甘露聚糖抑制80μg/mlcona与raw 264.7细胞的结合率；(c)100μg/ml甘露聚糖作用下不同时间内raw 264.7细胞的活性；(d)为不同浓度甘露聚糖抑制160μg/ml cona与raw264.7巨噬细胞结合的流式细胞图；(e)为不同浓度甘露聚糖抑制160μg/ml con a与raw 264.7细胞的结合率；(f)不同浓度甘露聚糖下raw 264.7细胞的活性。
28.图7为甘露聚糖对cona诱导巨噬细胞tnf-α表达的影响。(a)为流式细胞图；(b)100μg/ml甘露聚糖对160μg/mlcona和80μg/mlcona诱导raw 264.7细胞表达tnf-α的影响。
29.图8为con a对巨噬细胞源性tnf-α介导肝细胞损伤的影响。(a)为流式细胞图；(b)为brl3a肝细胞凋亡率。
30.图9为不同共培养方法对巨噬细胞源性tnf-α介导肝细胞损伤的影响。(a)和(b)表示80μg/ml cona对肝细胞损伤的影响。(c)和(d)表示160μg/mlcona对肝细胞损伤的影响。(e)和(f)表示在160μg/mlcona孵育12h的条件，直接共培养方式与间接共培养方式对肝细胞损伤的影响。
具体实施方式
31.下面结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行具体、详细的说明。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
32.实验材料：小鼠raw 264.7巨噬细胞样细胞株，小鼠brl3a肝细胞株，异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a(cona-fitc)，甘露聚糖，tnf-αantibody，胎牛血清，高糖dmem培养基，青霉素/链霉素混合液，二甲基亚砜，labselect transwell小室等。
33.实施例1
34.cona诱导巨噬细胞活化：通过cona与巨噬细胞结合的浓度依赖性检测和cona与巨噬细胞结合的时间依赖性检测确定cona诱导巨噬细胞活化的最佳实验条件。
35.1、cona与巨噬细胞结合的浓度依赖性检测：24孔板按照每孔1
×
106/个raw264.7巨噬细胞进行细胞接种，每孔加入800μl高糖dmem培养基后，依次按0、5、10、20、40、80、160、320μg/ml的浓度加入cona-fitc，并诱导巨噬细胞12h后，采用流式细胞仪检测fitc
+
raw 264.7细胞数；同时，进行cck-8实验，检测不同cona浓度对raw 264.7巨噬细胞活性的影响。从而确定cona诱导巨噬细胞活化的最佳浓度。
36.图2为con a与raw264.7巨噬细胞结合的浓度依赖性结果图，从图中可以看出：160μg/ml的con a与raw 264.7细胞具有最高的结合率(a和b)。cck8实验结果显示，随着con a浓度的逐渐，raw264.7巨噬细胞的活性逐渐升高，当con a浓度为160μg/ml时，raw264.7巨噬细胞的活性达到峰值。当cona浓度增加至320μg/ml时，细胞活性下降(c)。
37.2、cona与巨噬细胞结合的时间依赖性检测：24孔板按照每孔1
×
106/个raw 264.7
巨噬细胞进行细胞接种，每孔加入800μl高糖dmem培养基后，并分别按80μg/ml、160μg/ml的浓度加入cona-fitc，在37℃下分别刺激巨噬细胞0h、3h、6h、12h、24h，采用流式细胞仪检测fitc
+
raw 264.7细胞数；同时，进行cck-8实验，检测cona刺激时间对raw 264.7巨噬细胞活性的影响。从而确定cona诱导巨噬细胞活化的最佳时间。
38.图3为con a与raw264.7巨噬细胞结合的时间依赖性结果图。从图3可以看出：80μg/mlcona与160μg/mlcon a均在24h时，与raw264.7细胞的结合率最高，表明con a与巨噬细胞表面甘露糖受体的结合具有时间依赖性(a-d)。cck8实验结果显示，随着con a作用时间的延长，raw264.7巨噬细胞的活性逐渐升高，con a作用12h时，raw264.7巨噬细胞的活性达到峰值。当cona作用时间至24h时，细胞活性下降(e)。因此，在随后的实验中将con a的作用时间限制在12h以内。
39.图4为cona对raw264.7细胞内活性氧(ros)、一氧化氮(no)和丙二醛(mda)生成的促进作用。(a)(b)和(c)为以不同浓度的cona(0、80和160μg/ml)处理细胞12h，用griess法和tbars法测定no、mda含量，以及用流式细胞仪检测ros结果，从图中可得：当cona的浓度为160μg/ml时，氧化应激反应产物(如ros、mda、no)的含量达最高。
