检测或评估电离辐射损伤或暴露的试剂及其所用tRNA衍生片段

检测或评估电离辐射损伤或暴露的试剂及其所用trna衍生片段
技术领域
1.本发明涉及生物医学工程产业的医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂领域，具体涉及检测或评估电离辐射损伤或暴露的试剂及其所用trna衍生片段。


背景技术：

2.转运rna(转移核糖核酸，transfer rna，trna)是参与蛋白质翻译过程的重要的工具分子，它们可以特异性地识别信使rna(mrna)分子中的密码子，并运载氨基酸基团掺入到新合成的多肽链中。近年来的研究表明trna还能作为非编码小rna(sncrna)的主要来源之一。trna通过精确的生物剪切过程可以产生许多种类的trna片段分子，这些分子主要分为两大类：即trfs(trna衍生片段，trna-derived fragments)和tirnas(trna半分子，trna halves)，trfs和tirnas广泛存在于各种生物的组织细胞中，具有特定的分子大小、核苷酸组成、生物发生过程以及重要的生物学功能。血清是一种容易收集和检测的样本，是寻找生物标志物的理想载体。研究发现，血液中的sncrna分子大都以被磷脂双分子层结构囊泡包裹的形式存在，在提取和保存的过程中都具有很好的稳定性。在这些血液sncrna分子中，trna片段分子的丰度较高，更容易检测。目前广泛使用的实时荧光定量pcr(rt-qpcr)、数字pcr等技术都可以快速、精确地检测血清样本中trna片段的水平变化。
3.电离辐射广泛存在于自然界、太空以及人工核设施中，人工电离辐射已遍及生产应用的各个领域，如农业诱变育种、粮食药物杀菌保存、医学x射线透视、肿瘤放射治疗等，以及各种加速器、电子显微镜和高压电子管等。电离辐射穿透性强，一方面可以直接作用于细胞的结构和大分子，造成dna和细胞器的结构损伤及功能破坏；另一方面，还可以作用于细胞及间充质中的水分子，产生大量具有强氧化性的自由基间接引起细胞的损伤。电离辐射对人体的生物效应与照射剂量有关，超过安全剂量限值的电离辐射会对机体造成一系列的损伤，包括基因突变、细胞死亡、皮肤坏死、视网膜和晶状体病变、消化系统损伤、造血及免疫系统损伤和器官衰竭等急性放射症状，另外，也会显著增加癌症、遗传病等远期效应风险。随着核能、核武器、辐射医学以及空间探索的快速发展，电离辐射损伤或暴露的检测及评估将成为重大需求，研究和开发对电离辐射损伤或暴露进行检测及评估的产品具有重要的社会意义和广泛的应用价值。
4.环境中电离辐射的检测通常都使用物理剂量计，但是由于照射野的随机性和不同个体间的辐射敏感性差异，单纯使用物理剂量计进行检测已经难以全面准确地反映不同个体的有效吸收剂量及辐射损伤效应。生物标志物是一种可以被检测到的生化指标，能个性化地反映不同个体受到辐射损伤的情况，可以弥补物理剂量计的缺点。可靠的生物标志物对于快速准确评估电离辐射吸收剂量和实施有效的应对措施至关重要。目前，检测电离辐射暴露的主要生物标志物包括淋巴细胞染色体畸变、细胞微核、早熟凝集染色体分析等，但是这些基于细胞测定的标志物存在不足之处，在及时性、便捷性、稳定性和灵敏性上不够理想。
5.基于以上背景，响应电离辐射的血清trna片段分子具有作为一种便捷、可靠、微创的新辐射生物标志物的优势和潜力，可以作为判定个体受到电离辐射损伤或暴露的依据之一,在评估电离辐射暴露造成的效应中发挥重要的作用，对人类的健康具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供一种trna衍生片段生物标志物，和/或，用于检测所述生物标志物的试剂在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
7.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种检测或评估电离辐射损伤或暴露的生物标志物，所述生物标志物选自trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019这三个trna衍生片段(trna-derived fragment，trf)中的一种或者几种，所述trf-gln-ctg-018的核苷酸序列为seq id no.1，所述trf-lys-ctt-008的核苷酸序列为seq id no.2，所述trf-lys-ttt-019的核苷酸序列为seq id no.3。
8.具体地，所述生物标志物可为下述任一种：
9.(1)trf-gln-ctg-018；
10.(2)trf-lys-ctt-008；
11.(3)trf-lys-ttt-019；
12.(4)trf-gln-ctg-018和trf-lys-ctt-008；
13.(5)trf-gln-ctg-018和trf-lys-ttt-019；
14.(6)trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019；
