一种透明质酸片段及其制剂的应用与质量控制活性检测方法

1.本发明涉及生物医学领域，特别是涉及一种透明质酸片段及其制剂的应用及质量控制活性检测方法。


背景技术：

2.透明质酸由n-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸的不断重复单位组成，存在于人体的所有组织，富有弹性，具有保水、润滑和缓冲的作用。透明质酸在人体内的半衰期为15小时，每天大约有1/3的体内透明质酸经历降解和再合成的更新过程，即一种高分子量透明质酸和低分子量透明质酸片段共存的状态。分子量大小不同的透明质酸和透明质酸片段与人体多种受体相互作用，包括cd44、lyve-1、rhamm、hare、siglec-9、tlr2、cemip和tmem2，参与调节白细胞交通和炎症因子分泌。例如，cd44作为透明质酸的主要受体，参与细胞之间的相互作用，在淋巴细胞的归巢、细胞激活和信号传导中有重要作用。
3.目前的主流文献表明透明质酸和透明质酸片段的生物活性和功能与它们的分子量大小有关，即分子量不同的透明质酸和透明质酸片段活性和功能也不同。
4.专利申请号为2020101691638的一种透明质酸片段的新应用及稳定制造方法，以及专利申请号为2021102700130的一种透明质酸片段的新应用及制造方法，均公开了一种透明质酸片段，该透明质酸片段为使用重组人透明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量为35
±
8kda(35kda左右)的透明质酸片段。但目前还没有文献报道发现该片段及含有其的制剂与慢性疼痛(包含慢性神经病理性疼痛和慢性炎症性疼痛)的相关的报道。
5.疼痛分急性的伤害性疼痛和慢性疼痛两种。慢性疼痛分难以治疗的慢性神经病理性疼痛和慢性炎症性疼痛两种。其中，神经病理性疼痛是由外周和中枢神经系统的神经元损伤引起的，涉及这些系统的敏感化。在敏化中，外周伤害感受器的刺激增加，从而将疼痛信号放大到中枢神经系统。在中枢敏化中，起源于脊髓背角的神经元受到过度刺激，增加了向大脑发出的疼痛信号，从而增加了痛觉。它通常与慢性痛觉异常和痛觉过敏有关。换句话说，神经病理性疼痛是由躯体感觉神经系统的损伤或疾病而直接造成的疼痛。神经病理性疼痛本身是一种疾病。伤害性疼痛与组织损伤和由此产生的炎症过程有关。换句话说，伤害性疼痛是炎症性疾病的症状。另外，神经病理性疼痛一般是疼痛发病机制不明的疼痛。例如，临床上最常见的4种神经病理性疼痛包括痛性糖尿病周围神经病、三叉神经痛、带状疱疹后神经痛和中枢性疼痛(如卒中后疼痛)。
6.一氧化氮(no)是一种高度扩散的自由基生物信号的气体，由一个细胞产生的气体穿透细胞膜并调节另一细胞的功能来传递信号。一氧化氮(no)分别由神经元和内皮的nnos和巨噬细胞和神经胶质细胞(小胶质细胞)的inos合成酶制造。目前有文献报道巨噬细胞和小胶质细胞和炎症组织一氧化氮(nitric oxide或no)水平和原因不明的难以治疗的慢性神经病理性疼痛有关。但目前还没有文献报道透明质酸或透明质酸片段直接或间接调节巨噬细胞、小胶质细胞和肌肉细胞的inos合成酶制造一氧化氮(no)。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种透明质酸片段及含有其的制剂的新应用或是为慢性疼痛(尤其是慢性神经病理性疼痛)提供一种新的治疗药物，以及提供对应的质量控制活性检测方法。
8.为解决上述技术问题，本发明提供了一种透明质酸片段或含有其的制剂的应用，所述透明质酸片段为使用重组人透明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量为35
±
8kda的透明质酸片段，所述应用为在制备治疗慢性神经病理性疼痛或慢性炎症性疼痛药物中的应用。
9.本发明还提供了上述透明质酸片段或含有其的制剂在治疗慢性神经病理性疼痛或慢性炎症性疼痛中的应用。
10.进一步地，所述慢性神经病理性疼痛是与巨噬细胞、小胶质细胞和/或肌肉细胞一氧化氮水平相关的难以治疗的慢性神经病理性疼痛；所述慢性炎症性疼痛是与t淋巴细胞一氧化氮水平相关的慢性炎症性疼痛。
11.进一步地，所述慢性神经病理性疼痛是与巨噬细胞、小胶质细胞和/或肌肉细胞的细胞移走相关的神经病理性疼痛疾病；所述慢性炎症性疼痛是与t淋巴细胞的细胞移走相关的慢性炎症性疼痛。
12.进一步地，所述透明质酸片段或含有其的制剂均采用注射液形式，通过腹腔或疼痛部位局部注射；所述平均分子量为35kda。
13.本发明还提供了一种透明质酸片段或含有其的制剂的质量控制活性检测方法，所述透明质酸片段为使用重组人透明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量为35
±
8kda的透明质酸片段，所述检测方法包括对其做巨噬细胞和/或小胶质细胞和/或t淋巴细胞培养液的细胞外一氧化氮水平检测，当细胞外一氧化氮水平降低时合格。
