抗FDP单克隆抗体、抗体对及其制备方法和用途与流程

抗fdp单克隆抗体、抗体对及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗fdp单克隆抗体、抗体对，以及其制备方法和在制备fdp测定用试剂或试剂盒中的应用。


背景技术：

2.纤维蛋白原是由肝脏合成的具有凝血功能的蛋白质，是纤维蛋白的前体，分子量340,000，半衰期4～6日，血浆中参考值为2～4克/升。纤维蛋白原由α、β、γ三对不同多肽链所组成，多肽链间以二硫键相连，在凝血酶作用下，α链与β链分别释放出a肽与b肽，生成纤维蛋白单体。
3.fdp即纤维蛋白(原)降解产物，是纤溶酶降解纤维蛋白原、非交联纤维蛋白和交联纤维蛋白所产生的各种降解产物的总称，包括d、e、x、y和d-dimer。纤维蛋白(原)降解是一个复杂的生理病理过程，受各种因素的影响，在正常情况下，它是凝血与抗凝血必然结果，机体自身保护的一种反应。fdp测定可以分为血清fdp测定和尿液fdp测定，且参考值不同，血清fdp参考值为＜10mg/l，尿液fdp参考值在28
±
17μg/l之间。如果尿液fdp升高，可能发生在急性肾炎、慢性肾炎、尿毒症、肾移植手术后的排异反应、妊娠毒血症以及dic等。
4.目前，测定血清或尿液中fdps含量的试验通常有免疫电泳法、免疫扩散法、絮状沉淀法、乳胶凝集试验、红细胞凝集抑制试验、葡萄球菌聚集试验、反向血凝试验以及酶联免疫吸附试验等，这些试验多需采用凝血仪进行检测，而该仪器昂贵导致检测成本高。胶乳比浊法采用生化方式检测，其具有操作简单、快速、成本低等优点，但是，现有抗体用于胶乳比浊法时的检测灵敏度相对于凝血仪设备的检测结果欠佳，故检测单位如医院等仍普遍采用凝血仪进行fdp检测。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的问题，本发明通过天然蛋白获得了性能更为优异的纤维蛋白(原)降解产物单克隆抗体和抗体对，其可用于胶乳比浊法进行检测，且具有很高的灵敏度。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明一方面提供了抗fdp单克隆抗体，所述单克隆抗体为csb-da444hmn
①
或csb-da444hmn
②
；
8.所述csb-da444hmn
①
抗体轻链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.3所示；
9.所述csb-da444hmn
①
抗体重链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.4所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.5所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.6所示；
10.所述csb-da444hmn
②
抗体轻链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.7所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.8所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.9所示；
11.所述csb-da444hmn
②
抗体重链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.10所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.11所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.12所示。
12.本发明第二方面提供了用于测定fdp的抗体对，具体由上述的csb-da444hmn
①
和csb-da444hmn
②
组成。相对于本发明的单个抗体，本发明的抗体对使用时，能够提供很高的检测灵敏度，可以对纤维蛋白(原)降解产物进行精确的定量检测。
13.本发明第三方面请求保护上述单克隆抗体在制备fdp测定用试剂中的应用。
14.本发明第四方面请求保护上述单克隆抗体在制备fdp测定用试剂盒中的应用，所述试剂盒包括csb-da444hmn
①
和/或csb-da444hmn
②
。
15.优选地，所述试剂盒为采用胶乳比浊法检测fdp含量的试剂盒。
16.本发明还提供了上述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
17.1).用纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白免疫宿主动物；