15.(7)trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019。
16.为了实施对受试者电离辐射损伤或暴露更准确的检测或评估，在本发明的一个实施例中，所述生物标志物是trna衍生片段的组合：trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019。
17.进一步地，上述生物标志物中，所述生物标志物trf-gln-ctg-018和/或trf-lys-ctt-008和/或trf-lys-ttt-019在受电离辐射损伤或暴露的受试者的血清中表达水平下调。
18.本发明还提供了trna衍生片段作为生物标志物在检测或评估电离辐射损伤或暴露中的应用或在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用；
19.所述trna衍生片段选自trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019这三个trna衍生片段中的一种或者几种，所述trf-gln-ctg-018的核苷酸序列为seq id no.1(gguuccaugguguaaugguuagcacucu)，所述trf-lys-ctt-008的核苷酸序列为seq id no.2(gcccggcuagcucaguc)，所述trf-lys-ttt-019的核苷酸序列为seq id no.3(agcccggauagcucagucgc)。
20.本发明还提供了用于检测所述生物标志物的试剂在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用。
21.所述产品可为试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台但不限于此。
22.所述试剂可为检测所述生物标志物表达量的试剂。
23.上述应用中，所述试剂包括特异性扩增所述生物标志物或其基因的引物，和/或，特异性识别所述生物标志物或其基因的探针，和/或，特异性结合所述生物标志物或其基因的结合剂。
24.所述结合剂可为肽、肽模拟物、蛋白质或抗体。
25.上述应用中，所述引物选自下述至少一对引物：
26.a1)引物f1和引物r1；所述引物f1为seq id no.4所示的单链dna分子；
27.a2)引物f2和引物r1；所述引物f2为seq id no.5所示的单链dna分子；
28.a3)引物f3和引物r1；所述引物f3为seq id no.6所示的单链dna分子；
29.所述引物r1为seq id no.7所示的单链dna分子。
30.所述引物f1、引物f2、引物f3为正向引物；引物r1为反向通用引物。
31.所述引物f1和引物r1用于特异性扩增所述生物标志物trf-gln-ctg-018的基因；
32.所述引物f2和引物r1用于特异性扩增所述生物标志物trf-lys-ctt-008的基因；
33.所述引物f3和引物r1用于特异性扩增所述生物标志物trf-lys-ttt-019的基因。
34.本发明还提供了检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品，所述产品包括用于检测所述生物标志物的试剂。
35.所述产品用于检测所述生物标志物含量或所述生物标志物基因表达水平。
36.进一步地，所述产品包括用于检测所述生物标志物表达量的试剂。
37.进一步地，所述试剂包括特异性扩增所述生物标志物的引物，和/或，特异性识别所述生物标志物的探针。
38.进一步地，所述产品可为试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台但不限于此。
39.进一步地，所述试剂盒可为qpcr试剂盒、数字pcr试剂盒但不限于此。
40.进一步地，所述试剂盒还包括pcr扩增所需要的taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg
2+
中的一种或多种。
41.进一步地，所述试剂盒还包括可读性载体。所述可读性载体可为关于检测和评估受试者是否受到电离辐射损伤或暴露及暴露程度的说明书(例如印刷形式的说明书)或在其上已记录了信息的计算机可读的介质(例如软盘、cd等)。
42.本发明还提供了一种检测或评估受试者电离辐射损伤或暴露的方法，所述方法包括如下步骤：
43.b1)从受试者血清样本中提取总rna；
44.b2)将所述总rna逆转录为cdna；
45.b3)从所述cdna中特异性扩增所述生物标志物的基因，检测所述生物标志物的表达量变化；
46.b4)所述生物标志物的表达量变化可以作为判断受试者是否受到电离辐射损伤或暴露及暴露程度的依据。
47.所述pcr可为qpcr或数字pcr。
48.上述方法中，b3)中所述检测所述生物标志物的表达量变化可为利用所述特异性扩增所述生物标志物的引物通过实时荧光定量pcr(qpcr)检测所述生物标志物基因相对表达量变化。
49.上述方法中，b3)中所述检测所述生物标志物的表达量变化可为利用所述引物通
过实时荧光定量pcr检测所述生物标志物基因相对表达量变化。
