一种动物源基质中ipfentrifluconazole的检测方法

1.本发明涉及农药残留检测技术领域，特别是涉及一种动物源基质中ipfentrifluconazole的检测方法。


背景技术：

2.三唑类杀菌剂是一类老牌产品，上世纪70年代即有产品诞生。由于三唑类杀菌剂对锈病、壳针孢菌和镰刀菌等病原菌引起的病害具有广谱活性,成为谷物用杀菌剂市场的重要支柱；它们的内吸性又使其具有较好的预防和治疗作用。其广谱活性也使该类产品顺利进入其他许多作物领域，尤其是大豆、葡萄、果树和蔬菜等市场。
3.三唑类杀菌剂因作用位点单一，易产生抗性。过去10多年里，老的三唑类杀菌剂如氟环唑等已对小麦壳针孢菌的防效下降。而且，环丙唑醇、苯醚甲环唑、氟环唑等三唑类杀菌剂都被列入欧盟替代产品名录，它们可能被归类为内分泌干扰物。这就意味着老的三唑类杀菌剂或将面临更为严格的审查，甚至被禁止。三唑类杀菌剂虽自身强大，但其面临的抗性问题、可能遭遇禁限用，以及来自其他新老产品的竞争压力等，都将成为三唑类杀菌剂市场未来增长的障碍。自2002年硅氟唑推出之后，三唑类杀菌剂进入了无新品上市的空档期。ipfentrifluconazole，打破了三唑类杀菌剂10多年无新品上市的局面。
4.ipfentrifluconazole的作用机理是抑制病菌麦角甾醇的生物合成，使菌体细胞膜功能受到破坏，因而抑制或干扰菌体附着胞及吸器的发育、菌丝和孢子的形成。ipfentrifluconazole是巴斯夫具有划时代意义的新产品，有望成为高效控制病害的重要工具，并将用来减缓杀菌剂的抗性发展，适用于世界范围内许多大田作物和特种作物，如玉米、谷物、大豆和经济作物等。
5.已有研究表明，三唑类农药可能通过食物链而在哺乳动物体内残留，猪肉，鸡蛋和牛奶作为我国消费量较高的三种动物源食品，测定该样品中的农药残留具有一定的代表性。因此，基于食品安全和居民健康考虑，检测动物源基质中ipfentrifluconazole的残留量是十分必要的。而目前，农药残留分析技术关键在于样品的前处理，目前常用的农药残留检测样品前处理方法有固相萃取法，固相微萃取、基质固相分散萃取和凝胶渗透色谱等，上述各种方法普遍存在的不足是，劳动强度大、耗费时间长、实际和材料消耗费量大，有的方法还需要配备专门的设备。现还有提出用分散固相萃取法进行农药残留检测样品前处理的，目前此检测方法仍然是利用传统化学提取方法，并结合净化材料例如psa、c18、gcb等获取待检测物，再进行检测。但是由于动物源样品油脂含量较高，对于其分离净化难度较高，本领域目前没有特定有效的净化材料组合和提取方法用于准确、稳定的检测动物源基质中ipfentrifluconazole。因此，亟需提供一种用于检测动物源基质中ipfentrifluconazole新方法，以改变目前检测方法准确性和稳定性低的问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种动物源基质中ipfentrifluconazole的检测方法，以解
决上述现有技术存在的问题，该方法准确性高、稳定性好。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种动物源基质中ipfentrifluconazole的检测方法，包括以下步骤：
9.(1)取待测动物源样品，依次加入乙腈提取、氯化钠盐析，离心，收集上清液ⅰ；
10.(2)用羟基修饰多壁碳纳米管净化所述上清液ⅰ，离心，收集上清液ⅱ，利用uplc-ms/ms检测上清液ⅱ中ipfentrifluconazole的含量。
11.优选的是，所述待测动物源样品：乙腈的质量体积比为(4-7)g:10ml，所述待测动物源样品：氯化钠质量体积比为(4-7)g:2ml。
12.优选的是，步骤(1)中，离心条件为：1110
×
g离心5min；
13.步骤(2)中，离心条件为：9600
×
g离心3min。
14.优选的是，所述羟基修饰多壁碳纳米管：所述上清液ⅰ的质量体积比为10mg:(1-2)ml。
15.优选的是，所述uplc-ms/ms检测条件为：洗脱液为乙腈:0.05甲酸水体积比(10:90)-(90:10)梯度洗脱；流速为0.35ml/min；进样量为5μl。
