Veillonellaatypica在制备预防和或治疗结直肠癌药物中的应用

veillonella atypica在制备预防和/或治疗结直肠癌药物中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，具体涉及veillonella atypica在制备预防和/或治疗结直肠癌药物中的应用。


背景技术：

2.据统计，结直肠癌在全球的发病率位居第三(10.0％)，致死率位居第二(9.4％)，全球范围内每年因结直肠癌致死的人数高达94万。而随着经济水平的提高，结直肠癌的发病率与死亡率也将会不断升高。
3.相关技术中对于结直肠癌的治疗手段主要包括手术治疗和药物治疗。对于早期结直肠癌(ⅰ期)患者，通过手术治疗后，一般可以得到完全的恢复，但结直肠癌发病隐匿，很多患者就诊时常已至中晚期(ⅱ期及以后)，此时即使经手术辅助放化疗，一般预后效果也较差，且放化疗带来的副作用大，导致患者生活质量大大降低。在结直肠癌的病变中，从细胞发生变化到发展为全面转移性病变，是一个长期逐步发展的过程，这使其能够通过预防手段来阻止这一过程。
4.因此，开发一种能够有效预防和/或治疗结直肠癌药物对于降低结直肠癌的发生和恶化具有极为重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出veillonellaatypica在制备预防和/或治疗结直肠癌药物中的应用，能够显著改善结直肠癌相关的肠道炎症，并能有效预防或抑制小鼠结直肠部位肿瘤的发生和发展。
6.本发明的第一个方面，提供veillonella atypica在制备预防结直肠癌产品中的应用。
7.非典型韦荣氏球菌veillonella atypica是一种革兰氏阴性厌氧性微小球菌，直径0.3～0.5μm，初期培植为革兰氏阳性，过夜转为阴性。光学显微镜下为双球状、片状和短链状，无荚膜，无鞭毛，无芽孢。最适生长温度37℃，最适ph6.5～8.0。veillonella atypica在动物和人的自然腔道中大量存在，是分布于口腔、咽部、呼吸道、消化道的常见菌群。其粘附于表面或与其他细菌共同形成生物膜的能力对于肠道和口腔微生物群组成和功能至关重要，尤其是在口咽和肠道中。
8.韦荣氏球菌(veillonellae)根据dna同源性分析可以将其主要分为7种，分别为veillonella atypica，veillonella caviae，veillonella dispar，veillonella rodentium，veillonella parvula，veillonella criceti和veillonella ratti。但对于该菌属的研究却鲜有耳闻。而且在研究过程中发现肠道菌群的改变与结直肠癌的发生和发展密切相关，如具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、产肠毒脆弱拟杆菌(enterotoxigenic bacteroides fragilis,etbf)和大肠杆菌(escherichia coli,
e.coli)被发现可以促进结直肠癌的发生和发展，但对于肠道共生菌预防或抑制结直肠癌的发生和发展并未有公开，尤其是对于veillonella atypica对结直肠癌的治疗和预防作用更是本发明首次公开。
9.在本发明实施例中，发明人通过aom/dss制备的结直肠癌小鼠模型，验证了对模型小鼠投喂适量的veillonella atypica可显著改善结直肠癌相关的肠道炎症，并抑制肠道炎症向结直肠癌的转化，同时能够显著减缓模型小鼠的结直肠癌发展，起到治疗作用。
10.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药物和食品。
11.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述veillonella atypica的使用有效量为1
×
109～5
×
109cfu/ml。
12.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述veillonella atypica包括veillonella atypical atcc 17744。
13.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，使用veillonella atypica中的其他亚种来实现同样的治疗效果，本发明中的保护范围包括但不限于veillonella atypical atcc 17744。
14.在本发明的一些优选实施方式中，所述治疗结直肠癌产品中还包括药学上可接受辅料。
15.在本发明的一些优选实施方式中，所述辅料包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、成膜材料、包衣材料和胶囊材料中的至少一种。
16.在本发明的一些优选实施方式中，所述治疗结直肠癌产品中veillonella atypica有效活菌数大于1
×
109cfu/ml。
17.本发明的第二个方面，提供veillonella atypica在制备预防结直肠癌产品中的应用。
18.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述产品包括药物和食品。
19.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述veillonella atypica的使用有效量为1
×
109～5
×
109cfu/ml。
20.根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述veillonella atypica包括veillonella atypical atcc 17744。
