真核细胞S-腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统

真核细胞s-腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统
技术领域
1.本发明属于生化检测领域，尤其涉及一种真核细胞s-腺苷甲硫氨酸浓度实时感知荧光报告系统。


背景技术：

2.在蛋氨酸循环中，sam具有重要的作用。甲硫氨酸腺苷转移酶(mat)催化蛋氨酸与atp形成sam，在转甲基反应中，sam的甲基基团转移到不同的生物受体过程中，转变成s-腺苷高半胱氨酸(sah)。sah在水解酶作用下进一步转变成高半胱氨酸(hcy)和腺苷。高半胱氨酸有两种命运：被重新甲基化以再生蛋氨酸，或进入转硫途径被转化为半胱氨酸和α-酮丁酸酯。从生理学方面来看sam作为甲基供体，参与dna、rna和蛋白甲基化。其中的甲基可转移到c，s,n，o原子中，参与到合成与代谢过程中。此外，多种含硫物质的合成均离不开sam的辅助，在转硫作用的影响下，sam会产生大量半胱氨酸，经代谢转化为谷胱甘肽，谷胱甘肽是人体的硫储存库。sam经过脱羧反应后，生产经过脱羧处理后形成多胺，如腐胺，亚精胺，精胺等，促进组织生长。sam在转甲基作用的影响下，可促进磷脂的甲基化，调节细胞膜的流动，在转硫途径中，生成的gsh是细胞主要的抗氧化剂。sam脱羧形成的多胺可促进细胞再生，多胺的缺乏会影响细胞的正常分裂与dna合成。
3.sam是所有细胞中的重要中间代谢产物，特别是在甲基和丙氨基生物转化中起到了核心作用。在大肠杆菌中，metj作为抑制因子，它控制参与蛋氨酸生物合成和转运的基因的表达。sam与metj的结合调节了metj在细胞中的功能。当蛋氨酸丰富时，sam积累促进sam-metj-蛋白质复合物的形成，两个metj二聚体与dna双链体结合，抑制met生物合成和转运的基因的表达。研究人员在大肠杆菌体外实验中，验证出不同浓度sam情况下，metj对不同met-box的结合力不同，此实验结果表明大肠杆菌中的蛋氨酸代谢机制在体外同样可靠(augustus am,sage h,spicer ld.binding of metj repressor to specific and nonspecific dna and effect of s-adenosylmethionine on these interactions.biochemistry.2010apr；49(15):3289-3295.)。虽然甲基化修饰的研究已经取得很多进展，但是人们对甲基化修饰涉及到的基因网络集群的整体认识还不全面,尤其在相关疾病的形成和治疗靶点的选择方面还存在一定的空白有待进一步的研究。
4.很多疾病的形成和治疗都与sam失调相关，如阿尔茨海默病、抑郁症、hiv相关神经功能障碍/痴呆、多发性硬化症、帕金森病、慢性肝功能障碍、动脉硬化和癌症等。研究表明；sam供给失衡会导致肝脏细胞基因表达改变，引发肝癌。sam是大脑中多种甲基化反应的甲基供体，包括参与神经递质代谢的甲基反应，而缺乏神经递质和抑郁症有关，而高半胱氨酸的水平升高会引发阿茨海默氏病。此外，sam与肿瘤密切相关。肿瘤的标志为低甲基化，sam浓度降低，通过提高sam浓度可以在一定程度上抑制肿瘤发生。


技术实现要素：

5.机体内的sam供给平衡是非常重要的，但是活细胞内进行sam浓度测定还处于空
白。本发明的技术方案通过结合大肠杆菌蛋氨酸代谢调控机制、aavs1等位基因定点插入、转录组学分析等提供一种实时感知真核细胞sam浓度的系统，同时也获得了一个可用于全基因组筛选调控sam代谢的相关基因的系统，将为探究与sam循环相关的潜在基因以及疾病形成提供基础。
6.发明人发现了适合检测机体内sam浓度安全灵敏的方法，该发现对于进一步探究sam代谢失调相关疾病治疗基因靶点提供研究基础。
7.本发明所述的候选序列的核苷酸序列如seq id no:1-10所示,即表1所示；所述的优选序列的核苷酸序列如seq id no:4和seq id no:9所示，即表1中的3nat和ns44序列。
8.具体的，本发明的技术方案如下：
9.本发明的第一个方面公开了一种实时感知真核细胞sam浓度的系统,其特征在于，构建方法为：
10.(1)分别构建aavs1_hygro_cmv_3nat_egfp和aavs1_hygro_cmv_ns44_rfp载体，利用crispr-cas9体系特异剪切人类第19号染色体上的aavs1位点，将两条供体片段整合到基因组上的安全位点；所述的3nat序列为seq id no:4，所述的ns44序列为seq id no:9。