16.优选的是，所述待测动物源样品包括鸡蛋、猪肉或牛奶。
17.优选的是，所述鸡蛋、猪肉或牛奶在乙腈提取前进行预处理，具体为：
18.所述鸡蛋去壳，将蛋清和蛋黄搅拌均匀，密封标记，-20℃冷冻保存；
19.所述猪肉去骨，且所述猪肉包括脂肪含量小于10％的脂肪组织，绞碎、混匀，密封标记，-20℃冷冻保存；
20.所述牛奶为生牛乳，混合均匀，密封标记，4℃避光保存。
21.本发明公开了以下技术效果：
22.本发明利用分散固相萃取法对动物源样品进行前处理获取农药成分ipfentrifluconazole，该方法通过优化乙腈提取、氯化钠盐析等条件，并且结合净化材料羟基修饰多壁碳纳米管，可以针对油脂含量高的动物源样品进行吸附净化，改善目标分析物的分配方式，然后再结合uplc-ms/ms检测提取所得到的靶标农药，大大提高检测方法的准确性和稳定性。本发明公开的检测方法，为动物源样品农药残留检测提供新的方向和方法。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为实施例1中ipfentrifluconazole溶剂(乙腈)标准曲线图；
25.图2为实施例1中ipfentrifluconazole在猪肉基质中的标准曲线图；
26.图3为实施例1中ipfentrifluconazole在鸡蛋基质中的标准曲线图；
27.图4为实施例1中ipfentrifluconazole在牛奶基质中的标准曲线图；
28.图5为实施例1的色谱条件下测定的ipfentrifluconazole的典型色谱图和分子结构图；
29.图6为实施例1中猪肉空白对照色谱图；
30.图7为实施例1中鸡蛋空白对照色谱图；
31.图8为实施例1中牛奶空白对照色谱图；
32.图9为实施例1中ipfentrifluconazole猪肉基质中最低添加水平(0.001mg/kg)典型色谱图；
33.图10为实施例1中ipfentrifluconazole鸡蛋基质中最低添加水平(0.001mg/kg)典型色谱图；
34.图11为实施例1中ipfentrifluconazole牛奶基质中最低添加水平(0.001mg/kg)典型色谱图。
具体实施方式
35.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
36.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
37.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
38.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
39.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
40.以下实施例所用检测试剂及标准品如下：
41.乙腈：色谱纯，批号ja080730，由fisher chemical提供。
42.氯化钠：分析纯，批号20180904，由北京市通广精细化工公司提供。
43.甲酸：色谱纯，批号s2510100，由上海安谱科学仪器有限公司提供。
44.ipfentrifluconazole：纯度98.4％，由百灵威科技提供。
45.羟基修饰多壁碳纳米管，由天津博纳艾杰尔科技有限公司提供。
46.所用仪器设备如下：
47.超高效液相色谱-三重四级秆质谱联用仪：waters acquity uplc h-class/xevo tqd，沃特世公司；
48.台式离心机：fc-5706型低速离心机，奥豪斯国际贸易有限公司；
49.分析天平：mettler toledo me204e万分之一分析天平，精度i级，梅特勒-托利多
公司；
50.电子天平：scout pro sps202fzh百分之一电子天平，精度iii级，奥豪斯公司；
51.移液枪：5ml、1000μl、200μl、100μl、20μl移液枪，eppendorf公司；
52.瓶口分配器：5-50ml，brand公司；
53.实验室纯水系统：s30uv型，上海和泰仪器有限公司；
54.多管涡旋混合仪：mtv-100型，杭州奥盛仪器有限公司；
