Linc01374及编码mRNA在诊断胃癌中的应用

linc01374及编码mrna在诊断胃癌中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术和医学技术领域，特别是涉及一种linc01374及编码mrna在诊断胃癌中的应用。


背景技术：

2.近年来，胃癌的发病率和死亡率显著增加，胃癌早期的高效准备诊疗尤为重要。内镜筛查是目前早期诊断胃癌的主要方法，但因其检查相关条件要求颇高、为侵入性且费用较高，而且部分患者检查过程中会产生剧烈的恶心、呕吐等反应，使其难以广泛应用于胃癌的临床筛查中，而且对于医生技术水平要求较高，内镜检查可能存在误诊情况。
3.外泌体是指由细胞分泌出来的直径30-200nm的一种囊泡小体，其内含有大量的物质包括核酸、蛋白质、酶等，其作为天然的纳米载体不断地脱离各种类型细胞，与其他细胞外囊泡家族相比，外泌体的生物形成是在严格的加载机制控制下，是多泡体与浆细胞膜融合而不是直接脱落的结果，在包括恶性肿瘤在内的病理条件下不同的生物分子通过外泌体的分布，对恶性肿瘤的发生、进展和转移具有调节作用。其中长非编码rna(lncrnas)和可以将癌症、炎症等病理信号传递给细胞并对细胞分化、增殖、迁移、凋亡及死亡等状态进行调控。
4.多项研究已经证明，外泌体能够传递特定蛋白质和核酸给肿瘤微环境中的接受细胞或传递到特定的远距离位置。其独特表达模式和相对稳定的内容物使其成为肿瘤液体活检的一种新候选物，其具有作为胃癌早期诊断的生物标志物的巨大潜力。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供一种生物样本中linc01374及编码mrna在诊断胃癌中的应用，为胃癌诊断提供候选标志物，成本低，其广泛应用能够对胃癌高危患者做出精准、快速及无创的诊断。
6.为了达到上述目的，本发明提供一种生物样本中linc01374及编码mrna在诊断胃癌中的应用。
7.本发明人在研究过程中发现，胃癌患者血清中linc01374的表达量显著高于正常人，并且与正常胃上皮细胞ges-1相比，胃癌细胞sgc-7901培养液上清外泌体中linc01374基因表达显著增高。
8.本发明还提供了一种生物样本中linc01374及编码mrna作为生物标志物在开发和/或制备用于胃癌的诊断用途的产品中的应用。
9.本发明还提供了一种检测生物样本中linc01374及编码mrna的试剂盒，其特征在于，包括检测生物样本中linc01374和/或linc01374编码mrna的试剂。
10.在其中一个实施例中，所述生物样本取自：血液、尿液、羊水中的至少一种。
11.在其中一个实施例中，所述生物样本为外周血。
12.在其中一个实施例中，所述对照样本中含有预定量的linc01374和/或linc01374
编码mrna，作为判断linc01374和/或linc01374编码mrna的高表达或低表达的对照。
13.在其中一个实施例中，所述试剂盒采用定量逆转录pcr法检测。
14.在其中一个实施例中，所述定量逆转录pcr法中，采用以下引物对进行荧光定量pcr反应：
15.正向序列：5
’‑
cgcttgaccgctcttcctttcc-3’；
16.反向序列：5
’‑
tgtgctactgtctcctgtccatcc-3’。
17.在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括以下内参linc01374荧光定量pcr引物对：
18.正向引物：5
’‑
gatgagattggcatggctt-3’19.反向引物：5
’‑
caccttcaccgttccagtt-3’。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.本发明的一种生物样本中linc01374及编码mrna在诊断胃癌中的应用，解决了传统胃癌诊断技术中内镜和病理检查给患者带来痛苦和危险，以及检查成本高、效率低、可能存在误诊的问题，为胃癌诊断提供候选标志物，成本低，其广泛应用能够对胃癌高危患者做出精准、快速及无创的诊断。
附图说明
22.图1为实施例2中胃癌患者血清外泌体的电镜鉴定结果图；
23.图2为实施例2中健康人血清外泌体的电镜鉴定结果图；
24.图3为实施例2中western blot鉴定外泌体表面标记物的结果图，其中1为胃癌患者血清外泌体，2为健康人血清外泌体；
25.图4为实施例3中胃上皮细胞ges-1来源外泌体的电镜鉴定结果图；
26.图5为实施例3中sgc-7901细胞来源外泌体的电镜鉴定结果图；
