一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法与流程

1.本发明属于酶提取技术领域，涉及一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法。


背景技术：

2.刺梨(rosa roxbunghii)为蔷薇科多年生落叶灌木巢丝花的果实，生于海拔500～2500米的向阳山坡、沟谷、路旁及灌丛中，是贵州、鄂西山区、湘西、凉山、冕宁山区等地的天然野果，在贵州省和河南省开封市有大面积的人工种植。刺梨具有很好的食用价值和药用价值，梨中含有丰富的b族维生素、vc、黄酮、有机酸等多种成分，能保护心脏，具有减轻疲劳，增强心肌活力，降低血压，增强免疫力，延缓衰老，抗癌等功效。刺梨的收获期短，同时是目前发现的超氧化物歧化酶含量最高的水果，所以探寻一种从刺梨中提取超氧化物歧化酶的方法在工业中有广阔前景。
3.超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)广泛存在于动物、植物及微生物中，是以超氧阴离子自由基为底物的一种金属酶。sod能够清除自由基，所以在防御氧的毒性、抗辐射损伤以及预防衰老等方面起着重要作用，已作为一种生化新药在临床上广泛使用，并且作为一种生物活性成份广泛应用于保健食品、化妆品和牙膏等日化产品中。目前所用sod产品均为从人血或动物血液中提取，但国际上疯牛病、口蹄疫等传染性疾病的漫延，动物血液中提取的sod的使用给人们带来了不少的危险因素。从植物，特别是人们日常食用的无污染蔬莱、瓜果、野生植物及粮食中提取sod，如仙人掌、大蒜、五味子、花粉、小白莱及其它果蔬，在绿豆、玉米等粮食中也含有丰富的sod，资源丰富，使用安全性非常高，避免了可能发生的交又感染，且成本低廉。
4.开发刺梨超氧化物歧化酶的提取分离方法，不仅能提高刺梨的附加值，且有利于促进刺梨的深加工，延长刺梨产业链。目前刺梨超氧化物歧化酶提取方法主要采用超声波辅助提取，热变性法，等电点法，有机溶剂沉淀法等，且常见提取手法存在提取率不高或受限于有机溶剂污染和高成本等问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种酶活性高，工艺成本低，从刺梨中提取超氧化物歧化酶的方法。
6.基于上述目的，本技术通过提供一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法来解决该领域中的这种需要。
7.一方面，本发明涉及一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法，其包括：将刺梨去核粉碎后与提取盐溶液混合，经提取离心过滤和活性炭脱色得到粗提液；将粗提液经50～55℃沉淀和ph值5.0沉淀，以体积计加入10％的无水乙醇沉淀得到纯化液；将纯化液于45℃～50℃减压真空浓缩至提取盐浓度为20％，降温静置离心洗涤干燥得超氧化物歧化酶；所述刺梨与提取盐水的混合比例以g:ml计为1:3～5。
8.进一步地，本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法中，提取盐为nacl，
所述提取盐溶液为3％nacl溶液。
9.进一步地，本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法中，无水乙醇的加入体积为纯化液体积的10％。
10.具体地，本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法包括：
11.将刺梨去核粉碎，用3％nacl溶液室温搅拌，所述刺梨与3％nacl溶液的混合比例以g:ml计为1:3～5，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，得第一上清液；将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶；优选地，刺梨去核粉碎前冷冻的温度为4℃。
12.进一步地，本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法中，离心条件为5000r/min，时间20min。
13.进一步地，本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法中，ph调节使用的试剂为3.5％盐酸和3.5％氢氧化钠。
14.本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：
15.(1)本发明提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法，该方法实现了对刺梨中超氧化物歧化酶的高效提取，所得超氧化物歧化酶活性高；
16.(2)本发明提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法，该方法对刺梨进行去核处理，避免了核内杂质对超氧化物歧化酶提取的影响。
17.(3)本发明提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法，该方法避免了有机溶剂对环境的污染，所用试剂均为常见无机试剂，有着成本上的优势。
具体实施方式
18.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
19.实施例1
20.本实施例提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的试验。
21.将50g刺梨去核粉碎，用150ml 3％nacl溶液室温搅拌5h，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，取第一上清液；使用3.5％naoh溶液将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
22.实施例2
23.本实施例提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的试验。
24.将50g刺梨去核粉碎，用200ml 3％nacl溶液室温搅拌5h，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，取第一上清液；使用3.5％naoh溶液将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
25.实施例3
26.本实施例提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的试验。
27.将50g刺梨去核粉碎，用250ml 3％nacl溶液室温搅拌5h，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，取第一上清液；使用3.5％naoh溶液将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
28.对比例1
29.本实施例提供了未经活性炭处理的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的对比试验。
30.将50g刺梨去核粉碎，用250ml 3％nacl溶液室温搅拌5h，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，取第一上清液；使用3.5％naoh溶液将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
