玉米耐旱基因的KASP分子标记的开发及应用

玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发及应用
技术领域
1.本发明涉及玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发及应用，属于生物技术领域。


背景技术：

2.玉米是我国最重要的粮食作物和经济作物，同时也是重要的能源和工业原料。据国家统计局数据显示，2019年我国玉米播种面积达41284.06千公顷，产量达26077.89万吨。西北、华北、东北等地区是我国主要的玉米产区，但多为旱地，水分蒸发量大、流失快，导致玉米产量严重受损。干旱已然成为影响我国粮食产量的较大因素之一，培育耐旱玉米品种是解决干旱问题最经济有效的途径。
3.截至目前，已报道了部分耐旱基因，如nced基因、rab28基因、dhn1基因和rsp41基因等。同时，也开发了与基因连锁的分子标记，通过分子标记辅助选择技术(marker-assisted selection，mas)进行玉米耐旱改良育种，弥补了传统育种中出现的诸多弊端，成为解决耐旱品种选育难这一问题的有效途径。
4.然而，玉米耐旱相关基因的连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但多为caps标记、ssr标记、indel标记或酶切标记，检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，不适用于高通量的分子检测平台。因此，开发低成本、可高通量检测的分子标记是促进玉米耐旱基因鉴定、增加耐旱育种准确度与提高育种效率的迫切需求。
5.kasp(kompetitive allele-specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可快速检测snp位点。与ssr、rflp、indel等分子标记相比，kasp标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，kasp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发低成本、适合于高通量分子检测平台的玉米耐旱基因kasp分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国玉米耐旱育种效率和育种水平具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明针对上述背景技术所提及的技术问题，而采用以下技术方案来实现：
7.玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发方法，包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米耐旱；所述基因型为玉米基因组中kasp_rsp位点的基因型；所述kasp_rsp位点是玉米基因组中的一个snp位点，位于玉米5号染色体的第73851206位，所述snp位点是核苷酸种类为c或者t，为seq id no.4的第51位核苷酸；
8.所述kasp_rsp位点的基因型为cc基因型的待测玉米为耐旱或者候选为耐旱玉米；所述kasp_rsp位点的基因型为tt基因型或者ct基因型的待测玉米为不耐旱或者候选为不耐旱玉米；其中，所述cc基因型表示玉米基因组中所述kasp_rsp位点的核苷酸种类为c的纯合型；所述tt基因型表示玉米基因组中所述kasp_rsp位点的核苷酸种类为t的纯合型；所述ct基因型表示玉米基因组中所述kasp_rsp位点的核苷酸种类为c和t的杂合型。
9.玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发方法而提出的应用，所述应用包括以下几个方面：
10.1)、所述kasp_rsp位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米耐旱中的应用；
11.2)、所述kasp_rsp位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米耐旱的产品中的应用；
12.3)、所述kasp_rsp位点的多态性或基因型的物质在玉米辅助育种或制备玉米辅助育种产品中的应用。
13.玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发方法而提出的玉米育种方法，包括以下步骤：
14.包括选择权利要求1中所述kasp_rsp位点的基因型为cc的玉米作为亲本进行育种，所述cc基因型表示玉米基因组中所述kasp_rsp位点的核苷酸种类为c的纯合型；所述玉米育种可为培育耐旱玉米。
15.玉米耐旱基因的kasp分子标记的开发方法而生产出的产品，主要包括以下几种产品，
16.c1)检测与玉米耐旱相关的snp多态性或基因型的产品；
17.c2)鉴定或辅助鉴定玉米耐旱的产品；
18.c3)用于玉米辅助育种的产品。
19.作为优选实例，所述kasp_rsp位点多态性或基因型的物质为如下d1)、d2)或d3)：
20.d1)所述检测权利要求1中kasp_rsp位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述kasp_rsp位点在内的玉米基因组dna片段的pcr引物；
21.d2)所述检测权利要求1中kasp_rsp位点的多态性或基因型的物质为含有所述pcr引物的pcr试剂；
22.d3)含有d1)所述pcr引物或d2)所述pcr试剂的试剂盒。
23.作为优选实例，所述pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seq id no.1的第22-44位的单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.2的第22-44位的单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna组成的引物组。
24.作为优选实例，所述pcr引物为由序列表中seq id no.1所示的单链dna、序列表中seq id no.2所示的单链dna和由序列表中seq id no.3所示的单链dna的引物组。