14.进一步地，还同时做巨噬细胞和/或小胶质细胞和/或t淋巴细胞的胶滴内细胞移走检测，当促进胶滴内细胞移走时合格。
15.进一步地，所述巨噬细胞为巨噬细胞raw264.7；所述小胶质细胞为鼠小胶质细胞bv2；所述t淋巴细胞为人t淋巴细胞h9。
16.进一步地，所述透明质酸片段或含有其的制剂均采用注射液形式，通过腹腔或疼痛部位局部注射；所述平均分子量为35kda。
17.本发明偶然发现重组人透明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量为35
±
8kda的透明质酸片段(b-ha或ha35)降低巨噬细胞和小胶质细胞一氧化氮(no)水平。基于此发现，本发明建立了no相关的使用物理压迫小鼠坐骨神经上端诱发的坐骨神经下端神经病理性疼痛模型。本发明研究结果表明透明质酸片段b-ha或ha35降低了no水平,还有效治疗了no相关的小鼠神经病理性疼痛。本发明还发现b-ha或ha35降低的巨噬细胞和小胶质细胞no水平和b-ha或ha35促进的细胞移走相关联。本发明利用这个关联建立了平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35的质量控制活性检测方法。本发明为透明质酸片段及含有其的制剂提供了一种新的应用，也为慢性疼痛，尤其是慢性神经病理性疼痛提供了一种新的治疗药物。
附图说明
18.上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
19.图1、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于巨噬细胞和小胶质细胞培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)的作用效果图。
20.图2、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于联合培养的人肌肉细胞和鼠巨噬细胞(raw264.7)的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)的作用效果图。
21.图3、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于鼠巨噬细胞raw264.7胶滴内细胞移走(p《0.001和p《0.001)的作用效果图。
22.图4、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于鼠巨噬细胞(raw264.7)的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)的作用效果图。
23.图5、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于鼠小胶质细胞bv2胶滴内细胞移走(p《0.001和p《0.001)的作用效果图。
24.图6、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于鼠小胶质细胞bv2的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)的作用效果图。
25.图7、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于人t淋巴细胞h9胶滴内细胞移走(p《0.01和p《0.01)作用效果图。
26.图8、重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对于人t淋巴细胞h9的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)的作用效果图。
27.图9、b-ha(cuff+b-ha)组和神经元一氧化氮合成酶抑制剂7-硝基吲唑7-ni(cuff+7-ni)组和对照组(cuff+saline)相比治疗神经病理性疼痛或缓解坐骨神经压迫制造的小鼠足部痛觉超敏的结果图。注：pwt＝尖端直径为x的von frey filment单丝垂直施加到后爪的足底表面直至其弯曲提供的力(g或gram)；times(days)＝时间(天数)；cuff＝手术中压迫坐骨神经组；sham手术中不压迫坐骨神经组；treatment＝治疗期间。
28.图10、b-ha(cuff+b-ha)组和神经元一氧化氮合成酶抑制剂7-硝基吲唑7-ni(cuff+7-ni)组和对照组(cuff+saline)相比对于样品神经组织一氧化氮(no)水平的作用效果图。注：sham手术中不压迫坐骨神经组；cuff＝手术中压迫坐骨神经组；saline＝生理盐水组。