55.高速离心机：pico 17型，thermos scientific公司。
56.所用流动相溶液和提取液配制方法如下：
57.0.05％甲酸水(v/v)：量取1000ml纯净水于溶剂瓶中，加入500μl色谱纯甲酸，摇匀后静置，备用。
58.所用标准母液和工作液配制方法如下：
59.第一次混合标准溶液配制：
60.ipfentrifluconazole标准母液：称取0.0120g ipfentrifluconazole，用乙腈溶解并定容到20ml，浓度为500.00mg/l；
61.10mg/l ipfentrifluconazole标准溶液：准确量取1.0ml ipfentrifluconazole 100mg/l混合标准溶液，用乙腈定容到10ml。
62.实施例1
63.1、动物源样品制备
64.将市场采集的适量新鲜的鸡蛋，去壳，将蛋清和蛋黄搅拌均匀，密封标记，-20℃冷冻保存。
65.猪肉样品去骨，包含脂肪含量小于10％的脂肪组织，用绞肉机绞碎，充分混匀，用四分法缩分至不少于500g，作为试样，装入清洁容器内，密封标记，-20℃冷冻保存。
66.牛奶(生牛乳)取不少于500g代表性的牛奶(生牛乳)样品，充分混匀，置于样品瓶中，密封标记，4℃冰柜中避光保存。
67.2、动物源样品中ipfentrifluconazole的检测
68.(1)待测液的制备：
69.分别将5.00(
±
0.05g)的鸡蛋、猪肉及牛奶样品称重至50ml ptfe离心管中。添加10ml乙腈，振荡提取5min，加2g nacl。重复震荡5min，然后在1110
×
g相对离心力下离心5min，取1.5ml上清液转移到含有10mg羟基修饰多壁碳纳米管的离心管中，涡旋震荡5min，9.6
×
g相对离心力下离心3min，取上清液经0.22um滤膜过滤后通过uplc-ms/ms进行测定。
70.(2)标准溶液准备
71.将含有10mg/l的ipfentrifluconazole标准溶液用空白动物源基质提取液稀释至浓度为0.001、0.01、0.1、0.25、0.5、0.75和1mg/l，制得标准溶液。
72.(3)uplc-ms/ms检测
73.利用uplc-ms/ms对步骤(1)制备的待测液及步骤(2)制备的标准溶液进行测定，仪器参数设定如下：
74.色谱柱：waters acquitybeh c18(2.1mm
×
100mm，1.7μm)；
75.柱温：40℃；
76.流速：0.35ml/min；
77.进样量：5μl；
78.梯度洗脱条件见表1：
79.表1流动相及梯度脱洗条件
[0080][0081]
离子源：电喷雾离子源esi；
[0082]
扫描方式：正离子源；
[0083]
毛细管电压：3.0kv；
[0084]
离子源温度：150℃；
[0085]
脱溶剂温度：500℃；
[0086]
脱溶剂气流量：1000l/h；
[0087]
锥孔气流量：50l/h；
[0088]
检测方式：多重反应监测(mrm)见表2：
[0089]
表2 ipfentrifluconazole的主要参考质谱系数
[0090][0091]
(4)分析结果计算：
[0092]
根据标准溶液的测定结果，绘制标准曲线，利用绘制的曲线计算待测液中ipfentrifluconazole(图谱见图5)的含量。
[0093]
表3 ipfentrifluconazole乙腈提取液标准曲线
[0094][0095]
不同浓度ipfentrifluconazole乙腈提取液标准曲线如表3所示，根据表3绘制的标准曲线，见图1。从图1中可以看出，所得线性回归方程的相关系数＞0.992，表示ipfentrifluconazole在0.001～1mg/l的范围内测得峰面积与浓度的呈线性相关。
[0096]
表4 ipfentrifluconazole空白猪肉提取液标准曲线
[0097][0098]
根据表4绘制的标准曲线见图2，从图2中可以看出，所得线性回归方程的相关系数＞0.992，表示ipfentrifluconazole在0.001～1mg/l的范围内测得峰面积与浓度的呈线性相关。
[0099]
表5 ipfentrifluconazole空白鸡蛋提取液标准曲线
[0100][0101]