18.2).获取得到的免疫宿主动物的脾脏细胞，并通过脾脏细胞制备杂交瘤细胞；
19.3).采用所述杂交瘤细胞制备所述抗fdp单克隆抗体。
20.优选地，所述宿主动物为balb/c雌性小鼠，所述融合细胞由所述脾脏细胞和sp2/0细胞融合所得；采用balb/c雌性小鼠做宿主动物，个体之间差异小，遗传基因更纯，整体素质更好，融合产生杂交瘤细胞分裂能力更强，使单克隆抗体迅速大量增殖，有利于提高抗体制备效率和制备的稳定性。
21.更加优选地，在本发明一具体实施例中，所述步骤1)具体为：以每只小鼠50ug纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白加等量的弗氏完全佐剂，制成油包水乳剂，免疫6-8周龄小鼠；然后，每两周免疫一次所述小鼠，每次免疫取50ug纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白与弗氏不完全佐剂混匀；待效价达到1:10000以上时，按50ug/mouse腹腔冲击免疫。
22.优选地，在本发明一具体实施例中，所述杂交瘤细胞制备工序包括细胞融合和细胞建株。
23.所述细胞融合的方法可以为：制备脾细胞悬液并用pbs洗涤干净后混入sp2/0细胞，脾细胞和sp2/0以10:1的比例混合并离心，离心后滴干混合细胞，轻敲弹松细胞团块，在37℃水浴中加入1ml peg1450，加完后在37℃水浴中反应2min，沿管壁缓慢加入20ml rpmi-1640终止液，融合细胞终止后于800rpm离心5min，并吸干残留液体，hat培养基重悬融合细胞，转入96孔细胞培养板培养，待融合细胞在hat中培养7天左右后换成ht培养基。
24.所述细胞建株的方法可以为：待孔中融合版细胞长至中等大小约104个细胞以上时开始检测，分别取50ul细胞培养液加入预先包被纤维蛋白(原)降解产物蛋白的微孔中，检测细胞上清抗体效价，从检测为阳性对应的微孔取阳性细胞进行亚克隆，利用ht培养基通过有限稀释法将筛选得到细胞稀释至1个/孔，将细胞铺于96孔细胞培养板，待单克隆细胞长至中等大小，密度约104个细胞以上即可检测效价，然后再次选取其中阳性细胞，重复一次亚克隆筛选，待检测到所有微孔中细胞上清都是阳性后，再进行一次同样的单克隆，直至有限稀释法后再次得到全阳性结果，能确定此时筛选到阳性细胞株，所得的阳性细胞株即为杂交瘤细胞。
25.优选地，在本发明一具体实施例中，所述步骤3)包括无血清制备和抗体纯化，具体过程为：在有血清条件下复苏杂交瘤细胞，在连续几次细胞传代过程中，梯度减少血清的比例，逐渐增加代用的添加物，使杂交瘤细胞适应并继续生长；用无血清培养基复苏杂交瘤细胞，在细胞状态良好时，加大培养基的用量及培养细胞的容器，待细胞大量死亡时，收液，并离心取上清，过滤收集，取待纯化的样品上样protein a-琼脂糖亲和层析柱，使抗体与
protein a结合，再用洗脱液进行洗脱，得到抗体。
26.更加优选地，所述待纯化样品在protein a-琼脂糖亲和层析柱中的流速为0.5ml/min。
27.本发明的有益效果为：本发明所述制备方法稳定，得到产物纯度程度高，批间差小；本发明的纤维蛋白(原)降解产物单克隆抗体、抗体对，具有稳定、高效等诸多优良特点，适用于作为诊断试剂盒开发的抗体原料，应用范围也较广，尤其适用于胶乳比浊等高端诊断试剂盒开发的抗体原料；本发明的纤维蛋白(原)降解产物单克隆抗体、抗体对灵敏度较高，对各种浓度的纤维蛋白(原)降解产物蛋白进行定量检测，均能够满足临床检验的要求。
附图说明
28.图1为实施例2中不同方法测定血样中fdp的对比图。
具体实施方式
29.下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
30.实施例1
31.纤维蛋白(原)降解产物单克隆抗体的制备，具体步骤如下：
32.(1)纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物天然蛋白免疫小鼠
33.按每只老鼠50ug纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白，加等量的弗氏完全佐剂，制成油包水乳剂，免疫6-8周龄balb/c雌性小鼠。
34.然后，每两周免疫一次所述小鼠，每次免疫取50ug纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白与弗氏不完全佐剂混匀；免疫四次后测效价，待效价达到1:10000以上，按50ug/mouse腹腔冲击免疫，三天后在无菌条件下取出小鼠脾脏，并制成单个细胞悬液。
35.(2)细胞融合