29.图11、ha+ph20(cuff+ha+hyaluronidase)组和对照组(cuff+ha)相比治疗神经病理性疼痛或缓解坐骨神经压迫制造的小鼠足部痛觉超敏的结果图。注：pwt＝尖端直径为x
的von frey filment单丝垂直施加到后爪的足底表面直至其弯曲提供的力(g或gram)；times(days)＝时间(天数)；cuff＝手术中压迫坐骨神经组；sham手术中不压迫坐骨神经组；treatment＝治疗期间。
具体实施方式
30.以下通过具体的实施例对本发明进行说明，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
31.实施例1
32.目的：建立人单个核细胞thp-1细胞外液一氧化氮(nitric oxide或no)测定方法。
33.方法：取对数生长期的人单个核thp-1细胞，离心后用含10％fbs的rpmi-1640完全培养基重悬细胞，每孔按照5x105cell/ml密度、400ul体积铺于24孔板中，设置空白对照组、ha35组40μg/ml和ha组40μg/ml，放于37℃、5％co2培养箱中孵育24h，24h后收集上清于离心管中，测定细胞分泌的no含量。
34.取出griess reagent i和ii，使恢复至室温。用含10％fbs的rpmi-1640完全培养基稀释标准品(1-100μm)。通常标准品的浓度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μm。按50μl/孔，在96孔板中加入标准品及hsmc细胞所取上清。按50μl/孔，在各孔中加入室温griess reagent i。按50μl/孔，各孔中加入室温griess reagent ii。酶标仪490nm处测定吸光度，根据标准品曲线计算出thp-1细胞各组中no的浓度。
35.结果：如图1所示，重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha明显降低巨噬细胞和小胶质细胞培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01；p《0.01)。
36.讨论和结论：本发明偶然发现重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35降低了巨噬细胞和小胶质细胞的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平。
37.实施例2
38.目的：建立人肌肉细胞+鼠巨噬细胞(raw264.7)细胞外液一氧化氮(nitric oxide或no)测定方法。
39.方法：取对数生长期的人骨骼肌肉hsmc细胞，胰酶消化后，用含10％fbs的dmem完全培养基重悬细胞，每孔按照1x105cell/ml密度、400ul体积铺于24孔板中，放于37℃、5％co2培养箱中孵育过夜，待第二天贴壁后，弃去培养基，按照每孔2x105cell/ml密度加入鼠巨噬细胞raw264.7，激活hsmc细胞炎症反应，设置空白对照组、ha35组40μg/ml和ha组40μg/ml，继续培养48h后收集上清于离心管中，测定细胞分泌的no含量。
40.取出griess reagent i和ii，使恢复至室温。用含10％fbs的dmem完全培养基稀释标准品(1-100μm)。通常标准品的浓度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μm。按50μl/孔，在96孔板中加入标准品及hsmc细胞所取上清。按50μl/孔，在各孔中加入室温griess reagent i。按50μl/孔，各孔中加入室温griess reagent ii。酶标仪490nm处测定吸光度，根据标准品曲线计算出hsmc细胞各组中no的浓度。
41.结果：如图2所示，重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透
明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha明显降低了联合培养的人肌肉细胞和鼠巨噬细胞(raw264.7)的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)。
42.讨论和结论：本发明偶然发现重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35降低了联合培养的人肌肉细胞和鼠巨噬细胞(raw264.7)的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平。
43.实施例3