50.所述引物可为引物f1(seq id no.4)、引物f2(seq id no.5)、引物f3(seq id no.6)和/或引物r1(seq id no.7)。
51.在本发明的一个实施例中，所述生物标志物为trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019的组合(trna片段组合)，将受试者与正常健康个体的血清中所述trna片段分子水平进行比较，当trf-gln-ctg-018，trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019三种分子的相对表达都下降且变化量都超过1.5倍时，则确定所述受试者有受到电离辐射损伤或暴露的风险，该血清trna片段组合可作为判定个体受到电离辐射损伤或暴露的依据。
52.本发明还提供了所述生物标志物在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用。
53.所述引物，和/或，所述引物在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用也在本发明的保护范围内。
54.上述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
55.本文中，术语“trna片段分子”、“trna片段”和“trna衍生片段”具有相同的含义，可互换使用。
56.本文中，所述受试者可为人或小鼠。
57.虽然，本发明提供的实施例利用qpcr的方法来检测血清样本中的生物标志物，但本发明不限于该特定方法。本领域技术人员可采用其它任何合适的方法(如数字pcr等)来检测血清样本中的生物标志物，这些替代方法未脱离本发明的范围，本发明应包括这些替代方法。
58.本发明与现有技术相比具有以下优点：
59.1、本发明所述的血清trna片段分子大都以被囊泡包裹的形式存在，且丰度较高。相比于蛋白质、脂质类生物标志物，在提取和保存过程中更加稳定，检测结果更加可靠和准确。
60.2、本发明所述的血清trna片段分子组合可采用常规的rt-qpcr技术或数字pcr技术进行检测，检测精度很高，相比于目前的淋巴细胞染色体畸变检测可以大大提高标志物在辐射损伤或暴露判定中的特异性和敏感性。
61.3、本发明所述的血清trna片段分子组合采用常规的rt-qpcr技术或数字pcr技术进行检测，检测时间为4至6小时，目前的淋巴细胞染色体畸变检测则需要2到3天，本发明更加方便快捷，可以大大缩短电离辐射损伤或暴露风险评估的时间。
62.本发明首次提出了利用血清trna衍生片段作为生物标志物检测或评估受试者是否有受到电离辐射损伤或暴露的风险，所述生物标志物可作为评估受试者是否受到电离辐射损伤或暴露的依据之一。本发明提供一种血清trna片段分子组合，该组合是trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019。通过rt-qpcr技术验证和roc曲线分析，血清trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019的水平与辐射暴露显著相关，在判断是否受到电离辐射时具有较高的特异性和敏感性，可作为支持个体遭受电离辐射损伤
或暴露的依据。本发明还提供了利用所述生物标志物检测或评估受试者电离辐射损伤或暴露的方法，该方法具有灵敏度高、特异性好、无创、检测快捷，稳定性好的特点，具有广泛的临床应用前景。
附图说明
63.图1为实施例1中trna衍生片段分子的筛选。
64.图2为利用rt-qpcr技术验证小鼠血清trf-gln-ctg-018在碳离子射线和x射线照射后的相对表达变化。(*，#表示p《0.05,**，##表示p《0.01，采用students’t test对显著性进行分析)。
65.图3为利用rt-qpcr技术验证小鼠血清trf-lys-ctt-008在碳离子射线和x射线照射后的相对表达变化。(*，#表示p《0.05,**，##表示p《0.01，采用students’t test对显著性进行分析)。
66.图4为利用rt-qpcr技术验证小鼠血清trf-lys-ttt-019在碳离子射线和x射线照射后的相对表达变化。(*，#表示p《0.05,**，##表示p《0.01，采用students’t test对显著性进行分析)。
67.图5为利用roc曲线分析血清trf-gln-ctg-018在区分未照射组和照射组时的特异性和敏感性。
68.图6为利用roc曲线分析血清trf-lys-ctt-008在区分未照射组和照射组时的特异性和敏感性。
69.图7为利用roc曲线分析血清trf-lys-ttt-019在区分未照射组和照射组时的特异性和敏感性。
具体实施方式
70.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
71.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