36.制备脾细胞悬液并用pbs洗涤干净后混入sp2/0细胞，按脾细胞：sp2/0＝10:1混合，1000rpm离心5min后滴干混合细胞，轻敲弹松细胞团块。在37℃水浴中加入1ml peg1450，加完后在37℃水浴中反应2min，沿管壁缓慢加入20ml rpmi-1640终止液。融合细胞终止后于800rpm离心5min，并吸干残留液体。hat培养基重悬融合细胞，转入96孔细胞培养板培养，待融合细胞在hat中培养7天左右后换成ht培养基。
37.(3)细胞建株
38.待孔中融合版细胞长至中等大小约104个细胞以上时开始检测，分别取50ul细胞培养液加入预先包被纤维蛋白(原)降解产物蛋白的微孔中，检测细胞上清抗体效价(即阴性对照《1.0，阳性对照》1.0)，从检测为阳性对应的微孔中取阳性细胞进行亚克隆。利用ht培养基通过有限稀释法将筛选得到细胞稀释至1个/孔，将细胞铺于96孔细胞培养板，待单克隆细胞长至中等大小，密度约104个细胞以上即可检测效价，然后再次取其中阳性细胞，重复一次亚克隆筛选，待检测到所有微孔中细胞上清都是阳性后，再进行一次同样的单克隆，直至有限稀释法后再次得到全阳性结果，能确定此时筛选到阳性细胞株，所得到的的阳
性细胞株即为杂交瘤细胞。
39.(4)无血清培养杂交瘤细胞及纯化抗体
40.在有血清条件下复苏杂交瘤细胞，在连续几次细胞传代过程中，梯度减少血清的比例(如20％血清降至15％血清降至10％血清依次到无血清)，逐渐增加代用的添加物，使杂交瘤细胞适应并继续生长。
41.在制备单克隆抗体时，用无血清培养基复苏杂交瘤细胞，在细胞状态良好时，加大培养基的用量及培养细胞的容器，待细胞大量死亡时，收液，并离心取上清，过滤收集，取待纯化的样品上样protein a-琼脂糖亲和层析柱(hitrap protein g,pharmacia biotech)，流速为0.5ml/min，使抗体与protein a结合，最后用洗脱液进行洗脱，得到抗体，sds-page鉴定其纯度。
42.实施例2抗体验证
43.(1)将制备的单克隆抗体csb-da444hmn
①
、csb-da444hmn
②
，组合成抗体对应用于胶乳比浊法的免疫检测，具体检测流程如下：
44.a预处理：将胶乳微球和相对应的活化液按照一定的比例混匀，超声，选择合适的转速进行离心、弃上清，用对应的活化液重悬，超声，得到洗过的胶乳微球，备用；
45.b活化：取适量活化液到2～4ml ep管中，再向ep管中加入对应预处理过的胶乳微球，用漩涡混匀仪混匀，向其中加入适宜浓度的活化剂，然后放入30℃恒温摇床摇30min左右；
46.c离心：活化完之后，配平离心，15000rpm，40min，离心后弃掉上清液；离心的胶乳微球加入偶联缓冲液50-500ul重悬，超声，使其分散均匀，备用；
47.d偶联：抗体用抗体稀释液稀释到一定浓度，将其加入到重悬的微球中，混匀，然后放入30℃恒温摇床摇2～4h，或者4℃过夜；
48.e封闭：偶联完成后，向ep管中加入适宜的封闭液，混匀；一般采用2～8℃4小时或37℃半小时；根据实验具体情况可进一步确定实验中的偶联液种类、抗体浓度、封闭液种类；
49.f再次离心：重复c离心步骤，重悬液更换为对应项目的r2 1.2～5.0ml不等；
50.g保存：重悬后的试剂，超声混匀，避免胶乳微球自发凝集；
51.h抗原稀释：选取待测的特异性蛋白或者高值血清，进行稀释(不同项目需确定特定的稀释液)；
52.i上机测值：开启生化仪，编辑相应的参数，选取适量的对应项目的r1，r2和已经稀释好的抗原一起上机测值，并记录相应的实验结果。
53.对24例不同fdp值的血样分别进行两种检测，一种为采用上述抗体对和上述胶乳比浊发检测流程进行检测，一种为委托医院采用凝血仪进行检测，检测比对结果如图1所示，图中的每个血样均有两个结果，左侧为使用本发明所述抗体对的检测结果，右侧为医院凝血仪检测结果，由此可见，本发明的最低检出限与医院凝血仪检出限极为接近，对于高含量的，背景值与医院背景值相差不大，故本发明制备的抗体能区分正常组和病例组样本，能够满足临床检测需求。
54.(2)再将单克隆抗体对应的细胞株提取rna，经rt-pcr反转录得到cdna，利用小鼠igg抗体轻链和重链可变区通用引物进行dna测序，确定抗体的可变区序列，具体如下所示：
55.csb-da444hmn
①
轻链可变区互补决定区cdr具有下组cdr的氨基酸序列：seq id no.1所示的cdr1，seq id no.2所示的cdr2，seq id no.3所示的cdr3；csb-da444hmn
①
重链可变区互补决定区cdr具有下组cdr的氨基酸序列：seq id no.4所示的cdr1，seq id no.5所示的cdr2，seq id no.6所示的cdr3。
56.csb-da444hmn
②
轻链可变区互补决定区cdr具有下组cdr的氨基酸序列：seq id no.7所示的cdr1，seq id no.8所示的cdr2，seq id no.9所示的cdr3；csb-da444hmn