31.对比例2
32.本实施例提供了以丙醇为纯化剂的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的对比试验。
33.将50g刺梨去核粉碎，用250ml 3％nacl溶液室温搅拌5h，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，取第一上清液；使用3.5％naoh溶液将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水丙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
34.对比例3
35.本实施例提供了将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为30％的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的对比试验和实施例1～3与对比例1～3中超氧化物歧化酶质的提取结果分析。
36.本实施例提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的试验。
37.将50g刺梨去核粉碎，用250ml 3％nacl溶液室温搅拌5h，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，取第一上清液；使用3.5％naoh溶液将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为30％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
38.对比例4
39.本实施例提供了不去核处理的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的对比试验。
40.将50g刺梨粉碎，用250ml 3％nacl溶液室温搅拌，100目筛网过滤，将滤液室温离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，取第一上清液；使用3.5％naoh溶液将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行室温离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45℃～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
41.对比例5
42.本实施例提供了提取直接盐析对比实验的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法的对比试验和实施例1～3与对比例1～5中超氧化物歧化酶质的提取结果分析。
43.将50g刺梨去核粉碎，用250ml 3％nacl溶液室温搅拌，100目筛网过滤，将滤液室温离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；粗提液加入nacl至溶液整体盐度至20％，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。
44.选择邻苯三酚自氧化法(酶活单位定义：在25℃恒温条件下，1ml反应液中，1min抑制邻苯三酚自氧化速率达50％的酶量定义为1个酶活单位)测定实施例1～3与对比例1～5得到超氧化物歧化酶的酶比活，具体如表1所示。
45.表1，刺梨超氧化物歧化酶的酶比活
[0046] 酶比活(u/g)实施例121636实施例223948实施例321970对比例18161
对比例218020对比例32243对比例49400对比例52174
[0047]
如表1所示，本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法得到的超氧化物歧化酶的酶比活最高能达到23948u/g。对比实施例1～3和对比例1～5，本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法中的活性炭处理、纯化剂选择、真空浓缩和去核处理等方法，可以有效提升刺梨超氧化物歧化酶提取的酶活。
[0048]
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法，其特征在于，包括：将刺梨去核粉碎后与提取盐溶液混合，经提取离心过滤和活性炭脱色得到粗提液；将粗提液经50～55℃沉淀和ph值5.0沉淀，以体积计加入10％的无水乙醇沉淀得到纯化液；将纯化液于45℃～50℃减压真空浓缩至提取盐浓度为20％，降温静置离心洗涤干燥得超氧化物歧化酶；所述刺梨与提取盐水的混合比例以g:ml计为1:3～5。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取盐为nacl，所述提取盐溶液为3％nacl溶液。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无水乙醇的加入体积为纯化液体积的10％。4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，包括：将刺梨去核粉碎，用3％nacl溶液室温搅拌，所述刺梨与3％nacl溶液的混合比例以g:ml计为1:3～5，100目筛网过滤，将滤液离心，离心液通过滤纸过滤和活性炭脱色，制成粗提液；将粗提液在50～55℃水浴30min后，迅速冷却过滤去除沉淀杂质，得第一上清液；将第一上清液的ph调至5，搅拌后室温静置15min，倒入离心管中进行离心后，去除沉淀杂质，得第二上清液；向第二上清液中加入10％体积的无水乙醇，室温静置10min后，离心取上清液，即为纯化液；将纯化液45～50℃减压真空浓缩至nacl浓度为20％，降至室温静置12h，得到超氧化物歧化酶析出液，离心取固体，纯水洗涤，离心取固体得超氧化物歧化酶湿品，冷冻干燥，得到所述超氧化物歧化酶。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述离心条件为5000r/min，时间20min。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述ph调节使用的试剂为3.5％盐酸和3.5％氢氧化钠。7.一种超氧化物歧化酶，其特征在于，采用权利要求1所述的方法制备。

技术总结
本发明提供了一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法，其包括：将刺梨去核粉碎后与提取盐溶液混合，经提取离心过滤和活性炭脱色得到粗提液；将粗提液经50～55℃沉淀和pH值5.0沉淀，以体积计加入10％的无水乙醇沉淀得到纯化液；将纯化液于45℃～50℃减压真空浓缩至提取盐浓度为20％，降温静置离心洗涤干燥得超氧化物歧化酶。本发明提供的一种刺梨超氧化物歧化酶的提取方法无需对刺梨原料进行特殊处理，且提取过程所用试剂安全，得到的超氧化物歧化酶活性高。性高。


技术研发人员：王毅 王蕊 李言威
受保护的技术使用者：西安全奥生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8