11.通过潮霉素b药物筛选实现等位基因定点插入，并通过rcr鉴定和dna测序获得定点插入的细胞系；
12.(2)在所述的细胞系中，通过病毒包装系统，过表达krab metj表达载体，以此构建sam浓度感知双荧光报告系统。
13.进一步地，所述的细胞系为hek293t。
14.进一步地，所述步骤(2)构建病毒包装系统的方法为：通过krab metj-pcw57.1质粒与p/g质粒，vsvg质粒，进行三质粒瞬转，培养后后产生慢病毒，利用此病毒感染所述细胞系。
15.本发明的第二个方面公开了一种sam浓度检测试剂盒，其特征在于，包括上述实时感知真核细胞sam浓度的系统。
16.本发明的第三个方面公开了一种筛选调控sam代谢的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
17.根据上述的实时感知真核细胞sam浓度的系统构建稳定表达cas9蛋白的细胞系，使用gecko慢病毒文库进行全基因组范围的筛选；
18.通过病毒感染sgrna质粒文库后敲除基因，通过流式细胞分选获得不同集群，通过pcr特异地扩增出不同集群的基因序列信息，将来自功能性筛选富集获得的细胞和未经过处理的原文库细胞的pcr扩增序列，通过深度测序分析及比较，可以获得被富集的sgrna序列信息以及其所对应的基因，依次获得调控sam代谢的潜在基因。
19.本发明的第四个方面公开了一种一种krab metj表达载体。
20.本发明的第五个方面公开了所述的3nat和ns44序列用于构建实时感知真核细胞sam浓度的系统的用途。
21.与现有技术相比，本发明的创新点在于：
22.1)首创性地着眼于大肠杆菌中蛋氨酸代谢这一机制，以及metj阻遏蛋白特异性结合met-box序列偏好性的特点，结合aavs1定点插入建立出安全可靠的真核细胞sam浓度感知荧光报告系统，可作为活细胞内sam浓度监测器。
23.2)目前，大规模基因筛选为剖析生物学过程和人类疾病中潜在的基因功能和通路提供了重要的工具，可进行筛选药物靶点、增敏基因、耐药基因等，还可进行多靶点协同作用研究。本发明从metj阻遏调控着手，结合深度测序以及生物信息学分析手段，建立了可用于高通量筛选sam代谢调控基因的系统，将为探究与sam循环相关的潜在基因以及疾病治疗提供靶点。
附图说明
24.图1表示通过双荧光素酶报告基因探究krab metj对于3nat和ns44的转录能力的抑制作用具有蛋氨酸浓度依赖性，其中a表示krab metj对于3nat-met box的结合抑制作用，b表示krab metj对于ns44-met box的结合抑制作用。图中“promoter activity”指“相对荧光素酶活性”，“met”指“蛋氨酸”。
25.图2表示过表达krab metj的细胞在不同的sam浓度下，细胞egfp或者rfp荧光表达强度变化情况。其中egfp荧光代表krab metj与3nat-met box结合引起的荧光变化，rfp荧光代表krab metj与ns44-met box结合引起的荧光变化，荧光变化以流式细胞术分析检测。
26.图3表示过表达krab metj的细胞在不同的蛋氨酸浓度下，细胞egfp或者rfp荧光表达强度变化情况。其中egfp荧光代表krab metj与3nat-met box结合引起的荧光变化，rfp荧光代表krab metj与ns44-met box结合引起的荧光变化，以流式细胞术分析检测。
27.图4表示sam浓度感知细胞敲除mat2a(sam合成酶)后，荧光变化情况，其中mat2a-sg control为对照组，mat2a-sg2为mat2a靶向敲除。
28.图5表示全基因组文库筛选富集结果。
29.图6表示sam浓度感知系统整个构建过程。
30.图7表示实施例2中的鉴定策略；
31.图8和图9为实施例2中构建的aavs1载体；
32.图10为是实施例2中构建的krab metj-pcw57.1诱导质粒；
33.图11为：实施例1的荧光素酶报告基因系统中构建的pgl3 sv40 3nat质粒；
34.图12为：实施例1的荧光素酶报告基因系统中构建的pgl3 sv40 ns44质粒；
35.图13为：实施例1的荧光素酶报告基因系统中构建的pcdna3.1 krab metj表达质粒。
具体实施方式
36.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
37.实施例中所用仪器、设备、试剂均可通过各种渠道获得，例如购买得到，或可以制备而得。