②
重链可变区互补决定区cdr具有下组cdr的氨基酸序列：seq id no.10所示的cdr1，seq id no.11所示的cdr2，seq id no.12所示的cdr3。
57.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种抗fdp单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为csb-da444hmn
①
或csb-da444hmn
②
；所述csb-da444hmn
①
抗体轻链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.3所示；所述csb-da444hmn
①
抗体重链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.4所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.5所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述csb-da444hmn
②
抗体轻链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.7所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.8所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.9所示；所述csb-da444hmn
②
抗体重链的cdr1的氨基酸序列如seq id no.10所示，cdr2的氨基酸序列如seq id no.11所示，cdr3的氨基酸序列如seq id no.12所示。2.一种用于测定fdp的抗体对，其特征在于，由权利要求1所述的csb-da444hmn
①
和csb-da444hmn
②
组成。3.权利要求1所述单克隆抗体在制备fdp测定用试剂中的应用。4.权利要求1所述单克隆抗体在制备fdp测定用试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述csb-da444hmn
①
和/或所述csb-da444hmn
②
。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂盒为采用胶乳比浊法检测fdp含量的试剂盒。6.一种制备权利要求1所述抗fdp单克隆抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：1).用纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白免疫宿主动物；2).获取得到的免疫宿主动物的脾脏细胞，并通过脾脏细胞制备杂交瘤细胞；3).采用所述杂交瘤细胞制备所述抗fdp单克隆抗体。7.根据权利要求6所述制备抗fdp单克隆抗体的方法，其特征在于，所述宿主动物为balb/c雌性小鼠，所述融合细胞由所述脾脏细胞和sp2/0细胞融合所得。8.根据权利要求7所述制备抗fdp单克隆抗体的方法，其特征在于，所述步骤1)具体为：以每只小鼠50ug纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白加等量的弗氏完全佐剂，制成油包水乳剂，免疫6-8周龄小鼠；然后，每两周免疫一次所述小鼠，每次免疫取50ug纤维蛋白(原)降解产物天然蛋白与弗氏不完全佐剂混匀；待效价达到1:10000以上时，按50ug/mouse腹腔冲击免疫。9.根据权利要求6所述制备抗fdp单克隆抗体的方法，其特征在于，所述步骤3)包括无血清制备和抗体纯化，具体过程为：在有血清条件下复苏杂交瘤细胞，在连续几次细胞传代过程中，梯度减少血清的比例并逐渐增加代用的添加物，使杂交瘤细胞适应并继续生长；用无血清培养基培养杂交瘤细胞，待细胞大量死亡时，离心取上清，过滤收集，取待纯化样品上样protein a-琼脂糖亲和层析柱，使抗体与protein a结合，再用洗脱液进行洗脱，得到抗体。10.根据权利要求9所述制备抗fdp单克隆抗体的方法，其特征在于，所述待纯化样品在protein a-琼脂糖亲和层析柱中的流速为0.5ml/min。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了抗FDP单克隆抗体、抗体对及其制备方法和用途，所述述单克隆抗体为CSB-DA444HmN


技术研发人员：徐珍 华权高 罗绍祥 陈莹 郑雪松
受保护的技术使用者：武汉华美生物工程有限公司
技术研发日：2021.12.31
技术公布日：2022/3/8