小麦TaPT1基因及其用途

小麦tapt1基因及其用途
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及小麦tapt1基因及其在调控植株盐胁迫耐受性方面的用途。


背景技术：

2.土壤盐害是影响作物产量和品质的主要逆境之一。据统计全球已有超过6％的土地受到盐碱化危害，包括20％的耕地和约50％的灌溉地(munns2005；wu等，2011)。在我国，受盐碱化危害的耕地面积占全国耕地面积的6.6％(樊会敏，2017)。由于耕地面积减少、环境污染加剧以及灌溉水质的持续恶化，使得土壤盐害愈加严重，已严重威胁粮食安全生产和可持续发展。现已明确，高浓度的盐胁迫能够引起植物离子毒害和渗透胁迫，并由此引发如氧化胁迫等次级危害(zhu等，2001)。
3.在长期的进化过程中，植物获得了一系列的生物化学和分子机制以抵抗盐胁迫。其中，na
+
外排、控制木质部na
+
的装载、na
+
液泡区室化和细胞质k
+
的动态平衡、高效渗透压调控以及活性氧清除是植物体内重要的耐性机制(zhu等2003，munns和tester，2008)。
4.研究表明，植物响应盐胁迫有两个阶段：抑制新叶生长的快速渗透阶段；加速老叶衰老的慢速离子阶段(munns和tester，2008)。植物对盐害的适应性分为三种不同的类型：渗透胁迫耐性；na
+
或cl-的外排；能够积累na
+
或cl-组织的抗性(munns和tester，2008)。
5.虽然，采用分子遗传学及功能基因组学技术在不同物种中发现了许多与盐耐性相关的基因，如kup/hak/kt家族，通过驱动其对钾离子的转运，加大对k
+
的吸收，保持较高k
+
/na
+
比，从而提高植物的耐盐性(赵畅等，2007)。但目前对小麦内部耐盐机制仍知之甚少。
6.小麦是全世界范围内最重要的粮食作物之一。经过数千年的杂交，现在种植的已驯化小麦均是多倍体，包含两套以上的基因组，这也使得小麦具有极其复杂的基因组，使其获得了许多优异的性状，但同时也丧失了包括盐耐性在内许多其它性状(munns等，2012)。因此，我们迫切需要筛选出强耐盐种质，发掘小麦耐盐关键基因，对培育强耐盐小麦新品种具有重要意义。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种从小麦(triticum aestivum)中克隆得到的参与小麦盐胁迫响应的基因，将其应用到耐盐作物的育种和生产当中。
8.为实现上述目的，本发明基于qtl定位和转录组测序结果鉴定到一个参与小麦盐耐性的基因，以课题组前期鉴定到的盐耐性种质x99为材料，克隆了该基因全长cds序列，相应核苷酸序列如seq id no.1所示，并将其命名为tapt1。
9.tapt1基因cds全长1941bp，编码的蛋白质由646个氨基酸残基组成，氨基酸序列如seq id no.2所示。该蛋白分子量为72.0kda，等电点为8.69。
10.将tapt1氨基酸序列通过smart网站的功能域预测和分析，显示该蛋白含1个功能域：钾离子转运功能域。该蛋白具有11个跨膜结构。
11.tapt1表达模式分析：通过荧光定量pcr技术分析，tapt1在叶片中高表达，尤以老叶中最高；在盐胁迫条件下，耐性基因型x99中tapt1表达量随处理时间的延长逐渐提高，处理12h后达到最大，随后显著下降。
12.进一步的，本发明利用bsmv-vigs方法验证tapt1基因功能，沉默tapt1后小麦植株(bsmv:tapt1)中tapt1表达量显著下降，在盐胁迫条件(150mm nacl)下生长的bsmv:tapt1植株的生物量显著高于对照植株(bsmv:γ)，且bsmv:tapt1植株地上部和地下部的钠离子含量显著低于bsmv:γ植株。
13.进一步的，本发明利用水稻转基因技术将tapt1基因在水稻植株中过表达，相较于野生型，过表达株系的耐盐性显著降低，且转基因株系具有较高的钠离子转移率。
14.本发明提供了所述的tapt1基因或与seq id no.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价的同源基因在调控作物对盐胁迫耐受性方面的应用。
15.具体的，所述应用为利用生物技术手段使得作物的tapt1基因或同源基因功能缺失，进而提高作物对盐胁迫的耐受性。
16.进一步的研究表明，作物的tapt1基因或同源基因功能缺失后，减少其对钠离子的吸收量。
17.进一步的，所述应用包括：利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术导致所述tapt1基因或同源基因的表达降低或缺失，从而获得盐胁迫的耐受性增强的突变体植株。
18.进一步的，所述作物为小麦或水稻。小麦tapt1基因沉默后植株的耐盐性显著提高。
