一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗及其制备方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗及其制备 方法。


背景技术：

2.萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，par)是一类慢性呼吸道疾病，以 鼻腔广泛扩张和黏膜、黏膜下层及骨组织萎缩为主要特征，具有高度接触传 染性，又称为传染性萎缩性鼻炎或慢性萎缩性鼻炎，是公认的严重危害集约 化养猪场生产和发展的重要传染性疾病之一。par主要由产毒素多杀性巴氏 杆菌和支气管败血波氏杆菌感染引起，常与其他类呼吸道疾病发生继发感染， 如猪支原体病、猪蓝耳病、猪喘气病等。此病流行范围广，世界各地普遍发 生，在养猪业发达地区发病率相对较高，猪群的病原检出率较高，是危害规 模化养猪场的主要疾病之一，已被世界动物卫生组织列入b类疾病。因此开 发更为有效、安全的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗已成为迫切的需要。
3.目前猪萎缩性鼻炎分为进行性萎缩性鼻炎和非进行性萎缩性鼻炎，进行 性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，par)，主要由多杀性巴氏杆菌 (pasteurella multoeida，pm)的产毒菌株(dnt+pm)引起(多为d型，少数为a 型)；另一种是非进行性萎缩性鼻炎(non-progressive atrophie rhinitis，npar)， 主要由支气管败血波氏杆菌(bordetella bronchiseptica,bb)的i相菌引起。后 者单独感染时，则鼻腔病变较轻，当两者混合或继发感染时，则鼻腔病变很 重。
4.par的病原为波氏杆菌属的支气管败血波氏杆菌(bb)以及产毒性多杀 性巴氏杆菌(pm)。bb革兰氏染色呈阴性，无芽胞的短杆菌，有周鞭毛，能 运动；有荚膜，大多呈两极染色，成对或散在排列，可分为ⅰ相菌、ⅱ相菌、
ꢀⅲ
相菌3种菌相，但有致病作用的为ⅰ相菌，典型的ⅰ相菌呈珍珠状或半圆 形，直径约小于1mm，白色、光滑致密，β溶血环边界不清晰。鲍-姜氏培养 基(bg)中加入5％～10％的无菌脱纤维绵羊全血可使菌落保持在ⅰ相菌。临 床研究证明单一的支气管败血波氏杆菌感染发病不严重，鼻骨的缺陷可再生， 属于非进行性萎缩性鼻炎。多杀性巴氏杆菌(pm)属于革兰氏阴性菌，两端 钝圆呈球状或短杆状，跟bb的相同之处是不能形成芽孢，不同的是pm不 能运动。根据脂多糖抗原分类，pm菌株可分为5个荚膜血清组(a，b，d， e和f)和16个体细胞血清型(1至16)，而血清型a和d是引起进行 性猪萎缩性鼻炎的病原体之一，a型和d型多杀性巴氏杆菌可产生外毒素。 研究表明：多杀巴氏杆菌具有各种毒力因子，包括毒素、粘附素和菌毛，尤 其是皮肤坏死毒素pmt危害最大，皮肤坏死毒素pmt是一种大小约146kda 的蛋白。
5.猪萎缩性鼻炎感染后症状多在3～4周龄或断奶猪中出现，发病日龄与发 病情况呈负相关。病猪呈现不同程度的卡他性鼻炎特征，频繁打喷嚏、呼吸 不畅且伴有有鼾声等；仔猪表现出食欲下降，鼻孔不断浆液性或黏液性脓性 分泌物，但病情较轻时可恢复正常。感染后期，病猪鼻甲骨和梁骨在炎症刺 激下开始萎缩变形，鼻甲骨病变由腹侧向背侧延伸，两边鼻孔大小不一，鼻 端向病侧倒歪，“歪鼻子病”因此而来。
6.随着对猪萎缩性鼻炎致病机制的研究，预防该病最好的方法为疫苗免疫。 目前市
场上商品化疫苗主要为灭活菌苗和类毒素苗，且发现类毒素苗的免疫 效果优于灭活菌苗，但都不能达到理想的效果。因此本研究采用灭活菌苗 (zxt+pm和ahbb)加上重组多杀性巴氏杆菌毒素蛋白((rpmt-n和 rpmt-c))一方面可以保护仔猪不受bb和pm的攻击作用，另一方面也避免 仔猪因为t+pm产生的毒素蛋白溶骨作用，从而更全面的预防和保护仔猪发 生猪萎缩性鼻炎。


技术实现要素：

7.本发明旨在针对现有疫苗的缺陷，提供一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗及其 制备方法，以解决现有技术中相关疫苗对不同型菌株及产生的毒素通用性较 差的技术问题。
