一种新型冠状病毒中和抗体快速定量检测方法及应用与流程

1.本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种新型冠状病毒中和抗体快速定量检测方法及应用。


背景技术：

2.冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具外套膜(envelope)的正链单股rna病毒，直径约80～120nm，其遗传物质是所有rna病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、猪、猫、穿山甲、犬、狼、鸡、牛、蛇类、禽类等脊椎动物。2019新型冠状病毒(sars-cov-19,曾用名2019-ncov)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、sars-cov和mers-cov。研究表明，其中sars-cov-19、sars-cov和hcov-nl63是通过病毒包膜spike glycoprotein(s-protein)介导病毒与宿主细胞膜上的ace2受体相互作用来感染人的。现有的冠状病毒核酸检测方法包括全基因组测序、rt-pcr法、crispr、逆转录环介导等温扩增法(rt-lamp)和实时rt-lamp等。
3.防治新冠肺炎最直接和有效的方法是接种疫苗，通过接种新型冠状病毒疫苗，诱发机体产生抗新型冠状病毒的抗体，从而保护机体免受新型冠状病毒侵染。但是，无论是感染病毒后产生的自然免疫，还是接种疫苗后的人工免疫，并非病毒或疫苗诱生的所有抗体都能起到保护作用，只有那些能够阻断病毒和人体细胞结合的抗体才能起到较好的保护作用，这种抗体通常被称为中和抗体。世界卫生组织(who)通过国际实验室间的协作标定，发布了新冠抗体的第一代国际标准品(nibsc code:20/136)，确定了中和抗体的国际单位浓度，为后续定量研究奠定了基础。
4.目前，对疫情中或疫情后流行病血清学调查主要是检测血清总抗体；但如果能同时检测出中和抗体的含量则对预后及再次感染的风险评估具有重要意义。同样，对于接种疫苗后如果能在检测总抗体的同时检测中和抗体的含量，则对评估疫苗的效果及是否需要和何时再次免疫具有重要意义。然而有些免疫功能较弱的病人可能抗体量很低，容易造成假阴性。在新冠病毒感染之初，如果病原体抗原含量也较低，同样会因不容易检测而导致假阳性或者漏检。《新型冠状病毒预防用疫苗临床评价指导原则》中指出为确保上市广泛应用的新冠疫苗能产生预期的效果，有效性评价的主要终点应为预防covid-19发病，目标人群的保护效力最好能达到70％以上。疫苗上市后，应继续观察在大范围接种情况下的安全性和临床保护效果，并对保护持久性继续进行研究。传统评价疫苗的方法是通过中和实验，采用活病毒来验证中和抗体的效能。操作复杂，耗时长，风险高，给大规模开展人群接种疫苗效果评价带来很大不便。因此，急需建立一种易操作、快速、便捷、定量准确的中和抗体检测方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的是建立一种新型冠状病毒中和抗体快速定量检测方法，利用胶体金
免疫层析分析仪、中和抗体胶体金免疫层析试纸条，采用国际标准品建立的标准曲线法对全血、血清、血浆等样品中新冠中和抗体进行定量检测。本发明以创新性的检测方法改进实现了胶体金试纸条的定量检测，该方法操作简便、快速、灵敏度高且重复性好，具有突出的技术优势。
附图说明
6.图1是四参数拟合中和抗体定量标准曲线。
具体实施方式
7.本发明所述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明提供的检测方法具体步骤如下：
8.1)标准曲线的建立
9.国际标准品(20/136)的指定效力为250iu/安瓿，按说明书要求将其溶解在0.25ml的蒸馏水中，其最终浓度为1000iu/ml，再进行后续假病毒中和试验。
10.首先将新冠中和抗体标准品进行6个梯度的稀释，按要求使用新冠中和抗体试纸条进行测试，每个梯度分别测试5组，分别将每次检测的试纸条放入胶体金免疫层析分析仪中读取胶体金反应值。结果如下表所示：
11.表1不同浓度中和抗体的胶体金反应值
[0012][0013]
在胶体金免疫分析仪上位机软件上，将中和抗体浓度(iu/ml)与胶体金平均反应值进行“四参数增长”拟合，得到四参数拟合中和抗体定量标准曲线见图1。
[0014]
表2四参数拟合中和抗体定量标准曲线参数及结果
[0015][0016]
2)cut off值的界定
[0017]
将样本进行连续稀释，加入到胶体金试纸条上，经胶体金分析仪检测后，得到胶体金反应值结果如下表3。
[0018]
表3不同浓度中和抗体对应的胶体金反应值
[0019]
中和抗体浓度(iu/ml)胶体金反应值0.105380.043740.0300.0200.043710.043670.043750.043590.043660.0200.0200.0200.0200.020
[0020]
由上表可以看出，中和抗体浓度等于0.04iu/ml时，胶体金反应值为374，低于0.04iu/ml时，仪器检测的胶体金反应值为0；然后分别重复测试5次0.04iu/ml和0.02iu/ml两种中和抗体浓度，高于或等于0.04iu/ml时，仪器检测的胶体金反应值为阳性；低于0.04iu/ml时，仪器检测的胶体金反应值为阴性，因此将cut off值定为0.04iu/ml。
[0021]
3)定量检测
[0022]
将试剂曲线录入到胶体金分析仪中，对10份系列浓度国际标准品进行测试，得出相对应的胶体金反应值，运用四参数拟合中和抗体定量标准曲线，计算得出中和抗体浓度值，并与国际标准品理论浓度计算相对误差，确定定量检测的精密度。不同样本的中和抗体测定值结果及精密度结果见表4。
[0023]
表4不同样本的中和抗体测定值及精密度结果
[0024][0025]
由上表可以看出，4个浓度的国际标准品测得的中和抗体浓度的相对标准偏差(rsd)不高于14％，证明重复性较好。
[0026]
所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改或对其部分技术特征进行等同替换,在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，并保留所有权利，均属于本发明要求保护的范围。