19.进一步的，利用大麦条纹花叶病毒诱导基因沉默(bsmv-vigs)方法沉默小麦的tapt1基因。具体的，所述应用包括：首先将核苷酸序列如seq id no.3所示的tapt1基因片段插入到bsmv:γ载体的nhei位点间，构建重组载体rnaγ:tapt1，再将载体rnaα、rnaβ和rnaγ:tapt1线性化后体外转录，然后侵染小麦幼苗，获得盐耐受性增强的突变体植株。
20.本发明具备的有益效果：
21.本发明通过对小麦tapt1基因的克隆和分析，并结合bsmv-vigs技术沉默小麦tapt1基因以及水稻转基因过表达技术对该基因功能验证，发现tapt1基因表达与作物耐盐性密切相关。本发明为作物尤其小麦的耐盐育种与生产提供了理论依据和相关基因。
附图说明
22.图1为tapt1跨膜结构及功能域预测。
23.图2为tapt1基因表达模式。(a)tapt1基因在x99中的时空表达模式；(b)tapt1基因在x99不同组织中表达模式。
24.图3为利用bsmv-vigs方法沉默tapt1后小麦植株地上部和地下部tapt1基因表达量的变化及盐胁迫对地上部和地下部干重的影响。
25.图4为利用bsmv-vigs方法沉默tapt1后盐胁迫对小麦植株生长的影响。
26.图5为利用bsmv-vigs方法沉默tapt1后盐胁迫对小麦植株钠离子含量的影响。
27.图6为100mm nacl处理10天对野生型和转基因水稻生长的影响。
28.图7为100mm nacl处理10天对野生型和转基因水稻钠离子含量的影响。
29.图8为100mm nacl处理20天对野生型和转基因水稻生长的影响。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。
31.下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
32.本发明以课题组前期鉴定到的小麦盐耐性种质x99、敏感基因型x268为材料，分析小麦响应盐胁迫相关基因tapt1，对阐明小麦响应盐胁迫的分子机理和育种及生产具有重要意义。
33.实施例1 tapt1基因cds区克隆和分析
34.1、tapt1基因cds区克隆
35.基于qtl定位和转录组测序结果鉴定到一个参与小麦盐耐性的基因。以课题组前期鉴定到的盐耐性种质x99为材料，克隆了该基因全长cds序列，相应核苷酸序列如seq id no.1所示，并将其命名为tapt1。
36.采用总rna提取试剂盒提取x99叶片总rna，dnasei去除基因组dna污染，随后利用primescripffm ii 1st strand cdna synthesis kit反转录成单链cdna。根据blast到的序列设计引物，采用kod one高保真酶扩增，引物序列为：
37.tapt1-cds-f：5'-atgtcggacgacaaggacgc-3'；
38.tapt1-cds-r：5'-tcagacttggtagaccattcctacc-3'；
39.将扩增出的产物，连接pmd18-t载体，转化大肠杆菌dh5α，挑取单克隆测序。所述目标基因片段也可以通过人工合成获得。
40.2、tapt1基因序列分析
41.该基因cds全长1941bp，编码646个氨基酸，该蛋白分子量为72.0kda，等电点为8.69。
42.将tapt1氨基酸序列通过smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)网站进行功能域预测和分析。预测分析显示，该蛋白含1个功能域：钾离子转运功能域，该蛋白具有11个跨膜结构(图1)。
43.实施例2 tapt1表达模式分析
44.分别将x99(耐性基因型)和x268(敏感基因型)种子浸泡于2％h2o2中消毒20分钟，蒸馏水彻底冲洗，挑选完整健康种子播种于发芽盒中，培养温度为22℃/18℃。于二叶期挑选健康长势一致小麦幼苗移栽至1/5hogland营养液中。
45.预培养5天后，进行盐处理，试验共设2个处理：对照(基本培养液)和盐处理(150mm nacl)，分别于3h、6h、12h、24h、48h、72h取样进行时空表达分析；
46.取正常培养液中生长10天的x99幼苗进行组织表达分析，分为未展开叶片(uel)、第一完全展开叶(yfel)、老叶(ol)、老叶叶鞘(ols)、茎顶端分生组织(sam)、根尖(ra)、可见侧根区(vlrz)和不可见的侧根区(nlrz)。
47.提取不同时间点样品总rna，反转录成cdna后，利用sybr绿色荧光酶复合物和
light cycler 480pcr仪分析tapt1表达量变化(qrt-pcr)，引物序列为：
48.tapt1-qrt-pcr-f：5'-taaaccaacaaactgtggtgcc-3'；
49.tapt1-qrt-pcr-r：5'-tgtgggagtgacccagaatg-3'；
50.tubulin-f：5'-agttcacggccatgttca-3'；