38.本发明所述的候选序列、3nat和ns44序列来自augustus am,sage h,spicer ld.binding of metj repressor to specific and nonspecific dna and effect of s-adenosylmethionine on these interactions.biochemistry.2010apr；49(15):3289-3295.所述候选序列如seq id no:1～10所示。
id no:28)
70.pcw_blast_r2：ctccgtcgtggtccttatagtccatagatctggtgaattgctggg(seq id no:29)
71.pcw_blast_f3：cccagcaattcaccagatctatggactataaggaccacgacgga(seq id no:30)
72.pcw_blast_r3:ttgagacaaaggcttggccatagggccgggattctcctccacg(seq id no:31)
73.pcw_blast_f4：cgtggaggagaatcccggccctatggccaagcctttgtctcaa(seq id no:32)
74.pcw_blast_r4:ctttgctcttgtccagtctagacattggaccagggttttcttcaacatcaccacaagtgaggagaga(seq id no:33)
75.实施例2的步骤(3)中mat2a sgrna序列：tgaacaccttgagcaatatc(seq id no:34)
76.实施例1：基于大肠杆菌中metj蛋白可结合的met-box序列，在真核细胞中鉴定出二者结合具有sam浓度依赖性的序列。
77.一、目的：鉴定出优选met-box的方法
78.二、方法
79.1.提取大肠杆菌基因组dna，设计引物(序列如seq id no:11-12所示)扩增metj的完整的序列区域，并将其构建在pcdna3.1质粒上，使其能够正常表达。接着在萤火虫荧光素酶报告基因载体启动子前插入候选metbox，构建metbox荧光素酶报告质粒。使用vigofect高效转染试剂在293t细胞中共同表达metj表达质粒，metbox荧光素酶报告质粒和肾荧光素酶表达质粒。瞬转6h后，对细胞进行换液处理，并使用不同浓度的蛋氨酸(0mm，0.02mm，0.2mm，2mm)培养细胞36h后，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega11402es80)处理细胞，通过检测出的荧光素酶的酶活性高低探究metj对于met box结合能力。
80.2.设计引物(序列如seq id no:13-14所示)扩增获得zfp809的krab结构域序列，接着利用in-fusion无缝克隆方法设计同源重组引物(序列如seq id no:15-16所示)，获得krab-metj-pcdna3.1融合表达质粒。使用vigofect高效转染试剂在293t细胞中共同表达krab-metj表达质粒，metbox荧光素酶报告质粒和肾荧光素酶表达质粒。瞬转6h后，对细胞进行换液处理，并使用不同浓度的蛋氨酸(0mm，0.02mm，0.2mm，2mm)培养细胞。细胞培养36h后，采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(promega 11402es80)处理细胞，通过检测出的荧光素酶的酶活性高低探究krab metj蛋白结合met box产生的抑制作用是否具有蛋氨酸浓度依赖性。
81.三、结果与讨论
82.通过文献发掘，我们得到了可与metj结合的met-box序列，并在hek293t细胞中对其进行报告基因检测，我们观察到了metj蛋白和metbox的结合并不能产生显著的抑制作用。此外，在包含锌指结构域和krab结构域的锌指蛋白中，锌指结构域负责识别并结合到dna结合区域，krab结构域才能放大结合产生的抑制作用。报告基因结果表明在引入抑制信号放大器krab蛋白后，krabmetj具有显著的3na-met box和ns44-met box结合能力(图1)，并且krab metj对于3na-met box和ns44-met box的结合能力具有明显的蛋氨酸浓度依赖性(图1a和1b)，而包含krab蛋白的znf809对照组并无此现象，这个结果表明在真核细胞中
实现大肠杆菌蛋氨酸阻遏调控机制具有可行性。
83.所述的候选序列如表1所示。
84.表1与metj蛋白结合的候选met-box序列(seq id no:1～10)