40.图5为cona浓度对巨噬细胞tnf-α表达的影响。从图中可以看出：与正常组相比，cona-fitc浓度80μg/ml组与cona-fitc浓度160μg/ml组raw264.7细胞的tnf-α表达均显著升高，且cona-fitc浓度160μg/ml组高于cona-fitc浓度80μg/ml组。
41.综合可得：最终确定用160μg/mlcona-fitc刺激raw 264.7巨噬细胞12h时，con a与raw 264.7细胞的结合率，raw 264.7细胞的活性达到最佳状态；同时，raw 264.7巨噬细胞表达的细胞因子(tnf-α)和氧化应激反应产物(如ros、mda、no)的含量达最高。
42.实施例2
43.甘露聚糖抑制cona诱导巨噬细胞活化的检测：
44.甘露聚糖抑制cona诱导巨噬细胞活化：cona作为一种能识别的凝集素，能够与α-d-甘露醇和α-d-葡萄糖基结合。推测cona可能通过巨噬细胞表面的甘露糖受体结合，将特定的信号传递至细胞内，引起一系列的信号级联反应，调控相关基因表达和相关细胞因子的分泌。本实验拟通过加入甘露糖受体的特异性阻断剂甘露聚糖，以探讨cona与巨噬细胞结合的机制及靶点。
45.实验方法：24孔板按照每孔1
×
106/个raw 264.7巨噬细胞进行细胞接种，每孔加入800μl高糖dmem培养基后，实验组加cona-fitc(80、160μg/ml)dmem溶液诱导12h；抑制剂组先用甘露聚糖(0、25、50、100、200、400μg/ml)预处理12h，再加cona-fitc dmem溶液诱导12h。采用流式细胞仪检测fitc
+
raw 264.7细胞数。
46.图6为甘露聚糖对cona与raw264.7巨噬细胞结合的抑制作用。可以得出：25μg/ml的甘露聚糖即可显著抑制80μg/ml cona与raw264.7细胞的结合，200μg/ml的甘露聚糖即可到达饱和抑制；而50μg/ml的甘露聚糖才可显著抑制160μg/ml cona与raw264.7细胞的结合。
47.图7为100μg/ml甘露聚糖对cona诱导巨噬细胞tnf-α表达的影响。结果为加入100μg/ml甘露聚糖后，cona诱导巨噬细胞表达tnf-α的水平显著下降。
48.综合实验结果表明：cona诱导巨噬细胞活化可以被100μg/ml甘露聚糖(mmr)明显抑制，表明con a诱导raw 264.7巨噬细胞活化的机制与甘露糖受体有关(mmr为甘露糖受体
的抑制剂)。表明，cona诱导巨噬细胞活化后，介导肝细胞损害的机制与诱导巨噬细胞表达细胞因子以及诱发氧化应激反应有关。
49.实施例3
50.巨噬细胞/肝细胞共培养模型的建立
51.1、间接共培养模型的建立：将raw264.7巨噬细胞以2
×
105的密度接种到labselect transwell小室的上室，brl3a肝细胞以2
×
105的密度接种到transwell小室的下室。然后将transwell小室24孔培养板在37℃和5％co2孵箱孵育过夜。将160μg/ml浓度的cona-fitc加入transwell小室的上室诱导12h后，收集室内的培养基，用于检测转氨酶、氧化应激产物及肿瘤坏死因子(tnf)-α的含量。用pbs冲洗raw264.7巨噬细胞两次，以消除残留的培养基，用于细胞凋亡检测。
52.2、直接共培养模型的建立：先将brl3a肝细胞以2.5
×
105的密度接种到24孔板，在37℃和5％co2孵箱孵育6h；然后raw264.7巨噬细胞以2.5
×
105的密度接种于同一培养孔内，与brl3a肝细胞共同孵育，加入160μg/ml的cona-fitc处理12h后，收集上清液，用于检测转氨酶、氧化应激产物及肿瘤坏死因子(tnf)-α的含量。
53.图8为con a对巨噬细胞源性tnf-α介导肝细胞损伤的影响。采用0、160μg/mlcona-fitc与raw264.7细胞孵育12h，结果显示：cona160μg/ml组的肝细胞凋亡细胞数(％)显著高于对照组(流式细胞检测)。
54.图9为不同共培养方法对巨噬细胞源性tnf-α介导肝细胞损伤的影响。结果表明：a-b：与空白组相比，80μg/mlcona引起肝细胞损伤较轻，仅见alt活性的升高。c-d：与空白组相比，160μg/mlcona引起肝细胞损伤较重，ast、alt活性均升高；e-f：在相同条件下(160μg/mlcona孵育12h)，与间接共培养相比(transwell)，直接共培养方式造成肝细胞的损伤较重。