25.本发明的有益效果是：本发明提供了一种玉米耐旱基因rsp41紧密连锁的kasp标记开发与应用，所述分子标记是与玉米耐旱基因rsp41紧密连锁的kasp标记kasp_rsp。该标记基于kasp技术开发，可高通量检测玉米基因组5号染色体的第73851206位碱基。本发明应用kasp技术对玉米耐旱基因rsp41进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测玉米耐旱基因rsp41，对促进玉米耐旱育种具有重要意义。
附图说明
26.图1为实施例1利用分子标记kasp_rsp检测8份测试玉米品种材料的分型图，其中，fam表示基因型为tt，vic表示基因型为cc，h表示基因型为ct；
27.图2为实施例2利用分子标记kasp_rsp检测48份f2测试群体的分型图，其中，fam表示基因型为tt，vic表示基因型为cc，h表示基因型为ct。
具体实施方式
28.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
29.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.下述实施例中所使用的玉米品种均可从商业途径得到。
31.本发明通过文献挖掘到一个与玉米耐旱相关的snp位点(liu s,hao z,weng j,et al.identification of two functional markers associated with drought resistance in maize[j].molecular breeding,2015,35(1):1-10.)，该位点锚定在玉米5号染色体的第73851206位(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/gcf_902167145.1/，基因组版本zm-b73-reference-nam-5.0)，该snp侧翼序列如seq id no.4所示。kasp_rsp位于seq id no.4的第51位，该处的核苷酸序列为c或t。
[0032]
下述cc基因型表示kasp_rsp的核苷酸序列为c的纯合型；tt基因型表示kasp_rsp的核苷酸序列为t的纯合型；ct基因型表示kasp_rsp的核苷酸种类为c和t的杂合型。
[0033]
实施例1
[0034]
与玉米耐旱相关基因rsp41紧密连锁kasp标记开发
[0035]
1.引物的设计：根据kasp_rsp位点提取左右各50bp的侧翼序列，优选利用primer3.0软件设计3组kasp引物。利用douglas scientific公司arraytape平台检测后，挑选出1套多态性良好的kasp引物用于后续验证。
[0036]
用于检测kasp_rsp的kasp引物具体如下：
[0037]
primer x：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgcatagtagacaagtttcctgcc-3’(seq id no.1，小写字母部分为特异荧光标签序列vic)；
[0038]
primer y：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctgcatagtagacaagtttcctgct-3’(seq id no.2，小写字母部分为特异荧光标签序列fam)；
[0039]
primer r：5
’‑
tgtgcaagttggtaatgttagcc-3’(seq id no.3)。
[0040]
2.dna提取：采用常规ctab法从玉米叶片中提取基因组dna。
[0041]
3.kasp反应测试
[0042]
kasp标记扩增及反应体系：
[0043]
(1)荧光定量pcr仪ab-q6 flex检测：
[0044]
5μl pcr荧光定量仪检测反应体系包括：基因组dna 50ng，引物混液0.07μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol
·
l-1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l-1 30μl，ddh2o 46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(low rox)2.5μl。按照荧光定量pcr仪ab-q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
[0045]
以上反应体系为ab-q6 flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0046]
(2)选择douglas scientific公司arraytape平台检测
[0047]
1.6μl pcr arraytape平台检测反应体系包括：含基因组dna 50ng/μl0.8μl，引物混液0.03μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol
·
l-1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l-1 30μl,ddh2o46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(std rox)0.8μl。根据arraytape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
[0048]
以上反应体系为douglas scientific公司arraytape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0049]
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
[0050]
其中，2
×
kasp mix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真taq酶，dntp，mg2+等组成。荧光探针a的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’，5’末端连接一个vic荧光基团；荧光探针b的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’，其5’端连接一个fam荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq；淬灭探针b的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq。
[0051]
扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火60s，设置40个循环。
[0052]
实验同时设置反应体系中不添加模板dna的空白对照(ntc)，每个板设置1个或多个空白对照。
[0053]
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测玉米基因组中kasp_rsp位点的基因型(即检测玉米基因组5号染色体的第73851206位碱基是c还是t)，若所述待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近x轴(vic信号)，则待测玉米基因组中kasp_rsp位点的基因型为cc纯合型(即玉米基因组5号染色体的第73851206位碱基为c纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近y轴(fam信号)，则待测玉米基因组中kasp_rsp位点的基因型为tt纯合型(即玉米基因组5号染色体的第73851206位碱基为t纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析位于x轴和y轴中间(vic和fam信号)，则待测玉米基因组中kasp_rsp位点的基因型为ct杂合型(即玉米基因组第5号染色体的第73851206位碱基为ct杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。
[0054]
5.标记分型数据分析
[0055]
为了验证kasp_rsp标记的可靠性，对8份玉米材料进行田间鉴定，获得材料的田间耐旱数据。材料基因型采用douglas scientific公司arraytape平台进行检测，检测方法、反应体系以及扩增程序按照上述优选方案实行。
[0056]
扩增结果表明，kasp_rsp标记在8份材料中能够获得稳定的pcr产物，并且能够检测到c和t两个等位位点(图1)。一份耐旱玉米材料均为cc基因型，七份不耐旱玉米材料均为tt基因型。由此，可看出kasp_rsp标记可用于不同耐旱玉米的选育工作。
[0057]
因此，本发明所述的kasp_rsp标记可用于玉米耐旱相关基因rsp41的分子标记辅助育种。
[0058]
表1.8份测试玉米材料的耐旱表型与基因型信息
[0059]
材料名称耐旱性基因型材料名称耐旱性基因型辽173mtt郑30mtt昌-3mtt黄早四mtt郑22mttb73rcc郑28rcc丹340mtt
[0060]
注：cc，基因型为c的纯合型；tt，基因型为t的纯合型；ct，基因型为c和t的杂合型；
‘
*’表示无检测信号；hr表示高耐旱；r表示耐旱；m表示不耐旱；hm表示高不耐旱。
[0061]
实施例2
[0062]
与玉米耐旱相关基因rsp41紧密连锁的kasp标记在分子标记辅助选择玉米耐旱植株中的应用
[0063]
为检测本发明kasp_rsp标记的实用性，将表1所述的玉米耐旱材料b73(作为父本)与玉米不耐旱材料昌-3(作为母本)杂交配制f2分离群体，对f2分离群体进行kasp标记检测和耐旱表型统计(检测结果见图2、表2)，标记检测和耐旱鉴定实施方法参考实施例1。通过对分离群体的耐旱与基因型进行统计分析，仅4株材料表型与基因型不符，表型与基因型的一致性p＝91.67％(一致性p＝表型与基因型相符的植株数/总植株数*100％)。上述结果表明标记
[0064]
kasp_rsp在玉米耐旱植株筛选中具有较高的实用性。
[0065]
表2.玉米分离群体的表型与基因型信息
[0066]
材料编号耐旱性基因型材料编号耐旱性基因型733_f2_01mct733_f2_25hmct733_f2_02mct733_f2_26mct733_f2_03rcc733_f2_27mct733_f2_04mct733_f2_28mtt733_f2_05hrcc733_f2_29mtt733_f2_06mct733_f2_30mct733_f2_07mct733_f2_31mct733_f2_08rct733_f2_32mct733_f2_09mct733_f2_33mtt733_f2_10mct733_f2_34mct733_f2_11hmct733_f2_35rcc733_f2_12mct733_f2_36mcc733_f2_13mct733_f2_37mtt733_f2_14rcc733_f2_38mtt733_f2_15mct733_f2_39mtt733_f2_16mct733_f2_40mct733_f2_17rcc733_f2_41mtt
733_f2_18mtt733_f2_42hmtt733_f2_19mct733_f2_43rcc733_f2_20mct733_f2_44rcc733_f2_21mcc733_f2_45hrcc733_f2_22rcc733_f2_46mct733_f2_23mtt733_f2_47mct733_f2_24rtt733_f2_48mct
[0067]
注：cc，基因型为c的纯合型；tt，基因型为t的纯合型；ct，基因型为c和t的杂合型；
‘
*’表示无检测信号；hr表示高耐旱；r表示耐旱；m表示不耐旱；hm表示高不耐旱。
[0068]
以上对本发明进行了详述，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
id no.1所示的单链dna、序列表中seq id no.2所示的单链dna和由序列表中seq id no.3所示的单链dna的引物组。

技术总结
本发明公开了玉米耐旱基因的KASP分子标记的开发及应用，属于生物技术领域。它包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉米耐旱；所述基因型为玉米基因组中KASP_RSP位点的基因型；所述KASP_RSP位点是玉米基因组中的一个SNP位点。本发明提供了一种玉米耐旱基因RSP41紧密连锁的KASP标记开发与应用，所述分子标记是与玉米耐旱基因RSP41紧密连锁的KASP标记KASP_RSP。该标记基于KASP技术开发，可高通量检测玉米基因组5号染色体的第73851206位碱基。本发明应用KASP技术对玉米耐旱基因RSP41进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测玉米耐旱基因RSP41，对促进玉米耐旱育种具有重要意义。对促进玉米耐旱育种具有重要意义。对促进玉米耐旱育种具有重要意义。


技术研发人员：王军 柴文波 许翰元 李淑芬 祝庆 迟铭 李洪涛
受保护的技术使用者：连云港市农业科学院
技术研发日：2021.12.02
技术公布日：2022/3/8