44.目的：重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对巨噬细胞raw264.7胶滴内细胞移走和一氧化氮(nitric oxide或no)水平的影响研究。
45.方法：取对数生长期的鼠巨噬细胞raw264.7离心，用1
×
dmem培养液重悬，调整细胞密度至5
×
107个/ml。将0.8％琼脂糖灭菌溶液置于37℃水浴，取等量琼脂糖灭菌溶液与含20％fbs和2％青链霉素的dmem培养液混合，再取等量上述raw264.7细胞悬液混合，置37℃水浴保温。取96孔板于各孔中加入2μl raw264.7细胞琼脂糖混合液，要求在孔底中心形成直径约为2mm的胶滴。将铺好胶滴的96孔板放置于4℃，15min。配制含10％fbs、40μg/ml b-ha+10％fbs、40μg/ml ha+10％fbs的dmem培养液，待孔内琼脂糖胶滴凝固后，将100μl上述试剂分别缓慢加入各孔，每组6个平行。将96孔板置于37℃、5％co2恒温培养箱培养72h，培养结束后于倒置显微镜下观察迁移结果并拍照记录，运用图像处理软件imagej计算细胞迁移的面积。
46.收集96孔板各组的上清液，测定细胞分泌的no含量。取出griess reagent i和ii，使恢复至室温。用含10％fbs的dmem完全培养基稀释标准品(1-100μm)。通常标准品的浓度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μm。按50μl/孔，在96孔板中加入标准品及raw264.7细胞所取上清。按50μl/孔，在各孔中加入室温griess reagent i。按50μl/孔，各孔中加入室温griess reagent ii。酶标仪490nm处测定吸光度，根据标准品曲线计算出raw264.7细胞各组中no的浓度
47.结果：重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha明显促进了鼠巨噬细胞raw264.7胶滴内细胞移走(p《0.001和p《0.001)(图3)和明显降低了鼠巨噬细胞(raw264.7)的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)(图4)。
48.讨论和结论：(1)本发明发现b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)降低了巨噬细胞raw264.7一氧化氮(nitric oxide或no)水平和促进了巨噬细胞raw264.7胶滴内细胞移走；(2)本发明进一步发现降低的一氧化氮(nitric oxide或no)水平和促进的巨噬细胞raw264.7细胞移走相关联；(3)本发明利用这个关联建立了平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35注射液的质量控制活性检测方法，包括同时做巨噬细胞raw264.7细胞外一氧化氮(nitric oxide或no)水平检测和巨噬细胞raw264.7胶滴内细胞移走检测的方法。
49.实施例4
50.目的：重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对鼠小胶质细胞bv2胶滴内细胞移走和一氧化氮(nitric oxide或no)水平的影响研究。
51.方法：取对数生长期的鼠小胶质细胞bv2胰酶消化后离心，用1
×
mem培养液重悬，调整细胞密度至5
×
107个/ml。将0.8％琼脂糖灭菌溶液置于37℃水浴，取等量琼脂糖灭菌溶液与含20％fbs和2％青链霉素的mem培养液混合，再取等量上述bv2细胞悬液混合，置37℃水浴。取96孔板于各孔中加入2μl raw264.7细胞琼脂糖混合液，要求在孔底中心形成直径约为2mm的胶滴。将铺好胶滴的96孔板放置4℃，15min。配制含10％fbs、40μg/ml b-ha+10％fbs、40μg/ml ha+10％fbs的mem培养液，待孔内琼脂糖胶滴凝固后，将100μl上述试剂分别缓慢加入各孔，每组6个平行。将96孔板置37℃、5％co2恒温培养箱培养72h，培养结束后于倒置显微镜下观察迁移结果并拍照记录，运用图像处理软件image j计算细胞迁移的面积。
52.收集96孔板各组的上清液，测定细胞分泌的no含量。取出griess reagent i和ii，使恢复至室温。用含10％fbs的mem完全培养基稀释标准品(1-100μm)。通常标准品的浓度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μm。按50μl/孔，在96孔板中加入标准品及bv2细胞所取上清。按50μl/孔，在各孔中加入室温griess reagent i。按50μl/孔，各孔中加入室温griess reagent ii。酶标仪490nm处测定吸光度，根据标准品曲线计算出鼠小胶质细胞bv2各组中no的浓度.