27.图6为实施例3中western blot鉴定外泌体表面标记物的结果图，其中1为胃上皮细胞ges-1来源外泌体，2为sgc-7901细胞来源外泌体。
具体实施方式
28.为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
29.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
30.定义：
31.本发明所述的定量逆转录pcr法：指应用于以rna作为起始材料的pcr实验中的一种实验方法，在该方法中，总rna或信使rna(mrna)首先通过逆转录酶转录成互补dna(cdna)，然后以cdna为模板进行qpcr反应。
32.试剂、材料、设备来源：
33.正常胃上皮细胞ges-1和sgc-7901细胞(北华大学药学院)
34.本实施例所用试剂、材料、设备如无特殊说明，均为市售来源；实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。
35.实施例1
36.比较胃癌患者及健康人血清linc01374基因差异。
37.1、血清中mirna提取。
38.采集患者及健康人外周血5ml于抗凝管中，3000r/min离心20min，取上层血清，按照mirna提取试剂盒说明书进行mirna的提取。分光光度计法测定rna浓度。
39.2、rna逆转录。
40.对上述rna进行逆转录，具体方法如下：
41.按照总rna反转录试剂盒操作进行，反转录反应体系如下表所示。
42.表1反转录反应体系
[0043][0044]
将上述试剂混合均匀后，轻弹确认无气泡后置于pcr仪，进行反转录。37℃15min；85℃5sec；4℃forever。反应结束后将产物置于-20℃冰箱备用。
[0045]
3、特异性引物。
[0046]
设计linc01374基因的特异性引物，如下所示：
[0047]
f：5
’‑
cgcttgaccgctcttcctttcc-3’(seq id no：1)；
[0048]
r：5
’‑
tgtgctactgtctcctgtccatcc-3’(seq id no：2)。
[0049]
内参β-actin基因：
[0050]
f：5
’‑
gatgagattggcatggctt-3’(seq id no：3)；
[0051]
r：5
’‑
caccttcaccgttccagtt-3’(seq id no：4)。
[0052]
4、荧光定量pcr。
[0053]
荧光定量pcr反应体系如下表所示。
[0054]
表2荧光定量pcr反应体系
[0055][0056]
将上述试剂混匀加入特定八连管中，手指轻弹去除气泡，置于荧光定量pcr仪系统进行扩增，扩增条件如下：95℃3min，循环40次；95℃12s，58℃40s。每个样品设三个重复样。待反应终止，将β-actin基因设为为内部参照物，采用2
‑△△
ct
法得出linc01374的相对表达量。
[0057]
表3各组血清中linc01374基因mrna表达结果分析
[0058][0059]
*代表两组之间
△
ct值具有统计学意义。
[0060]
ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。本实施例中
△
ct代表血清中linc01374基因mrna扩增循环数与相应细胞内参β-actin扩增循环数的差值。
[0061]
上述结果可见，胃癌血清和正常血清中linc01374基因mrna的
△
ct之间具有差异性，且组间的差异具有统计学意义，提示可将胃癌血清中linc01374作为区分辨别胃癌的候选标志物。
[0062]
实施例2
[0063]
比较胃癌患者及健康人血清外泌体linc01374基因差异。
[0064]
1、提取外泌体。
[0065]
超速离心法提取血清外泌体具体操作步骤：
[0066]
取血清，常温2000g离心15min，收集上清；4℃4000g离心20min，收集上清；4℃10000g离心30min，取上清，用无菌pbs 1:1稀释；4℃120000g离心70min，弃上清，收集沉淀即为外泌体，沉淀用pbs溶解备用。
[0067]
2、外泌体鉴定。
[0068]
(1)电镜鉴别。
[0069]
取上述获得的外泌体，进行电镜鉴定，方法如下：取20μl外泌体样本，加10μl 1％戊二醛固定；将固定的外泌体滴入碳支持膜网格中，室温放置10min后用滤纸吸干液体，滴加磷钨酸草酸在网格中染色，1min后用滤纸吸干多余液体，室温充分干燥后，于80kv透射电
镜下进行观察。
[0070]
图1、图2为上述外泌体鉴定结果，可以看出提取得到的外泌体呈现典型杯状囊泡结构，粒径为40-100nm。