根据表5绘制的标准曲线见图3，从图3中可以看出，所得线性回归方程的相关系数＞0.992，表示ipfentrifluconazole在0.001～1mg/l的范围内测得峰面积与浓度的呈线性
相关。
[0102]
表6 ipfentrifluconazole空白牛奶提取液标准曲线
[0103][0104][0105]
根据表6绘制的标准曲线见图4，从图4中可以看出，所得线性回归方程的相关系数＞0.992，表示ipfentrifluconazole在0.001～1mg/l的范围内测得峰面积与浓度的呈线性相关。
[0106]
为了说明本发明检测方法中各项条件优化后，相比现有技术中常规技术具有更好的优势，同时进行了如下对比实验。
[0107]
对比例1
[0108]
猪肉中ipfentrifluconazole的检测方法：
[0109]
与实施例1相比，区别在于将步骤(1)中添加10ml乙腈的离心管替换为添加0.1％甲酸-乙腈的离心管，省略步骤(2)绘制标准曲线的过程。
[0110]
对比例2
[0111]
猪肉中ipfentrifluconazole的检测方法：
[0112]
与实施例1相比，区别在于将步骤(1)中添加10ml乙腈的离心管替换为添加0.1％氨水-乙腈的离心管，省略步骤(2)绘制标准曲线的过程。
[0113]
对比例3
[0114]
猪肉中ipfentrifluconazole的检测方法：
[0115]
与实施例1相比，区别在于将步骤(1)中装有10mg羟基修饰多壁碳纳米管的离心管替换为装有50mg c18的离心管，省略步骤(2)绘制标准曲线的过程。
[0116]
对比例4
[0117]
猪肉中ipfentrifluconazole的检测方法：
[0118]
与实施例1相比，区别在于将步骤(1)中装有10mg羟基修饰多壁碳纳米管的离心管替换为装有50mg psa的离心管，省略步骤(2)绘制标准曲线的过程。
[0119]
实施例2
[0120]
考察实施例1及对比例1～4检测方法的准确度和精密度。
[0121]
根据实施例1的检测方法，在处理样品的同时，分别按照0.001、0.01、0.1和1mg/kg的添加量加入混合标准溶液，每组设置5个平行样品，根据测定结果，计算回收率和相对标准偏差rsd。对比例1～4的检测方法，在处理猪肉样品时设定0.01和1mg/kg两个添加量加入混合标准溶液，每组设置5个平行样品，根据测定结果，计算回收率和相对标准偏差rsd。
[0122]
结果见表7～表13。不同添加水平对回收率和相对标准偏差的要求见表6。
[0123]
表7 ipfentrifluconazole在猪肉中添加回收结果(实施例1检测方法)
[0124][0125]
表8 ipfentrifluconazole在猪肉中添加回收结果(对比例1检测方法)
[0126][0127]
表9 ipfentrifluconazole在猪肉中添加回收结果(对比例2检测方法)
[0128][0129]
表10 ipfentrifluconazole在猪肉中添加回收结果(对比例3检测方法)
[0130][0131]
表11 ipfentrifluconazole在猪肉中添加回收结果(对比例4检测方法)
[0132][0133]
表12 ipfentrifluconazole在鸡蛋中添加回收结果(实施例1检测方法)
[0134][0135]
表13 ipfentrifluconazole在牛奶中添加回收结果(实施例1检测方法)
[0136][0137]
表14不同添加水平对回收率和相对标准偏差的要求
[0138][0139][0140]
从表7～表14中的数据可以看出，本发明的动物源基质中的ipfentrifluconazole的检测方法回收率及相对标准偏差均符合欧盟农药残留参考实验室《食品和饲料中农药残留分析质量控制和方法验证程序》，说明本发明提供的检测方法准确度和精密度均符合要求。
[0141]
从表7～表10中的数据可以看出，实施例1的检测方法的准确度和精密度高于对比例1～4的检测方法，说明不同的提取剂和净化材料对于动物源样品的农药残留检测结果存在较大影响，经过对提取剂和净化材料进行改进后，明显提高了检测方法的准确度和精密度。ipfentrifluconazole在乙腈中可以获得良好的回收率，添加甲酸和氨水都会导致回收率偏高。新型纳米材净化料优于传统净化剂，这可能是由于较大的比表面积和高吸附容量，在减少用量的同时能够从油脂含量较高的动物源样品中选择性萃取脂质，使分析结果更加准确。