53.结果：重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha明显促进了鼠小胶质细胞bv2胶滴内细胞移走(p《0.001和p《0.001)(图5)和明显降低了鼠小胶质细胞bv2的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)(图6)。
54.讨论和结论：(1)本发明发现b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)降低了鼠小胶质细胞bv2一氧化氮(nitric oxide或no)水平和促进了鼠小胶质细胞bv2胶滴内细胞移走；(2)本发明进一步发现降低的一氧化氮(nitric oxide或no)水平和促进的鼠小胶质细胞bv2移走相关联；(3)本发明利用这个关联建立了平均分子量35kda的透明质酸片段b-ha或ha35注射液的质量控制活性检测方法，包括同时做鼠小胶质细胞bv2细胞外一氧化氮(nitric oxide或no)水平检测和鼠小胶质细胞bv2胶滴内细胞移走检测的方法。
55.实施例5
56.目的：重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha对t淋巴细胞胶滴内细胞移走和一氧化氮(nitric oxide或no)水平的影响研究。
57.方法：取对数生长期的人t淋巴细胞h9胰酶消化后离心，用1
×
rpmi-1640培养液重悬，调整细胞密度至5
×
107个/ml。将0.8％琼脂糖灭菌溶液置于37℃水浴，取等量琼脂糖灭菌溶液与含20％fbs和2％青链霉素的1
×
rpmi-1640培养液混合，再取等量上述h9细胞悬液
混合，置37℃水浴。取96孔板于各孔中加入2μl h9细胞琼脂糖混合液，要求在孔底中心形成直径约为2mm的胶滴。将铺好胶滴的96孔板放置4℃，15min。配制含10％fbs、40μg/ml b-ha+10％fbs、40μg/ml ha+10％fbs的rpmi-1640培养液，待孔内琼脂糖胶滴凝固后，将100μl上述试剂分别缓慢加入各孔，每组6个平行。将96孔板置37℃、5％co2恒温培养箱培养20h，培养结束后于倒置显微镜下观察迁移结果并拍照记录，运用图像处理软件image j计算细胞迁移的面积。
58.收集96孔板各组的上清液，测定细胞分泌的no含量。取出griess reagent i和ii，使恢复至室温。用含10％fbs的rpmi-1640完全培养基稀释标准品(1-100μm)。通常标准品的浓度可取0,1,2,5,10,20,40,60,100μm。按50μl/孔，在96孔板中加入标准品及h9细胞所取上清。按50μl/孔，在各孔中加入室温griess reagent i。按50μl/孔，各孔中加入室温griess reagent ii。酶标仪490nm处测定吸光度，根据标准品曲线计算出h9细胞各组中no的浓度.
59.结果：重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)和平均分子量1800kda大分子透明质酸ha明显促进了人t淋巴细胞h9胶滴内细胞移走(p《0.05和p《0.01)(图7)和明显降低了人t淋巴细胞h9的培养液中的一氧化氮(nitric oxide或no)水平(p《0.01和p《0.01)(图8)。
60.讨论和结论：(1)本发明发现b-ha或ha35(中国专利申请号202010169163.8或2021102700130)降低了人t淋巴细胞h9的一氧化氮(nitric oxide或no)水平和促进了人t淋巴细胞h9胶滴内细胞移走；(2)本发明进一步发现降低的一氧化氮(nitric oxide或no)水平和促进的鼠小胶质细胞bv2移走相关联；(3)本发明利用这个关联建立了平均分子量35kda的透明质酸片段b-ha或ha35注射液的质量控制活性检测方法，包括同时做人t淋巴细胞h9细胞外一氧化氮(nitric oxide或no)水平检测和人t淋巴细胞h9胶滴内细胞移走检测的方法。
61.实施例6
62.本发明研究偶然发现重组人透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量35kda左右的透明质酸片段b-ha或ha35降低巨噬细胞和小胶质细胞一氧化氮(no)水平。文献报道巨噬细胞和小胶质细胞和炎症组织一氧化氮(nitric oxide或no)水平和原因不明的难以治疗的慢性神经病理性疼痛有关。
63.目的：研究透明质酸片段b-ha或ha35和一氧化氮(nitric oxide或no)合成酶nos抑制剂治疗使用物理压迫小鼠坐骨神经上端诱发的小鼠神经病理性疼痛的效果和对局部神经组织一氧化氮(nitric oxide或no)水平的抑制效果。