[0071]
(2)粒径测量。
[0072]
取上述获得的外泌体，测量其粒径，用pbs将纳米粒度分仪调零；将外泌体稀释至200μl，涡旋振荡15min后加入纳米粒度分析仪进行检测。
[0073]
检测结果显示，外泌体粒径为76
±
8nm，与电镜结果相符。
[0074]
(3)western blot检测表面标记物。
[0075]
western blot对上述获得的外泌体表面标记因子进行检测，方法如下：
[0076]
bca法测定外泌体样品蛋白含量，取20μg蛋白含量的样品与上样缓冲液混合，采用10％sda-page电泳后转移到pvdf膜上；在室温下采用5％脱脂牛奶封闭2h；根据蛋白相对分子质量进行切膜、转印后，分别将相对应的一抗(cd63和tsg101)以1：2000稀释后，于4℃孵育过夜；tbst洗膜3次，每次5min，采用二抗1：5000于室温下孵育2h；洗膜后，通过ecl发光液使膜条带显色，通过全能型化学发光成像系统进行分析。
[0077]
bca检测结果表示，提取得到的外泌体蛋白浓度约在1.3μg/ml。
[0078]
western blot结果显示cd63和tsg101均有明显条带，结果如图3所示，鉴定外泌体提取成功。
[0079]
3、比较胃癌患者及健康人血清来源外泌体linc01374表达差异。
[0080]
(1)血清外泌体rna的提取。
[0081]
将750μl的trizol-ls裂解液加入250μl外泌体悬液混匀，加入提前预冷氯仿200μl，上下轻摇混匀；冰浴静置2min后10000rpm 4℃离心20min。取上清层的无色水相于无rna酶的ep管中，加入提前预冷异丙醇500μl，混匀后冰浴静置5min；10000rpm 4℃离心15min，管底的白色沉淀即为rna，弃上清加1ml 75％乙醇(depc水配制)10000rpm 4℃离心5min；弃上清待管内干燥，向ep管中加入30μl depc水，55℃水浴溶解rna。
[0082]
(2)特异性引物。
[0083]
设计linc01374基因的特异性引物，如下所示：
[0084]
f：5
’‑
cgcttgaccgctcttcctttcc-3’(seq id no：1)；
[0085]
r:5
’‑
tgtgctactgtctcctgtccatcc-3’(seq id no：2)。
[0086]
内参β-actin基因：
[0087]
f：5
’‑
gatgagattggcatggctt-3’(seq id no：3)；
[0088]
r：5
’‑
caccttcaccgttccagtt-3’(seq id no：4)。
[0089]
(3)荧光定量pcr。
[0090]
荧光定量pcr反应体系如下表所示。
[0091]
表4荧光定量pcr反应体系
[0092]
[0093][0094]
将上述试剂混匀加入特定八连管中，手指轻弹去除气泡，置于荧光定量pcr仪系统进行扩增，扩增条件如下：95℃3min，循环40次；95℃12s，58℃40s。每个样品设三个重复样。待反应终止，将β-actin基因设为为内部参照物，采用2
‑△△
ct
法得出linc01374的相对表达量。
[0095]
(4)计算linc01374基因表达差异。
[0096]
通过上述检测得到胃癌患者血清和正常人血清外泌体中linc01374基因表达差异，结果如下表所示。
[0097]
表5各组血清外泌体中linc01374基因mrna表达结果分析
[0098][0099]
*代表两组
△
ct之间具有统计学意义。
[0100]
ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。该实验
△
ct代表血清外泌体中linc01374基因mrna扩增循环数与相应细胞内参β-actin扩增循环数的差值。
[0101]
上述结果可见，采用方差分析分析胃癌血清和正常血清外泌体中linc01374基因mrna的
△
ct之间具有差异性，且组间的差异具有统计学意义，提示可将外泌体linc01374作为区分辨别胃癌的候选标志物。
[0102]
实施例3
[0103]
比较正常胃上皮细胞ges-1及胃癌细胞sgc-7901培养液上清中外泌体linc01374基因差异。
[0104]
1、细胞培养。
[0105]
(1)细胞复苏。
[0106]
将冻存的正常胃上皮细胞ges-1和sgc-7901细胞从-80℃冰箱中取出，快速放入37℃温水中，细胞融化后快速将液体吸至离心管800g转速离心5min，弃上清液，用适量rpmi-1640培养液重悬细胞，转移至培养瓶，培养瓶中为含10％血清和青霉素和链霉素双抗的细胞培养液将细胞混匀后置于细胞培养箱中培养(37℃，co