8.本发明的猪产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株已保藏，保藏单位：中国 典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2021年11月 15日，保藏编号：cctcc no：m 20211427分类命名：pasteurella multoeidazxt-pm。本发明的猪支气管败血波氏杆菌ahbb株已保藏，保藏单位：中国典型 培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2021年11月08日， 保藏编号：cctcc no：m 20211379分类命名：bordetellabronchisepticaahbb。本发明的重组表达菌rosetta-rpmt-n已保藏，保藏单位：中国典型培养 物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2021年11月05日，保 藏编号：cctcc no：m 20211371分类命名：escherichia coli rosetta-rpmt-n。本发明的重组表达菌rosetta-rpmt-c已保藏，保藏单位：中国典型培养 物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2021年11月05日，保 藏编号：cctcc no：m 20211372分类命名：escherichia coli rosetta-rpmt-c。
9.本发明的猪产毒素多杀性巴氏杆菌(zxt+pm)优化培养为约8～10h和 猪支气管败血波氏杆菌(ahbb)优化培养为10～12h时收获。
10.本发明的灭活猪产毒素多杀性巴氏杆菌(zxt+pm)、猪支气管败血波氏 杆菌(ahbb)均为使用甲醛灭活获得灭活抗原。
11.本发明的灭活猪产毒素多杀性巴氏杆菌(zxt+pm)和猪支气管败血波氏 杆菌(ahbb)用triton x-114去内毒素处理。
12.本发明的产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端抗原(rpmt-n)蛋白为 n1～1461蛋白，1461碱基，蛋白大小为88kda和多杀性巴氏杆菌pmt毒素c 端蛋白(rpmt-c)为c2959-3858段包括900碱基，蛋白大小为67kda。
13.本发明的猪产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株含量为1
×
109cfu/ml。
14.本发明的猪支气管败血波氏杆菌ahbb株含量为1
×
109cfu/ml。
15.本发明的产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端和c端蛋白(rpmt-n和 rpmt-c)含量为10～80μg/ml。
16.本发明的兽药学上可接受的佐剂为卡波姆水佐剂。
17.本发明的另一目的在于提供一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的制备方法，包 括以下步骤：
18.(1)将保存的猪产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株冻干菌接种于固体培 养基进行复苏培养，挑取单克隆于液体培养基中培养，之后于适宜培养基中 扩大培养8～10h，收获
dna maker，1、bb，2、bb，3、negetive。
29.图3为本发明的重组质粒双酶切鉴定图。图中各泳道：mdl10kb dnamarker，2、pet32a-rpmt-n，3、pet32a-rpmt-c。
具体实施方式
30.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并 不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离 本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替 换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
31.实施例1猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的制备
32.1本发明实施例的菌种的来源及鉴定
33.1.1菌种的来源
34.猪产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株保藏号cctcc m 20211427
35.zxt-pm、猪支气管败血波氏杆菌ahbb株保藏号cctcc m 20211379由 南京农业大学农业部细菌学重点实验室分离、鉴定、保管和供应。重组表达 菌rosetta-rpmt-n保藏号cctcc m 20211371，重组表达菌rosetta-rpmt-c 保藏号cctcc m 20211372由南京农业大学农业部细菌学重点实验室构建、 鉴定、保管和供应。
36.1.2菌种的鉴定
37.1.2.1猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株
38.1.2.1.1形态和生化特性猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株为 革兰氏阴性小球杆菌，显微镜下该菌呈典型两极着染，生化特性表现为发酵 葡萄糖、蔗糖、甘露醇，产酸不产气，不发酵麦芽糖、乳糖、鼠李糖，吲哚、 硝酸盐还原试验阳性。