64.方法：小鼠坐骨神经病变模型和研究方法。一个多世纪以来，坐骨神经损伤一直被用来研究神经损伤的过程。mosconi和kruger 1996年在形态学上描述了一个周围神经病变模型，在模型中将一个聚乙烯管袖套(a 2mm long splitted section of poly-ethylene tubing，id＝0.38mm,ed＝1.09mm，pe-20)放置在大鼠或小鼠坐骨神经周围，制造神经病理性疼痛模型即在坐骨神经主干周围放置一个短的聚乙烯管袖套，引起同侧持续约3周的热痛觉过敏，和持续同侧机械性痛持续至少2个月。这种坐骨神经神经病理性疼痛模型的脚掌触诱发痛(allodynia)是使用von frey filaments估评。
65.这种实验不是为了研究急性镇痛作用，而是为了检测持续的痛觉超敏和缓解方法，一般通过在考虑第五次早上给药之前对动物进行测试来完成的，从而观察前几天治疗的持久效果。
66.阳性对照组：为神经元一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase or nnos)抑制剂7-硝基吲唑(7-ni)(sigma-aldrich,usa)。7-ni在蒸馏水中制备(0.2μg/50μl)，在坐骨神经压迫(sciatic nerve compression)手术建模后14天手术显微镜(surgical operation microscope)下进行鞘内注射。
67.阴性对照组为和b-ha相同体积的生理盐水saline腹腔注射(ip injection)每天一次。
68.实验组1为35kda左右透明质酸片段b-ha(20mg/ml)2.68mg/kg腹腔注射(ip injection)每天一次。
69.实验组2为重组人明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20注射液(上海第一生化制药厂)(图11)300单位+平均分子量1800kda大分子透明质酸原料(20mg/ml)2.68mg/kg腹腔注射(ip injection)每天一次。
70.实验组3为平均分子量1800kda大分子透明质酸(20mg/ml)2.68mg/kg腹腔注射(ip injection)每天一次。
71.局部神经组织nitric oxide(no)水平测定方法：将新鲜局部分离出的聚乙烯管袖套内和前后约1cm多长的坐骨神经主干切除，天平称重，在冰水制冷的0.1m phosphate buffer,ph 7.4内以1:10,w/vin a teflon potter elvehjem homogenizer(sigma-aldrich)均匀化(homogenization)20s，然后4℃22000克离心30min。从上清液中提取100μl测定no，用重量gram来校正no，表达为μmol/g。测定no方法是基于测定稳定的no氧化代谢物亚硝酸盐和硝酸盐，在这项研究中的数据提出的亚硝酸盐和硝酸盐的水平，这是一氧化氮代谢物的累积总和。
72.小鼠脚掌触诱发痛模型和manual von frey研究方法由生理学家maximilianvon frey开发的，von frey测试是一种评估小鼠机械性痛觉超敏方法的金标准。在本试验中，将动物单独放置在带有网眼或其他可穿透底部的小笼子中。将尖端直径为0.3和0.5mm单丝垂直施加到后爪的足底表面，直至其弯曲，并提供恒定的预定力，小鼠通常传递0.1-7g的力，大鼠通常传递1-80g，持续2
–
5s。注意：通过旋转装置手柄可线性增加力。如果动物表现出任何伤害性行为，包括在应用刺激物期间或在移除细丝后立即快速拔爪、舔爪或抖动爪，则认为反应为阳性。脚掌面是最常用的测试区域。
73.具体方案如下：
74.目的：使用校准的von frey测试评估机械灵敏度。
75.实验设计：变异动物的最小数量：7只雄性+7只雌性
76.试验时间：10周
77.实验次序：
78.(1)习惯化：将老鼠放在高架铁丝网上的试验室中，让每只老鼠静置一小时以适应环境。
79.(2)首先使用以下方法测试左后爪。
80.(3)应将0.6gvon frey测试用作起始灯丝，将灯丝涂抹在后爪的足底表面，向灯丝
施加足够的力，使灯丝弯曲，并保持接触1-2秒。
81.(4)下一根灯丝的尺寸取决于对前一根灯丝的响应；如果未观察到拔出反应，则测试下一个最高的灯丝；如果存在撤回响应，则测试下一个最低的灯丝。
82.(5)继续使用细丝，直到爪子测试5次，每次刺激之间至少间隔2分钟。
83.(6)用右后爪重复测试过程。
84.习惯化24小时后，使用与习惯化期间相同的程序，用von frey测试重新测试小鼠。习惯化48小时后，使用与习惯化阶段相同的程序，用von frey测试重新测试小鼠。
85.结果：
86.如图9所示，本发明结果表明b-ha(cuff+b-ha)组和神经元一氧化氮合成酶抑制剂7-硝基吲唑7-ni(cuff+7-ni)组和对照组(cuff+saline)相比,有效治疗了神经病理性疼痛或缓解了坐骨神经压迫制造的小鼠足部痛觉超敏。这个结果提示透明质酸片段b-ha或ha35可能通过降低神经组织的一氧化氮(no)水平治疗了坐骨神经压迫制造的小鼠足部痛觉超敏，即神经病理性疼痛。