[0085][0086][0087]
实施例2：利用aavs1定点插入构建真核细胞的sam感知系统
[0088]
一、目的：在真核细胞中验证krab metj与3na-met box和ns44-met box的结合能力具有sam浓度依赖性
[0089]
二、方法：
[0090]
(1)提供根据以上方法得到的优选met-box序列(3na和ns44)，设计引物(序列如seq id no:17-25所示)分别构建aavs1_hygro_cmv_3na_egfp和aavs1_hygro_cmv_ns44_rfp载体，利用crispr-cas9技术特异性靶向aavs1位点，将两条供体片段整合到基因组上aavs1位点，该位点是一个开放的染色体结构，可以保证转入的rfp和egfp基因在启动子的驱动下能被正常转录，通过潮霉素b(hygromycin b)药物筛选实现等位基因定点插入，并通过rcr鉴定和dna测序获得定点插入的细胞系，具体鉴定策略如图7所示。
[0091]
(2)在此细胞中通过病毒包装系统，过表达构建的krab metj-pcw57.1诱导质粒，以此构建sam浓度感知系统，加入dox诱导后可瞬时表达krab metj蛋白，通过western实验
方法验证稳定表达krab metj的细胞系。在过表达的细胞中改变机体内sam浓度或者蛋氨酸浓度，在此基础上，流式分析rfp和egfp荧光的变化与sam浓度的关系探究此细胞是否可作为sam浓度感知系统。
[0092]
步骤(2)中所述的病毒包装系统构建方法：krab metj-pcw57.1质粒与p/g质粒，vsvg质粒以5：3：2的质粒比例，进行质粒瞬转。48h后产生慢病毒，利用此病毒感染所述细胞系，可以构建过表达krab metj的细胞系，以构建sam浓度感知双荧光报告系统
[0093]
所构建的krab metj-pcw57.1质粒所需引物序列为；
[0094]
pcw_blast_f1：gaattggctagcgaattcatggagcagaagctgatctcagagg
[0095]
pcw_blast_r1：acacaacatatccagtcactatggtcgacttagtattcccacgtctccgg
[0096]
pcw_blast_f2：cccggagacgtgggaatactaagtcgaccatagtgactggatatgttgtgt
[0097]
pcw_blast_r2：ctccgtcgtggtccttatagtccatagatctggtgaattgctggg
[0098]
pcw_blast_f3：cccagcaattcaccagatctatggactataaggaccacgacgga
[0099]
pcw_blast_r3:ttgagacaaaggcttggccatagggccgggattctcctccacg
[0100]
pcw_blast_f4：cgtggaggagaatcccggccctatggccaagcctttgtctcaa
[0101]
pcw_blast_r4:ctttgctcttgtccagtctagacattggaccagggttttcttcaacatcaccacaagtgaggagaga
[0102]
具体步骤包括：使用nhe1和xba1内切酶酶切pcw57.1空载体；使用相对应引物扩增模板。利用胶回收回收所需片段和酶切载体，使用无缝连接试剂盒多片段连接载体与，转化后送测，获得正确的krab metj-pcw57.1诱导质粒。
[0103]
(3)设计mat2a sgrna质粒，利用病毒包装系统感染此细胞，通过药物筛选，靶向敲除sam合成酶mat2a基因，通过流式分析探究荧光变化情况，验证此系统灵敏性。
[0104]
所述设计质粒和包装的步骤包括：使用ucsc网站crispr工具设计sgrna，将构建好的sgrna片段插入对应质粒u6启动子下游，mat2a sgrna序列：tgaacaccttgagcaatatc；
[0105]
sgrna质粒与p/g质粒，vsvg质粒以5：3：2的质粒比例，进行质粒瞬转。48h后产生慢病毒，利用此病毒感染所述细胞系。
[0106]
三、结果与讨论
[0107]
通过aavs1位点定点插入，我们构建了aavs1_hygro_cmv_3na_egfp和aavs1_hygro_cmv_ns44_rfp双荧光报告系统，获得了egfp和rfp荧光同时表达的细胞系。通过用不同浓度的sam和蛋氨酸处理过表达krab metj蛋白的细胞，我们发现egfp和rfp荧光表现出不同的变化趋势，机体内的sam水平增加会导致egfp荧光出现不同程度衰减，而rfp荧光并未出现变化(图2和3)。这表明在真核细胞中，krab metj蛋白与3na-met box的结合具有明显的sam浓度依赖性，可以指示细胞内sam变化。并且在mat2a敲除的细胞系中，sam无法合成，该系统的egfp荧光表现出明显的变化(图4)。