技术特征：
1.一种新型冠状病毒中和抗体快速定量检测方法及应用，其特征在于，利用胶体金免疫层析分析仪、胶体金免疫层析试纸条，采用标准曲线法进行新冠中和抗体定量检测。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，采用的标准曲线法为：将新冠中和抗体国际标准品进行梯度稀释后分别滴加20ul到试纸条中，随后滴加60ul稀释液，将试纸条放入胶体金免疫层析分析仪中读取原始反应值，将稀释后国际标准品的“浓度”值与原始反应值进行“四参数增长”拟合，每个梯度分别测试5组，得到平均拟合曲线。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法包括：将国际标准品获得的平均拟合曲线录入到胶体金免疫层析分析仪软件系统中，作为定量检测的标准曲线。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，方法的cut off值为0.04 iu/ml。5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，待测样本加入到试纸条中，滴入稀释液，将该试剂卡放入胶体金免疫层析分析仪中读取原始反应值，软件系统根据原始反应值，利用标准曲线，得出新冠中和抗体效价“浓度”值。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，对全血、血清、血浆等样品中新冠中和抗体进行定量检测。

技术总结
本发明公开了一种新型冠状病毒中和抗体快速定量检测方法，利用胶体金免疫层析分析仪、胶体金免疫层析试纸条，采用国际标准品建立的标准曲线法对全血、血清、血浆等样品中新冠中和抗体进行定量检测。本发明以创新性的检测方法改进实现了胶体金试纸条的定量检测，该方法操作简便、快速、灵敏度高且重复性好，具有突出的技术优势。突出的技术优势。突出的技术优势。


技术研发人员：刘强 吕晶 赵博 鲍勇刚 齐香荣 余小玲 李珮瑶 夏青海 裴峥 郭丽仙 刘晓娇
受保护的技术使用者：北京博辉瑞进生物科技有限公司 北京中检安泰诊断科技有限公司
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2022/3/8