2 5％)。
[0107]
(2)细胞传代。
[0108]
待细胞密度为90％，弃上清液，pbs洗涤三次，加入适量0.25％胰蛋白酶，放回培养箱进行消化。待细胞变圆，间隙增大则加入培养液终止消化。用移液器反复吹打细胞，转移至离心管中，离心800g 10min，弃上清，向管底沉淀中加入培养液吹打混匀制成细胞悬液，按1:3的比例分装于三个细胞培养瓶，置于细胞培养箱中培养(37℃，co
2 5％)。
[0109]
2、外泌体的提取与鉴定
[0110]
取上述细胞培养液，随后采用与实施例2中相同的方法和步骤提取外泌体并鉴定，鉴定结果如图4、图5所示，可以看出提取得到的外泌体呈现典型杯状囊泡结构，western blot结果如图6所示，显示cd63和tsg101均有明显条带，鉴定外泌体提取成功。
[0111]
3、荧光定量pcr法检测正常胃上皮细胞ges-1和sgc-7901细胞培养液外泌体中linc01374基因表达差异。
[0112]
参照实施例1的方法进行。
[0113]
通过上述检测得到细胞培养液外泌体中linc01374基因表达如下。
[0114]
表6各组血清外泌体中linc01374基因mrna表达结果分析
[0115][0116]
*代表两组
△
ct之间具有统计学意义。
[0117]
ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。该实验
△
ct代表细胞外泌体中linc01374基因mrna扩增循环数与相应细胞内参β-actin扩增循环数的差值。
[0118]
结果显示：胃癌细胞培养液外泌体中目的基因linc01374表达水平显著高于正常胃癌细胞培养液外泌体，且组间的差异具有统计学意义，提示可将外泌体linc01374作为区分辨别胃癌的候选标志物。
[0119]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0120]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

技术特征：
1.生物样本中linc01374及编码mrna在诊断胃癌中的应用。2.生物样本中linc01374及编码mrna作为生物标志物在开发和/或制备用于胃癌的诊断用途的产品中的应用。3.一种检测生物样本中linc01374及编码mrna的试剂盒，其特征在于，包括检测生物样本中linc01374和/或linc01374编码mrna的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述生物样本取自：血液、尿液、羊水中的至少一种。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述生物样本为外周血。6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述对照样本中含有预定量的linc01374和/或linc01374编码mrna，作为判断linc01374和/或linc01374编码mrna的高表达或低表达的对照。7.根据权利要求3-6中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用定量逆转录pcr法检测。8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述定量逆转录pcr法中，采用以下引物对进行荧光定量pcr反应：正向序列：5
’‑
cgcttgaccgctcttcctttcc-3’；反向序列：5
’‑
tgtgctactgtctcctgtccatcc-3’。9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下内参linc01374荧光定量pcr引物对：正向引物：5
’‑
gatgagattggcatggctt-3’反向引物：5
’‑
caccttcaccgttccagtt-3’。

技术总结
本发明涉及一种Linc01374及编码mRNA在诊断胃癌中的应用，涉及生物技术和医学技术领域。本发明提供了一种生物样本中Linc01374及编码mRNA在诊断胃癌中的应用，为胃癌诊断提供候选标志物，成本低，其广泛应用能够对胃癌高危患者做出精准、快速及无创的诊断。快速及无创的诊断。


技术研发人员：郭笑 叶思萍 杨文闯 石立强 安丽萍 林睿
受保护的技术使用者：北华大学
技术研发日：2021.12.13
技术公布日：2022/3/8