55.综合结果表明：raw264.7巨噬细胞与brl3a肝细胞间接共培养时，肝细胞的损伤程度较轻；raw264.7巨噬细胞与brl3a肝细胞进行直接共培养时，肝细胞的损伤程度较重。因此，在今后研究自身免疫性肝炎发病早期的肝细胞损伤机制时，可以考虑使用间接共培养方式；如拟研究自身免疫性肝炎发病晚期或重症肝损伤机制时，可以考虑使用直接共培养方式。
56.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

技术特征：
1.一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，巨噬细胞的诱导活化；步骤2，建立巨噬细胞和肝细胞共培养模型。2.根据权利要求1所述的用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于：所述巨噬细胞为小鼠raw 264.7巨噬细胞，肝细胞为小鼠brl3a肝细胞。3.根据权利要求1所述的用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于：所述巨噬细胞和肝细胞共培养细胞模型包括巨噬细胞和肝细胞间接共培养细胞模型、巨噬细胞和肝细胞直接共培养细胞模型。4.根据权利要求1所述的用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于：所述步骤1中巨噬细胞通过刀豆蛋白a诱导活化。5.根据权利要求4所述的用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于，所述通过刀豆蛋白a诱导活化巨噬细胞的具体过程为：24孔板按照每孔1
×
106/个raw 264.7巨噬细胞进行细胞接种，每孔加入800μl高糖dmem培养基后，分别加入0-320μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a在37℃下诱导巨噬细胞0-24h。6.根据权利要求5所述的用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于：所述用异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a诱导巨噬细胞的最佳浓度为160μg/ml，最佳时间为12h。7.根据权利要求3所述的用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于，所述巨噬细胞和肝细胞间接共培养细胞模型建立的具体方法为：将raw264.7巨噬细胞以2
×
105的密度接种到labselect transwell小室的上室，brl3a肝细胞以2
×
105的密度接种到transwell小室的下室，然后将transwell小室在37℃和5％co2孵箱孵育过夜或孵育12h，将160μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a加入transwell小室的上室，诱导raw264.7巨噬细胞12h。8.根据权利要求3所述的用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法，其特征在于，所述巨噬细胞和肝细胞直接共培养细胞模型的具体方法为：先将brl3a肝细胞以2.5
×
105的密度接种到24孔板，在37℃和5％co2孵箱孵育6h；然后将raw264.7巨噬细胞以2.5
×
105的密度接种于同一培养孔内，与brl3a肝细胞共同孵育，加入160μg/ml的异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白a诱导12h。

技术总结
本发明属于医学实验模型研究技术领域，针对目前自身免疫性肝炎的严重性以及细胞模型对自身免疫性肝炎研究的重要性，公开了一种用于研究自身免疫性肝炎的细胞模型的建立方法。通过采用刀豆蛋白A诱导小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7巨噬细胞株，并将RAW 264.7巨噬细胞株与BRL3a小鼠肝细胞共培养，在体外模拟自身免疫性肝炎发病过程中巨噬细胞对肝细胞造成炎性损伤的过程，建立了巨噬细胞/肝细胞共培养模型。弥补了自身免疫性肝炎细胞模型研究的空白，将自身免疫性肝炎的发病过程进行分解，聚焦巨噬细胞诱导肝细胞损伤的机制，有助于自身免疫性肝炎发病机制研究，以及治疗药物的筛选。选。选。


技术研发人员：刘杨 郝慧琴 李振城 侯艺文 侯铁铮
受保护的技术使用者：山西中医药大学
技术研发日：2021.11.15
技术公布日：2022/3/8