72.实施例1trna衍生片段的检测及电离辐射损伤或暴露的判断
73.本实施例将30例模式实验动物昆明小鼠(7-8周龄，体重30
±
2g，购自兰州大学医学院)分为5个组，每组6只。利用兰州重离子加速器产生的80mev碳离子束对不同组小鼠进行全身照射，剂量率为0.5gy/min，照射剂量分别为0、0.05、0.1、0.5和1gy，其中0gy组为对照组。照射实验后24小时，收集小鼠血清样本，样本需-80℃保存。将血清样本交由上海康成/数谱生物有限公司进行小rna片段测序，测序的目标片段长度为14-40个核苷酸(nt)，测序采用illumina nextseq 500系统。测序获得的小rna片段序列与genomic trna database数据库进行比对，可以获得其中的trna片段分子信息，包括分子名称和所属的trna片段类型。分别将不同剂量照射组中trna片段表达量与对照组相比，可以获得该trna片段分子在辐照后的相对表达变化倍数。其中，在四个剂量组中(0.05、0.1、0.5和1gy)表达都升高且相
对表达变化倍数超过1.5倍的分子有17种；在四个剂量组中表达都降低且相对表达变化倍数超过1.5倍的分子有9种。为了该分子更加容易检测到，我们从上述的26种分子中挑选了丰度最高(测序得到的片段数目最多)的10种分子开展验证实验。验证实验采用实时定量pcr的方法，由上海康成/数谱生物有限公司完成。验证结果显示，10种选择的trna片段分子中，有9种分子出现表达水平下调的趋势(图1)。之后，利用三个条件对这9种trna片段分子进行筛选，三个条件分别是：(1)该分子在四个照射组中都出现表达下调；(2)照射组与对照组进行方差分析比较其表达水平下调存在显著性差异(p《0.05)；(3)该分子的丰度(测序得到的片段数目)超过上述10种候选分子的平均值。
74.通过以上三个条件，筛选出符合条件的三种trna衍生片段，即trf-gln-ctg-018，trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019。并以trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019为生物标志物，构建检测所述生物标志物表达量及判断电离辐射损伤或暴露的方法。所述生物标志物用于检测或评估电离辐射损伤或暴露，所述trf-gln-ctg-018的核苷酸序列为seq id no.1(gguuccaugguguaaugguuagcacucu)，所述trf-lys-ctt-008的核苷酸序列为seq id no.2(gcccggcuagcucaguc)，所述trf-lys-ttt-019的核苷酸序列为seq id no.3(agcccggauagcucagucgc)。
75.在上述确定的trna衍生片段生物标志物基础上，构建检测所述生物标志物表达量及判断电离辐射损伤或暴露的方法，具体实施步骤如下：
76.待测血清样本包括6例受照射样本和6例正常健康对照，来源为小鼠。
77.1、从待测血清样本中提取总rna
78.由于血清样本中rna的丰度较低，建议采用qiagene公司的mirneasy serum/plasma kit试剂盒纯化。在提取之前，加入外源线虫cel-mir-39作为内参，用于pcr反应后数据的归一化处理。具体操作过程如下：
79.(1)融化血清样本，加入5倍于样本体积的qiazol lysis reagent，涡旋混匀。如200ul血清需加入1ml qiazol lysis reagent。
80.(2)室温下静置5min，加入3.5ul cel-mir-39(1.6
×
108copies/ul)。
81.(3)加入和开始样品等体积氯仿，盖上盖子，用力摇晃15s。
82.(4)在室温下孵化2～3min。4℃，12000r/min离心15min。
83.(5)移取上清到新的ep管中，并避免吸到任何中间相。加入1.5倍体积的100％酒精，吹打混匀。
84.(6)最多吸取700ul样本，加入到rneasy minelute spin column(用于聚集溶液中的核酸，试剂盒有提供)，室温，≥8000r/min离心1min，弃掉流出液。
85.(7)剩余的样本重复上一步。
86.(8)加入700ul bufferrwt到rneasy minelute spin column。室温，≥8000r/min离心30s，弃掉流出液。
87.(9)吸取500ul buffer rpe到rneasy minelute spin column。室温，≥8000r/min离心30s，弃掉流出液。
88.(10)加入500ul 80％酒精到rneasy minelute spin column。室温，≥8000r/min，离心1.5min。
89.(11)把rneasy minelute spin column放入新的收集管中，满速下离心5min，再打
开盖子晾干5min。
90.(12)把rneasy minelute spin column放入新的1.5ml无rna酶ep管中。将20ul rnase-free water直接加入到spin column膜的中心。轻轻关上盖子，满速下离心2min洗提rna。