51.tubulin-r：5'-acgaggtcgttcatgttgct-3'；
52.时空表达分析结果显示，盐处理条件下，在耐性基因型x99中，该基因表达量随处理时间的延长逐渐提高，处理12h后达到最大，随后显著下降。而在敏感基因型x268中未发现显著变化(图2a)。
53.组织表达分析结果显示，tapt1在叶片中的表达量高，尤以老叶中的最高(图2b)。
54.实施例3 bsmv-vigs方法验证tapt1基因功能
55.1、bsmv:tapt1载体构建
56.提取x99总rna，去除基因组dna污染后，反转录成cdna。根据前期克隆的序列，设计特异性引物，扩增得到tapt1基因小片段。
57.引物序列为(下划线为酶切位点)：
58.tapt1-γ-f：5'-ctagctagcggaattgttcgtgttcgaggc-3'；
59.tapt1-γ-r：5'-ctagctagccttgctttcgctgtggcacc-3'；
60.将扩增到的产物连接到pmd18-t载体上，转化大肠杆菌dh5α，涂板，挑取阳性克隆测序，提取测序正确单克隆质粒，利用nheⅰ将质粒上的tapt1基因片段切下，然后与同样经过nheⅰ酶切，且去磷酸化的rnaγ载体用t4连接酶连接。连接产物转化dh5α，用tapt1基因的正向引物tapt1-γ-f和rnaγ载体上的引物γ-stain-f验证反向插入，挑取阳性克隆送公司测序，提取测序正确单克隆质粒并再次酶切验证，所得质粒是rnaγ:tapt1。
61.所用的rnaγ载体上的引物序列为：
62.γ-stain-f：5'-caactgccaatcgtgagtagg-3'
63.2、bsmv载体线性化和体外转录
64.rnaα、rnaγ和rnaγ:tapt1用mluⅰ酶切，同时rnaβ用speⅰ酶切，分别线性化，纯化产物，将纯化后的rnaα、rnaβ、rnaγ和rnaγ:tapt1线性化产物在无rnase的干扰环境下进行体外转录，将体外转录后的rnaα、rnaβ和rnaγ质粒按照1:1:1的体积比混合，并将体外转录后的rnaα、rnaβ和rnaγ:tapt1质粒按照1:1:1的体积比进行混合，分别加入三倍体积的rnase-free水稀释，随后加入等体积2
×
gkp缓冲液(1％膨润土、1％硅藻土、50mm甘氨酸和30mm磷酸氢二钾，ph 9.2)，所得产物命名为bsmv:γ和bsmv:tapt1，混匀之后用于接种。
65.3、bsmv接种验证tapt1基因功能
66.将x99种子浸泡于2％h2o2中消毒20分钟，蒸馏水彻底冲洗，挑选完整健康种子播种于发芽盒中，培养温度为22℃/18℃。于二叶期挑选健康长势一致小麦幼苗移栽至1/5hogland营养液中。当小麦幼苗生长至两叶一心期后，在rnase-free环境下对第二叶进行bsmv摩擦接种，接种后的植株立即喷施少量depc水，并用透明塑料罩罩住植株保湿3天，之后将玻璃罩取掉，在小麦生长培养室中继续培养(22℃/18℃)，定时观察植株的表型。
67.试验共设4个处理：(1)接种bsmv:γ并在正常培养液(bns)中生长；(2)接种bsmv:γ并用150mm nacl处理；(3)接种bsmv:tapt1并在正常培养液中生长；(4)接种bsmv:tapt1，并150mm nacl处理。
68.结果显示，与接种bsmv:γ的小麦植株相比，接种bsmv:tapt1植株地上部和地下部tapt1表达量，除地下部在对照条件下外，在对照和盐胁迫处理下均显著下降(图3)。
69.对照条件下，地上部和地下部生物量无显著变化(图3、图4)。但在盐处理后，接种bsmv:tapt1植株地上部和地下部生物量显著高于接种bsmv:γ植株(图3、图4)。
70.钠离子含量测定结果显示，bsmv:tapt1植株地上部和地下部钠离子含量显著低于接种bsmv:γ的植株(图5)。
71.实施例4水稻异源表达验证tapt1基因功能
72.根据前期克隆的序列，设计特异性引物，引物序列如下，tapt1-oe-f：5'-ccctaggcctactagggatccatgtcggacgacaaggacgc-3'；tapt1-oe-r：5'-acgaacgaaagctctgagctctcagacttggtagaccattcctacc-3'；
73.利用kod one dna聚合酶扩增全长cds，同源克隆连接至ubi启动子驱动的过表达载体中。连接产物热击转化大肠杆菌dh5a感受态细胞，摇菌后，划板挑单克隆摇菌，抽质粒酶切检测；将质粒热击转化农杆菌eha105，涂布于到含有25mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的lb固体培养基表面，于28℃条件下培养过夜，挑取单菌落扩大培养。之后，从中吸取200-300μl的新鲜菌液接入到20ml含有25mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的lb液体培养基中，28℃振荡(220rpm)培养16-18h。