39.1.2.1.2培养特性该菌在麦康凯琼脂上不生长；在血琼脂平板上形成水 滴样、边缘光滑的小菌落，无金属光泽，亦无可见溶血现象；在tsa平板上 生长良好，菌落小，透明、光滑、湿润，呈现蓝色荧光。
40.1.2.1.3分子生物学特性针对猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌kmt基因 设计基因特异性引物，用猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株纯培养物 提取dna模板进行pcr反应，产物经琼脂糖凝胶电泳后在紫外透射反射仪 下应观察到长度为457bp的特异性扩增片段(图1中的图a)。根据d型多 杀性巴氏杆菌dcbf基因和产毒素多杀性巴氏杆菌toxa基因，分别设计了特 异性引物进行d型多杀性巴氏杆菌和产毒素多杀性巴氏杆菌的鉴定，进行pcr扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察，分别扩增出647bp(图 1中的图b)和864bp(图1中的图c)的特异片段。
41.1.2.2猪支气管败血波氏杆菌ahbb株
42.1.2.2.1形态和生化特性为革兰氏阴性小球状杆菌，生化特性为不发酵 糖类和甘露醇，吲哚、甲基红、vp试验为阴性，柠檬酸盐利用试验、硝酸盐 还原试验呈阳性，脲酶、过氧化物酶、腺苷酸环化酶和触酶实验阳性，不水 解明胶，符合猪支气管败血波氏杆菌生化特性。
43.1.2.2.2培养特性麦康凯琼脂培养基37℃培养40～48小时，菌落呈微 黄色；在含有2％胎牛血清和1％辅酶的tsa平板37℃培养36小时，菌落直 径0.5mm左右、光滑、半透明、
湿润、边缘整齐。菌相为ⅰ相菌，在鲍姜氏 培养基上37℃培养40～48小时，观察到β-溶血环。
44.1.2.2.3分子生物学特性针对支气管败血波氏杆菌fla基因设计基因特 异性引物，应用猪支气管败血波氏杆菌ahbb株纯培养物提取dna模板进行 pcr反应，产物经琼脂糖凝胶电泳后在紫外透射反射仪下应观察到长度为 237bp的特异性扩增片段，如图2所示。
45.1.2.3pmt基因工程表达菌rosetta-rpmt-n和rosetta-rpmt-c株
46.1.2.3.1形态为革兰氏阴性杆菌，具有典型的大肠杆菌形态。
47.1.2.3.2培养特性在含100μg/ml氨苄青霉素的lb(luria-bert)液体 或固体培养基中培养均能生长。在固体培养基中37℃培养14～16小时，菌落 圆形、光滑、突起、有乳白色光泽。
48.1.2.3.3分子生物学特性分别用基因工程表达菌rosetta-rpmt-n和 rosetta-rpmt-c株的培养物提取pet32a-rpmt-n和pet32a-rpmt-c质粒，各 用bamhi和saci双酶切后，用1％琼脂糖电泳鉴定酶切片段。pet32a-rpmt-n 双酶切后有两条条带，一条片段大小约为1461bp，另一条片段大小约为 5900bp。pet32a-rpmt-c双酶切后有两条条带，一条片段大小约为900bp，另 一条片段大小约为5900bp，如图3所示。
49.1.2.3.4蛋白表达特性将基因工程表达菌rosetta-rpmt-n和 rosetta-rpmt-c株分别划线于含50μg/ml氨苄青霉素的lb平板，37℃温箱 培养14～16小时。分别挑取rosetta-rpmt-n和rosetta-rpmt-c菌株单个菌落， 接种于含100μg/ml氨苄青霉素的3ml lb液体培养基中，37℃摇床200r/min 振荡培养，培养至对数生长期od600值达0.6～0.8时，加入异丙基硫代β-d
‑ꢀ
半乳糖苷(iptg)至终浓度为0.1mmol/l，继续培养3～4小时。分别取l.0ml 诱导物，10000r/min离心5分钟，收集菌体，重悬于100μl无菌去离子水中， 加1/4体积的5
×
sds-page上样缓冲液。100℃水浴10分钟后，进行10％的 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析，rosetta-rpmt-n和 rosetta-rpmt-c株表达的蛋白大小分别约为88kda和67kda。
50.2猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的制备
51.2.1菌液的制备
52.2.1.1猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株菌液制备
53.将猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株冻干菌种划线接种于含有 2％新生牛血清和1％辅酶的tsa平板，37℃培养24～36小时，挑选单个典型 菌落，接种于5ml bhi液体培养基，37℃、180r/min振荡培养10～12小时， 之后将菌液以2％接种量进行扩大培养，37℃、180r/min振荡培养10～12小时， 收获取样进行活菌计数和纯粹检。