21.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，使用veillonella atypica中的其他亚种来实现同样的治疗效果，本发明中的保护范围包括但不限于veillonella atypical atcc 17744。
22.在本发明的一些优选实施方式中，所述预防结直肠癌产品中还包括药学上可接受辅料。
23.在本发明的一些优选实施方式中，所述辅料包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、成膜材料、包衣材料和胶囊材料中的至少一种。
24.在本发明的一些优选实施方式中，所述预防结直肠癌产品中veillonella atypica有效活菌数大于1
×
109cfu/ml。
25.本发明的第三个方面，提供veillonella atypica在制备治疗肠道炎症产品中的
atypica包括veillonella atypical atcc 17744。
44.当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，使用veillonella atypica中的其他亚种来实现同样的治疗效果，本发明中的保护范围包括但不限于veillonella atypical atcc 17744。
45.在本发明的一些优选实施方式中，所述结直肠癌治疗和/或预防产品中还包括药学上可接受辅料。
46.在本发明的一些优选实施方式中，所述辅料包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、成膜材料、包衣材料和胶囊材料中的至少一种。
47.在本发明的一些优选实施方式中，所述结直肠癌治疗和/或预防产品中的veillonellaatypica有效活菌数大于1
×
109cfu/ml。
48.本发明的有益效果是：
49.通过使用本发明中的veillonella atypica灌胃制剂对结直肠癌模型小鼠进行给药，发现其能够显著改善结直肠癌相关的肠道炎症，并抑制肠道炎症向结直肠癌的转化，预防结直肠癌的发生，同时能够显著减缓模型小鼠的结直肠癌发展，减少结直肠肿瘤的数量、体积和质量，起到显著治疗作用。
附图说明
50.图1为本发明中的各实验组小鼠的he染色结直肠切片图，其中，a为放大100倍视野，b为放大200倍视野。
51.图2为本发明中的各实验组小鼠结直肠长度测量实物图(a)和统计图(b)。
52.图3为本发明中的各实验组小鼠结直肠组织解剖图。
53.图4为本发明中的各实验组小鼠结直肠组织中肿瘤数量、体积与重量的量化柱状图。
54.图5为本发明中的各实验组小鼠体内的ifn-γ+cd8+t细胞流式细胞分析图(a)以及细胞占比量化柱状图(b)。
具体实施方式
55.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
56.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
57.本发明实施例中所用的非典型韦荣氏球菌veillonella atypica(v.a)购自atcc，编号为atcc 17744。
58.veillonella atypica灌胃制剂的制备
59.取veillonella atypical atcc 17744接种于250ml的bhi液体培养基(购自环凯微生物，每100ml的bhi液体培养基中加入1.5ml 60％的l-乳酸钠溶液)中，37℃恒温无氧培养两天。培养结束后离心收集菌体，用50％甘油保种后置于-80℃备用，
60.取收集的veillonella atypical菌体，使用pbs作为溶剂定量为1
×
109cfu/ml，得
到veillonella atypica灌胃制剂。veillonella atypica灌胃制剂即用即配(灌胃当天)。
61.结直肠癌小鼠模型造模
62.在下述实施例中所用小鼠均为c57bl/6小鼠(购自广东药康)，饲养于中山大学东校区实验动物中心的spf环境中。
63.小鼠适应性饲养一周后，按照小鼠体重10mg/kg的量腹腔注射氧化偶氮甲烷(aom)，正常饮水一周。然后饲喂含有2.0％葡聚糖硫酸钠(dss)的水溶液自由饮用一周，正常饮水(无添加dss)两周，以此为一个周期，共循环3次，得到结直肠癌小鼠模型。
64.苏木素-依红(he)染色
65.具体染色步骤如下：
66.1、组织脱水、透明、浸蜡：取各组小鼠的结直肠组织，在4％的多聚甲醛溶液中固定，经低浓度到高浓度的乙醇依次进行脱水，再经二甲苯透明后浸蜡增强组织的硬度，放入脱水机中自动脱水。
67.2、包埋：将脱水后的组织用融化的石蜡进行包埋，待石蜡凝固。
68.3、切片：将包有结直肠的石蜡放入自动切片机中固定，切成4μm厚度的切片，加热使切片平整后置于载玻片上染色。
69.4、染色：依次将切片放入二甲苯ⅰ20min，二甲苯ⅱ20min，无水乙醇ⅰ15min，无水乙醇ⅱ5min，75％酒精5min，自来水洗；切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗；切片依次入85％，95％的梯度酒精脱水各5min，放入依红染料中染色5min；切片依次放入无水乙醇ⅰ5min，无水乙醇ⅱ5min，二甲苯ⅰ5min，二甲苯ⅱ5min透明。
70.5、封片：用中性树胶将已染色的切片放入全自动封片机中进行封片。显微镜下观察。
71.veillonella atypica对小鼠结直肠癌的预防和治疗效果