74.取足量的菌液于4000rpm下离心15min，弃去lb培养基上清液；加入20ml 0.1m mgso4溶液重新悬浮农杆菌(用移液器轻轻吹打重悬)，于4000rpm下离心10-15min，弃去含有抗生素的mgso4上清液；再加入5ml含有200μm乙酰丁香酮(as)的aa-as侵染培养基重新悬浮农杆菌，再加入适量的aa-as侵染培养基调整菌液的od
600
值最终调整在0.2-0.8之间；用无菌的50ml离心管分装菌液，20-25ml/管，待用。
75.将预培养7天左右的中花11胚性愈伤从继代培养皿中转移至覆有无菌滤纸的空培养皿中，在超净工作台上风干，转入装有菌液离心管中，轻轻晃动40min，将离心管置于超净台静置10min；将侵染后的愈伤置于无菌滤纸干燥，然后转移至含有as(200μm)的共培养基中培养，28℃下暗培养50-55h，挑取未污染和表面无农杆菌大量生长的愈伤，转移至含潮霉素的培养基上，28℃暗室中培养；挑选生长状态良好的愈伤于新鲜筛选培养基上继代；光照培养，获取转基因阳性苗，随后将苗转入土壤中，提取幼苗dna，从中鉴定到6个阳性株系，从中挑取2个转基因株系tapt1-6#(l6)和tapt1-8#(l8)进行耐盐性功能鉴定。
76.将野生型(wt)、过表达株系l6和l8种子浸泡于2％h2o2中消毒20分钟，蒸馏水彻底冲洗，温室浸种2天，30℃催芽1天。挑选完整健康已发芽种子播种于沙床中，人工气候箱中预培养，培养温度为30℃/26℃，相对湿度为85％。于二叶期挑选健康长势一致水稻幼苗移栽至营养液中。预培养7天后，进行盐处理。
77.试验共设2个处理：control(基本营养液，bns)和100mm nacl处理(bns+100mm nacl)。
78.结果显示，100mm nacl处理10天后，l6和l8株系的耐盐性显著低于野生型(图6)。与wt相比，地上部和地下部生物量显著降低；地下部钠离子含量显著降低，转基因株系具有较高的钠离子转移率(图7)。
79.处理20天后，野生型和转基因株系在耐盐性上的差异更为明显，l6株系全部死亡，l8耐盐性显著低于野生型(图8)。

技术特征：
1.小麦tapt1基因，其特征在于，该基因的cds区核苷酸序列如seq id no.1所示。2.如权利要求1所述的小麦tapt1基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.cds区核苷酸序列如seq id no.1所示的tapt1基因或与seq id no.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价的同源基因在调控作物对盐胁迫耐受性方面的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为：利用生物技术手段使得作物的tapt1基因或同源基因功能缺失，进而提高作物对盐胁迫的耐受性。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，作物的tapt1基因或同源基因功能缺失后，减少其对钠离子的吸收量。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用基因突变、基因敲除、基因干扰或基因沉默技术导致所述tapt1基因或同源基因的表达降低或缺失，从而获得盐胁迫的耐受性增强的突变体植株。7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述作物为小麦或水稻。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括：首先将核苷酸序列如seq id no.3所示的tapt1基因片段插入到bsmv:γ载体的nhei位点间，构建重组载体rnaγ:tapt1，再将载体rnaα、rnaβ和rnaγ:tapt1线性化后体外转录，然后侵染小麦幼苗，获得盐耐受性增强的突变体植株。

技术总结
本发明公开小麦TaPT1基因及其用途，属于基因工程技术领域。所述小麦TaPT1基因的CDS区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过对小麦TaPT1基因的克隆和分析，并结合BSMV-VIGS技术沉默小麦TaPT1基因以及水稻转基因过表达技术对该基因功能验证，发现TaPT1基因表达与作物耐盐性密切相关。本发明为作物尤其小麦的耐盐育种与生产提供了理论依据和相关基因。耐盐育种与生产提供了理论依据和相关基因。耐盐育种与生产提供了理论依据和相关基因。


技术研发人员：曹方彬 马悦 王一州 邬飞波
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2021.12.07
技术公布日：2022/3/8