54.2.1.2猪支气管败血波氏杆菌ahbb株菌液制备
55.将猪支气管败血波氏杆菌ahbb株冻干菌种划线接种于含有2％新生牛血 清和1％辅酶的tsa平板，37℃培养36～48小时，挑选单个典型菌落，接种 于5ml tsb液体培养基，37℃、180r/min振荡培养12～16小时，之后将菌液 以2％接种量进行扩大培养，37℃、180r/min振荡培养12～16小时，收获取样 进行活菌计数和纯粹检。
56.2.2菌液的灭活
57.取扩大培养的猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株菌液和猪支气管 败血波氏杆菌ahbb株菌液，向其中缓慢加入甲醛溶液至终浓度为0.3％ (v/v)，37℃灭活24～48小时，取灭活后菌液涂布于tsa平板，37℃倒置 培养24～48小时，观察应无菌落生长。
58.2.3菌液的浓缩
59.取灭活的猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株菌液和猪支气管败血 波氏杆菌ahbb株菌液经离心收获菌体，沉淀菌体用无菌pbs(ph7.4)缓冲 液重悬，离心洗涤3次，制成浓度为1
×
10
11
cfu/ml的菌液。
60.2.4产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端和c端蛋白的制备
61.2.4.1菌液的制备
62.将rosetta-rpmt-n和rosetta-rpmt-c冻干菌种划线接种于含100μg/ml 氨苄青霉素的lb固体平板，37℃培养16～18小时，然后挑选单个典型菌落， 接种于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃、180r/min振荡培养 12～16小时，之后将菌液以2％接种量进行扩大培养并诱导表达，收获菌液进 行离心浓缩。
63.2.4.2菌液的破碎、灭活及纯化
64.将浓缩后的菌液进行高压破碎(1300pa)，破碎后菌液加入终浓度为0.3％ 甲醛灭活24h，灭活液经镍柱纯化，75mm咪唑洗脱收获rpmt-n和rpmt-c 蛋白。
65.2.4.3蛋白定量
66.纯化后收获的rpmt-n和rpmt-c蛋白进行无菌过滤，通过bca测定和 考马斯亮蓝法(sds-page)定量分析，确定rpmt-n和rpmt-c蛋白浓度。
67.2.5猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的制备
68.取猪d型产毒素多杀性巴氏杆菌zxt+pm株灭活菌液、猪支气管败血波 氏杆菌ahbb株灭活菌液、纯化后产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端和c 端蛋白按一定比例混合，向其中加入一定量的卡波姆水佐剂，室温震荡1小 时，调节ph值为7.6～7.8，检验、分装、贴标签即为成品疫苗，其中灭活的 猪产毒素多杀性巴氏杆菌(zxt+pm)含量为1
×
109cfu/ml，猪支气管败血 波氏杆菌(ahbb)含量为1
×
109cfu/ml，产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n 端和c端蛋白(rpmt-n和rpmt-c)含量为40μg/ml。
69.实施例2猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的制备2
70.菌种及菌种的灭活，rpmt-n和rpmt-c的表达和纯化同实施例1。
71.实施例3猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的制备3
72.菌种及菌种的灭活，rpmt-n和rpmt-c的表达和纯化同实施例1。
73.实施例2、实施例3的各个抗原的比例见下表1。
74.表1猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的成分配比
[0075][0076]
实施例4成品猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的检验
[0077]
分别根据实施例1、实施例2、实施例3的方法各配制1批疫苗，疫苗批 号分别为202001、202002和202003。
[0078]
5疫苗的检验
[0079]
1.1成品检查
[0080]
按照《中国兽药典》附录进行物理性状、无菌检验、装量检验和甲醛残 留量的测定。
[0081]
1.2安全检验
[0082]
14日龄健康易感仔猪(猪支气管败血波氏杆菌凝集检测抗体阴性；猪d 型产毒素多杀性巴氏杆菌pmt阻断elisa抗体阴性；鼻拭子猪支气管败血 波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌pcr检测抗原均为阴性)20头，分成4组，每组 5头。其中1～3组为安全试验组，各颈部肌肉注射疫苗4.0ml，第4组为阴性 对照组，颈部肌肉注射无菌生理盐水4.0ml，试验后观察14日。