[0108]
实施例3：利用sam浓度感知系统实现全基因组sgrna文库筛选
[0109]
一、目的：在真核细胞中筛选与sam代谢相关的基因
[0110]
二、方法
[0111]
(1)构建稳定表达cas9蛋白的细胞系，加入dox诱导后流式分选egfp荧光变暗的细胞群用于全基因组筛选细胞。使用人gecko sgrna质粒文库进行慢病毒包装和感染，实现全基因组范围的筛选。病毒感染sgrna质粒文库后敲除基因，通过流式细胞分选获得egfp荧光
变化的细胞集群，通过pcr特异地扩增出不同集群的基因序列信息，通过深度测序分析及比较，获得被富集的sgrna序列信息以及其所对应的基因，获得调控sam代谢的潜在基因。
[0112]
三、结果与讨论
[0113]
通过全基因组筛选，获得egfp荧光变亮的细胞集群和egfp荧光不变的细胞集群，对比二者富集的sgrna序列信息和基因数目，获得了部分调控sam代谢的潜在基因，其中mat2a显著富集，进一步证明了此系统的可靠性(图5)。
[0114]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种实时感知真核细胞sam浓度的系统,其特征在于，构建方法为：(1)分别构建aavs1_hygro_cmv_3nat_egfp和aavs1_hygro_cmv_ns44_rfp载体，利用crispr-cas9体系特异剪切人类第19号染色体上的aavs1位点，将两条供体片段整合到基因组上的安全位点；所述的3nat序列为seq id no:4，所述的ns44序列为seq id no:9。通过潮霉素b药物筛选实现等位基因定点插入，并通过rcr鉴定和dna测序获得定点插入的细胞系；(2)在所述的细胞系中，通过病毒包装系统，过表达krab metj表达载体，以此构建sam浓度感知双荧光报告系统。2.根据权利要求1所述的实时感知真核细胞sam浓度的系统，其中，所述的细胞系为hek293t。3.根据权利要求1所述的实时感知真核细胞sam浓度的系统,其中，所述步骤(2)构建病毒包装系统的方法为：通过krab metj-pcw57.1质粒与p/g质粒，vsvg质粒，进行三质粒瞬转，培养后后产生慢病毒，利用此病毒感染所述细胞系。4.一种sam浓度检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的实时感知真核细胞sam浓度的系统。5.一种筛选调控sam代谢的基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：根据权利要求1-3任一项所述的报告系统构建稳定表达cas9蛋白的细胞系，使用gecko慢病毒文库进行全基因组范围的筛选；通过病毒感染sgrna质粒文库后敲除基因，通过流式细胞分选获得不同集群，通过pcr特异地扩增出不同集群的基因序列信息，将来自功能性筛选富集获得的细胞和未经过处理的原文库细胞的pcr扩增序列，通过深度测序分析及比较，可以获得被富集的sgrna序列信息以及其所对应的基因，依次获得调控sam代谢的潜在基因。6.一种krab metj表达载体。7.根据权利要求1所述的3nat和ns44序列用于构建实时感知真核细胞sam浓度的系统的用途。

技术总结
本发明属于生化检测领域，涉及一种真核细胞S-腺苷甲硫氨酸浓度感知荧光报告系统，填补了活细胞内SAM浓度灵敏检测的技术空白，同时实现了调控SAM代谢的功能基因筛选。首先公开了一种基于大肠杆菌蛋氨酸代谢途径中MetJ阻遏蛋白和met-box序列的结合偏好性，利用AAVS1定点插入构建的真核细胞的SAM感知系统。主要包括：S1：从MetJ蛋白结合的候选序列中确定可实时反映SAM浓度的met-box序列,并筛选优选序列；S2：利用AAVS1定点插入荧光报告序列，获得等位基因双荧光报告系统；S3：将MetJ蛋白和Cas9蛋白构入报告系统，获得可感知SAM浓度的双荧光报告系统。本发明提供了一种真核细胞SAM浓度实时感知荧光报告系统，利用此系统可检测活细胞内SAM浓度并筛选调控SAM代谢的相关基因。关基因。关基因。


技术研发人员：高倩倩 张婷婷 艾宜岑 杨博 徐策 房璐 徐君琴 曾家鑫 吴谦
受保护的技术使用者：同济大学
技术研发日：2021.11.26
技术公布日：2022/3/8