72.取40只6周龄的雌性c57bl/6小鼠，适应性饲养一周后，随机分为4组，每组10只。按照上述实施例中的造模方式进行造模，其中，对照组(c)腹腔注射等量生理盐水，模型组(m)、非典型韦荣球菌组(v.a)和阳性对照组(5-a)则注射aom。造模结束后，v.a组小鼠每天灌胃200μl上述实施例中的veillonella atypica灌胃制剂，c组与m组灌胃相同剂量的pbs，5-a组以50mg/kg的剂量灌胃5-氨基水杨酸溶液(5mg/ml)，连续给药11周。给药结束后处死小鼠。
73.(1)v.a对小鼠肠道炎症的影响：
74.结果如图1所示，从he染色结果可以看出，与c组相比，m组小鼠结直肠上皮细胞破损严重，腺体变形膨大，排列杂乱，有大量炎症细胞的浸润的情况发生。而v.a组小鼠与5-a组小鼠结直肠腺体排列整齐，腺体没有明显的变形，炎症细胞浸润量显著减少，与c组的情况相当。
75.此外，为了进一步验证上述观点，发明人对各组小鼠的结直肠长度进行检测。
76.通过测量各组小鼠的结直肠长度，发现相比于c组，m组由于dss所引起的炎症作用，小鼠的结直肠长度明显变短，而v.a组和5-a组的小鼠结直肠长度明显长于m组(图2)。
77.因此，根据上述结果，可以表明v.a可以有效改善小鼠肠道炎症情况，并有效抑制由于dss造模所引起的严重的肠道损伤。
78.(2)v.a对aom/dss诱导的小鼠结肠癌的防治作用：
79.为了说明v.a对aom/dss诱导的小鼠结肠癌的防治作用，发明人分别取各组小鼠的结直肠进行解剖，检测小鼠肠壁肿大形成肿瘤的数量、体积和质量。
80.结果如图3～4所示。
81.如图3所示，从小鼠结直肠的解剖实物图可以看出，模型组(m)小鼠肠壁肿大形成肿瘤数量多、体积大，而v.a组和5-a组的小鼠结直肠部位所形成的肿瘤数量更少，体积也更小。进一步对其进行统计发现，v.a组(v组)、m组和5-a组在肿瘤数量、肿瘤体积和肿瘤质量上存在显著差异，v.a组(v组)和5-a组的肿瘤数量更少、肿瘤体积更小、肿瘤质量更轻，表明小鼠在灌胃v.a后，能够抵制由aom/dss引起的结肠炎症向癌症的转化，且效果与5-a组接近。
82.(3)v.a对aom/dss诱导模型小鼠的免疫应答促进效果：
83.为了验证v.a对aom/dss诱导模型小鼠的免疫应答促进效果，发明人利用流式细胞分析术检测了各组小鼠的小鼠肠系膜淋巴结ifn-γ
+
cd8
+
t细胞的差异。
84.具体操作步骤如下：
85.将小鼠解剖后，找到肠系膜淋巴结，延其边缘剪下，过70μm细胞筛研磨于pbs溶液中(含2％血清与1ml/100ml的链霉素与青霉素混合物(双抗))，650-800g离心去上清，用1640重悬(含10％血清与1ml/100ml的链霉素与青霉素混合物)，计数后在96孔板中每孔种入约1
×
106个细胞，以1μl/10μl细胞体系的量加入10
×
阻断刺激剂刺激细胞6小时。
86.刺激后的细胞离心去上清后，用apc/cyanine7 anti-mouse cd45(购自biolegend)和percp/cyanine5.5 anti-mouse cd8a(购自biolegend)避光孵育细胞30min后，用固定液固定20min，离心去上清后用1
×
intracellular staining perm wash重悬，去上清，重复1-2次，用peanti-mouse ifn-γ(购自biolegend)避光孵育30min，经1
×
intracellular staining perm wash重悬、离心去上清后，用500μl pbs重悬。上机检测。
87.结果如图5所示。
88.与模型组相比，结直肠癌模型小鼠在补充v.a后，小鼠体内的ifn-γ
+
cd8
+
t细胞的数量显著增多，这表明v.a可以通过增强模型小鼠肿瘤部位的免疫应答，来实现缓解肠道炎症、抑制小鼠结直肠癌的发展。
89.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.veillonella atypica在制备预防结直肠癌产品中的应用。2.veillonella atypica在制备治疗结直肠癌产品中的应用。3.veillonella atypica在制备治疗肠道炎症产品中的应用。4.veillonella atypica在制备结直肠炎-癌转化抑制药物中的应用。5.根据权利要求1～3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物和食品。6.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述veillonella atypica的使用有效量为1
×
109～5
×
109cfu/ml。7.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述veillonella atypica包括veillonella atypical atcc 17744。8.一种结直肠癌治疗和/或预防产品，其特征在于，所述产品中含有veillonella atypica和药学上可接受的辅料。9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述辅料包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂、成膜材料、包衣材料和胶囊材料中的至少一种。10.根据权利要求8～9任一项所述的产品，其特征在于，所述产品中的veillonella atypica有效活菌数大于1
×
109cfu/ml。

技术总结
本发明公开了Veillonella atypica在制备预防和/或治疗结直肠癌药物中的应用，所述Veillonella atypica的使用有效量为1


技术研发人员：权利要求书1页说明书6页附图3页
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/3/8