[0083]
1.3效力检验
[0084]
用14日龄健康易感仔猪(猪支气管败血波氏杆菌凝集检测抗体阴性；猪 d型产毒素多杀性巴氏杆菌pmt阻断elisa抗体阴性；鼻拭子猪支气管败 血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌pcr检测抗原均为阴性)20头，分成4组，每 组5头。其中1～3组为免疫组，仔猪每头颈部肌肉注射疫苗1ml，14日后以 相同剂量和方式二免；第4组作为对照组不接种。二免后28日对所有猪进行 攻毒，每头猪每个鼻孔徐徐滴入0.5毫升含有8.2
×
106cfu/ml的支气管败血 波氏杆菌；产毒素性多杀性巴氏杆菌在二免后28天进行攻毒，攻毒方法同上， 每头猪每个鼻孔徐徐滴入0.5ml含有1
×
109cfu/ml的产毒素性多杀性巴氏杆 菌，连用4天，攻毒后每日观察，14天所有实验猪全部扑杀，横断猪的鼻部， 检查鼻甲骨病变并进行评分分析，剖检观察有无病变。
[0085]
猪鼻甲骨病变评分标准：处死试验猪，置横卧位，稍抬高其头部，在第 一、二臼齿之间横向切开吻部，观察横断面上鼻甲骨萎缩(ta)和鼻中隔偏 曲(nsd)情况。每个鼻甲骨蜷曲萎缩可判为0～4分(0分：正常，没有任 何病变；1分：很小一部分萎缩，一个蜷曲将近一
半萎缩；2分：轻微萎缩， 一个蜷曲超过一半萎缩；3分：中度萎缩，鼻甲骨强直；4分：严重萎缩，鼻 甲骨整个蜷曲消失)。鼻中隔偏曲可判为0～2分(0分：正常；1分：轻微 偏曲；2分：严重偏曲)。每头猪鼻甲骨病变得分为4个鼻甲骨蜷曲萎缩得分 和鼻中隔偏曲得分相加，病变最高分数为18分。
[0086]
2.实验室检验结果
[0087]
2.1物理性状检查
[0088]
从3批次疫苗中随机抽样进行性状检验。本品为半透明混悬液，久置底 部有少量沉淀，振荡后呈均匀混悬液(见表2)。
[0089]
表2 3批试验室成品性状检验结果
[0090][0091]
2.2无菌检查
[0092]
3批疫苗随机分别取5瓶，分别接种tg培养基，37℃培养3日后，分别 接种硫乙醇酸盐培养基及酪胨培养基斜面，分别置37℃培养和25℃培养，培 养7d后，全部(5/5)无菌生长(见表3)，符合要求。
[0093]
表3各批次疫苗无菌检验结果
[0094]
批号无菌检验2020015/5无菌生长2020025/5无菌生长2020035/5无菌生长
[0095]
2.3装量检查
[0096]
3批疫苗随机分别取5瓶，进行装量检查，结果均符合要求(表6)。其 中，202001批检测5瓶抽检产品装量分别为20.5、21.2、20.8、20.6、21.1ml； 202002批检测5瓶抽检产品装量分别为20.8、21.5、20.6、20.5、20.9ml；202003 批检测5瓶抽检产品装量分别为20.4、20.6、20.9、20.7、21.1ml(见表4)， 符合要求。
[0097]
表4各批次疫苗装量检查结果
[0098]
批号装量20200120.2ml、20.3ml、20.5ml、20.6ml、21.1ml20200220.6ml、21.2ml、20.6ml、20.2ml、20.6ml
20200320.3ml、20.6ml、20.7ml、20.5ml、21.2ml
[0099]
2.4甲醛残留量检查
[0100]
3批疫苗随机分别取5瓶，进行甲醛残留量检测。经检验，202001、202002 和202003批次疫苗的甲醛残留量分别为0.11％、0.10％、0.13％(见表5)， 符合要求。
[0101]
表5各批次疫苗甲醛残留量测定
[0102]
批号甲醛残留量2020010.09％2020020.12％2020030.11％
[0103]
2.5安全检查
[0104]
将制备的三批疫苗分别对14日龄健康易感仔猪各颈部肌肉注射疫苗 4.0ml，观察14日，未出现因疫苗引起的局部和全身不良反应(见表6)。
[0105]
表6 14日龄仔猪一次单剂量接种的安全性试验结果
[0106][0107]
2.6效力检验
[0108]
攻毒后非免疫攻毒对照组和3批疫苗免疫组的猪出现个别猪只出现1～2 天体温升高外，其余大部分猪均无明显异常临床表现。攻毒后观察14天，免 疫组猪相对日增重与空白对照组无明显差异(p＞0.05)，但均明显高于非免 疫攻毒对照组(p＜0.05)，免疫组鼻甲骨部分猪有轻微蜷曲萎缩，与空白对 照组差异不显著，攻毒对照组鼻甲骨萎缩严重，肺
部病变明显，与空白对照 组差异显著(p＜0.05)(见表7)。
[0109]
表7 3批疫苗免疫猪攻毒后临床症状统计结果(一)
[0110]
[0111][0112]
备注：不同字母上标表示差异显著
[0113]
表7 3批疫苗免疫猪攻毒后临床症状统计结果(二)
[0114]
[0115][0116]
由表2至表7分别检验3批猪萎缩性鼻炎灭活疫苗的物理性状、无菌检 验、安全检测和效力检测等，均符合要求，对于猪支气管败血波氏杆菌和产 毒素多杀性巴氏杆菌的攻击作用均具有较好的保护能力，按照实施例1、实施 例2、实施例3制备的疫苗符合设计。