87.如图10所示，本发明的局部神经组织取样测定的一氧化氮(no)结果表明b-ha和神经元一氧化氮合成酶(nnos)抑制剂7-硝基吲唑(7-ni)都明显降低了样品神经组织一氧化氮(no)水平。这个结果提示b-ha通过抑制神经组织一氧化氮(no)水平或使神经组织一氧化氮(no)水平正常化来治疗神经病理性疼痛或缓解了坐骨神经压迫制造的小鼠足部痛觉超敏。
88.如图11所示，本发明结果还表明ha+ph20(cuff+ha+ph20)组和对照组(cuff+ha)相比，有效治疗了神经病理性疼痛或缓解了坐骨神经压迫制造的小鼠足部痛觉超敏。这个结果提通过透明质酸酶ph20切割大分子透明质酸ha制造的渗透性好的低分子透明质酸片段有效治疗了神经病理性疼痛或缓解了坐骨神经压迫制造的小鼠足部痛觉超敏。注1：图11的ph20是提取牛透明质酸酶ph20(上海第一生化制药厂)。注2：本发明未发表的结果表明重组人和提取牛透明质酸酶ph20切割平均分子量1800kda大分子透明质酸原料制造的渗透性好的低分子透明质酸片段分子量相同，均为35kda。
89.讨论和结论：(1)本发明结果表明重组人明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20制造的透明质酸片段b-ha或ha35和一氧化氮(nitric oxide或no)合成酶inos抑制剂有效治疗了使用物理压迫小鼠坐骨神经上端诱发的小鼠神经病理性疼痛，也降低了局部神经组织一氧化氮(nitric oxide或no)水平；(2)本发明结果还表明重组人明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20制造的透明质酸片段b-ha或ha35和一氧化氮(nitric oxide或no)合成酶抑制剂有效治疗了神经组织一氧化氮(nitric oxide或no)相关的小鼠神经病理性疼痛。
90.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

技术特征：
1.一种透明质酸片段或含有其的制剂的应用，所述透明质酸片段为使用重组人透明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量为35
±
8kda的透明质酸片段，其特征在于，所述应用为在制备治疗慢性神经病理性疼痛或慢性炎症性疼痛药物中的应用。2.一种透明质酸片段或含有其的制剂的应用，所述透明质酸片段为使用重组人透明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量为35
±
8kda的透明质酸片段，其特征在于，所述应用为在治疗慢性神经病理性疼痛或慢性炎症性疼痛中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述慢性神经病理性疼痛是与巨噬细胞、小胶质细胞和/或肌肉细胞一氧化氮水平相关的难以治疗的慢性神经病理性疼痛；所述慢性炎症性疼痛是与t淋巴细胞一氧化氮水平相关的慢性炎症性疼痛。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述慢性神经病理性疼痛是与巨噬细胞、小胶质细胞和/或肌肉细胞的细胞移走相关的神经病理性疼痛疾病；所述慢性炎症性疼痛是与t淋巴细胞的细胞移走相关的慢性炎症性疼痛。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述透明质酸片段或含有其的制剂均采用注射液形式，通过腹腔或疼痛部位局部注射；所述平均分子量为35kda。6.一种透明质酸片段或含有其的制剂的质量控制活性检测方法，所述透明质酸片段为使用重组人透明质酸酶ph20或提取牛透明质酸酶ph20切割制造的平均分子量为35
±
8kda的透明质酸片段，其特征在于，所述检测方法包括对其做巨噬细胞和/或小胶质细胞和/或t淋巴细胞培养液的细胞外一氧化氮水平检测，当细胞外一氧化氮水平降低时合格。7.根据权利要求6所述的质量控制活性检测方法，其特征在于，还同时做巨噬细胞和/或小胶质细胞和/或t淋巴细胞的胶滴内细胞移走检测，当促进胶滴内细胞移走时合格。8.根据权利要求6或7所述的质量控制活性检测方法，其特征在于，所述巨噬细胞为巨噬细胞raw264.7；所述小胶质细胞为鼠小胶质细胞bv2；所述t淋巴细胞为人t淋巴细胞h9。9.根据权利要求6所述的质量控制活性检测方法，其特征在于，所述透明质酸片段或含有其的制剂均采用注射液形式，通过腹腔或疼痛部位局部注射；所述平均分子量为35kda。

技术总结
本发明公开了一种透明质酸片段或含有其的制剂的应用，所述透明质酸片段为使用重组人透明质酸酶PH20或提取牛透明质酸酶PH20切割制造的平均分子量为35


技术研发人员：贾潇潇 桐辉 李鑫荣 崔加友 惠觅宙
受保护的技术使用者：东北农业大学 绍兴惠荟科技有限公司
技术研发日：2021.11.15
技术公布日：2022/3/8