[0142]
实施例3
[0143]
实施例1的检测方法的专一性：
[0144]
通过实施例1中uplc-ms/ms的检测条件，利用不同的空白动物源基质样品(色谱图见图6-8)用于评估该方法的专一性，如图9～图11所示，在ipfentrifluconazole的保留时间点均未检测到干扰峰，表明该方法专一性良好。
[0145]
实施例4
[0146]
实施例1的检测方法的定量限：
[0147]
利用实施例1中uplc-ms/ms的检测条件，测定在空白提取溶液中添加不同浓度的ipfentrifluconazole后的回收率和相对标准偏差，以表7所述标准的最低浓度为定量限，测定结果为动物源基质中ipfentrifluconazole的定量限为0.001mg/kg，色谱图如图9～图11所示。
[0148]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种动物源基质中ipfentrifluconazole的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取待测动物源样品，依次加入乙腈提取、氯化钠盐析，离心，收集上清液ⅰ；(2)用羟基修饰多壁碳纳米管净化所述上清液ⅰ，离心，收集上清液ⅱ，利用uplc-ms/ms检测上清液ⅱ中ipfentrifluconazole的含量。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测动物源样品：乙腈的质量体积比为(4-7)g:10ml，所述待测动物源样品：氯化钠质量体积比为(4-7)g:2ml。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中，离心条件为：1110
×
g离心5min；步骤(2)中，离心条件为：9600
×
g离心3min。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述羟基修饰多壁碳纳米管：所述上清液ⅰ的质量体积比为10mg:(1-2)ml。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述uplc-ms/ms检测条件为：洗脱液为乙腈:0.05甲酸水体积比(10:90)-(90:10)梯度洗脱；流速为0.35ml/min；进样量为5μl。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述待测动物源样品包括鸡蛋、猪肉或牛奶。7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述鸡蛋、猪肉或牛奶在乙腈提取前进行预处理，具体为：所述鸡蛋去壳，将蛋清和蛋黄搅拌均匀，密封标记，-20℃冷冻保存；所述猪肉去骨，且所述猪肉包括脂肪含量小于10％的脂肪组织，绞碎、混匀，密封标记，-20℃冷冻保存；所述牛奶为生牛乳，混合均匀，密封标记，4℃避光保存。

技术总结
本发明公开了一种动物源基质中ipfentrifluconazole的检测方法，属于农药残留检测技术领域。该检测方法包括：取待测动物源样品，依次加入乙腈提取、氯化钠盐析，离心，收集上清液Ⅰ；用羟基修饰多壁碳纳米管净化上清液Ⅰ，离心，收集上清液Ⅱ，利用UPLC-MS/MS检测上清液Ⅱipfentrifluconazole的含量。本发明采用分散固相萃取法，结合UPLC-MS/MS对提取得到的物质进行测定，平均回收率为87.0％～100.9％，相对标准偏差为1.8％～5.5％，检出限为0.001mg/kg。本发明提供的检测方法具有操作简便，灵敏度高，准确性好、快速、高效的优点。高效的优点。高效的优点。


技术研发人员：陈增龙 刘子琪 张明浩 郭靖立 李薇
受保护的技术使用者：中国科学院动物研究所
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8