[0117]
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本 发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的 部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特 征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况 进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并 不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有 技术方案。

技术特征：
1.一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗组合物，其特征在于，包括抗原和佐剂，所述抗原包括灭活的猪产毒素多杀性巴氏杆菌、灭活的猪支气管败血波氏杆菌、产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端蛋白、产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素c端蛋白；所述产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端蛋白的核苷酸序列为seq id no:1，所述产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素c端蛋白的核苷酸序列为seq id no:2。2.根据权利要求1所述的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗组合物，其特征在于，所述猪产毒素多杀性巴氏杆菌的含量不低于1
×
109cfu/ml，所述猪支气管败血波氏杆菌的含量不低于1
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109cfu/ml，所述产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端蛋白的含量为10～80μg/ml，所述产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素c端蛋白的含量为10～80μg/ml，所述产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端蛋白与产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素c端蛋白的比例为1:1。3.根据权利要求1或2所述的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗组合物，其特征在于，所述佐剂为卡波姆水佐剂。4.一种如权利要求1至3任一项所述的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：s1：分别优化培养猪产毒素多杀性巴氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌，培养至未进入平台期前进行灭活和去内毒素；分别克隆表达产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端蛋白和多杀性巴氏杆菌pmt毒素c端蛋白并进行纯化；s2：混合所述猪产毒素多杀性巴氏杆菌、猪支气管败血波氏杆菌、产毒素多杀性巴氏杆菌pmt毒素n端蛋白多杀性巴氏杆菌pmt毒素c端蛋白和佐剂制备疫苗。5.如权利要求1至4任一项所述的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗组合物在制备预防或治疗进行性或非进行性猪萎缩性鼻炎的疫苗或药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗及其制备方法，该疫苗由猪产毒素多杀性巴氏杆菌、猪支气管败血波氏杆菌、产毒素多杀性巴氏杆菌PMT毒素N端和C端蛋白与一定比例的卡波姆水佐剂混合，具有较好的免疫原性、能有效预防进行性和非进行性猪萎缩性鼻炎，提高猪的产能。本发明制备的猪萎缩性鼻炎灭活疫苗中除含有ZXT+Pm和AHBb抗原组分外加入rPMT-N和rPMT-C，除了预防由ZXT+Pm和AHBb引起的猪萎缩性鼻炎外，也避免由ZXT+Pm分泌的毒素蛋白产生的溶骨作用，加强了对猪萎缩性鼻炎的免疫保护作用。用。用。


技术研发人员：董彦鹏 李玉峰 胡静雅 肖澄 周琳 余姣 靳蒙蒙 车巧林 巫泉
受保护的技术使用者：江苏南农高科技股份有限公司
技术研发日：2021.11.28
技术公布日：2022/3/8