91.(13)使用nanodrop2000紫外分光光度计检测提纯的rna纯度及浓度，-80℃保存。
92.2、将提取的总rna逆转录为cdna
93.提取的总rna逆转录为cdna使用mirna第一链cdna合成(加尾法)试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)。按照试剂盒说明书，在冰浴的离心管中加入反应体系并混匀，反应体系如表1所示：
94.表1反转录体系加样量表
95.试剂组分加入量2
×
mirna p-rt solution mix10μlmirna p-rt enzyme mix2μl总rna2μg/100ng无rna酶水补至20ul
96.反应体系混匀后，将离心管放入核酸扩增仪，设置反转录程序为37℃下反应60min，然后85℃下灭活5min。反应结束后即获得cdna产物，放置4℃保存或放置-20℃长期保存。
97.3、实时荧光定量pcr检测
98.通过实时荧光定量pcr技术分别对cdna产物中的trf-gln-ctg-018基因，trf-lys-ctt-008基因和trf-lys-ttt-019基因进行扩增：
99.首先，需要分别设计和合成trna片段trf-gln-ctg-018基因，trf-lys-ctt-008基因和trf-lys-ttt-019基因的正向扩增引物。其中：
100.trf-gln-ctg-018基因的正向扩增引物为引物f1：
[0101]5’‑
ggttccatggtgtaatggttagcactct-3’(seq id no.4)，
[0102]
trf-lys-ctt-008基因的正向扩增引物为引物f2：
[0103]5’‑
ctagctcagtcggtagagcatgag-3’(seq id no.5)，
[0104]
trf-lys-ttt-019基因的正向扩增引物为引物f3：
[0105]5’‑
agcccggatagctcagtcg-3’(seq id no.6)。
[0106]
将设计的引物序列提供给上海生工生物工程有限公司进行合成。
[0107]
反向引物采用通用反向引物r1(universal adaptor pcr primer)(seq id no.7)
[0108]
利用实时荧光定量pcr技术分别对trf-gln-ctg-018基因，trf-lys-ctt-008基因和trf-lys-ttt-019基因的相对表达变化进行检测。检测采用all-in-onetm mirna qrt-pcr detection kit试剂盒(购自广州复能生物科技有限公司)，具体操作过程如下：
[0109]
按照试剂盒说明书，在冰浴的离心管中加入反应体系并混匀，反应体系如表2所示：
[0110]
表2实时荧光定量pcr反应体系加样量表
[0111]
试剂组分加入量2
×
all-in-onetm qpcr mix10μl
合成的trna片段正向扩增引物2μluniversal adaptor pcr primer2μl反转录获得的cdna2μl无rna酶水补至20ul
[0112]
将上述体系吹打混匀后加入pcr板中，放入实时荧光定量pcr仪，设置反应程序如表3所示：
[0113]
表3实时荧光定量pcr反应程序
[0114][0115]
读取获得所述血清trna片段分子和内参分子的ct值，利用2
‑△△
ct
法进行分析，公式如下：
[0116]
相对变化倍数(fold change)＝2-△△
ct
，
△△
ct＝
△
ct(照射组)
‑△
ct(未照射组)
[0117]
其中，
△
ct＝ct(trna片段)-ct(内参)，ct(trna片段为本发明所述trna片段分子的ct值，ct(内参)为步骤1加入的外源线虫cel-mir-39(内参)的ct值。
[0118]
由此方法分别获得待测血清样本中3种所述trna片段分子相比于正常健康个体血清样本中3种所述trna片段分子的表达量相对变化倍数。
[0119]
4、电离辐射损伤或暴露的判断
[0120]
将待测对象与正常健康个体的血清中所述trna片段分子水平进行比较，当trf-gln-ctg-018，trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019三种分子的相对表达都下降且变化量都超过1.5倍时，则判定待测对象有受到电离辐射损伤或暴露的风险，或本发明所述血清trna片段组合可作为判定个体受到电离辐射损伤或暴露的依据。
[0121]
实施例2trna衍生片段作为电离辐射标志物的验证
[0122]
1、待测样品的制备：
[0123]
利用x-rad 225型x射线仪产生的x射线作为低let(传能线密度)电离辐射的代表，以兰州重离子加速器冷却储存环(hirfl-csr)生物辐照终端产生的碳离子束作为高let电离辐射的代表，对模式实验动物昆明小鼠(7-8周龄，体重30
±
2g，购自兰州大学医学院公司)进行全身照射。照射剂量为0gy、0.1gy、0.5gy和1gy，每个剂量组4-6只小鼠。
[0124]
在辐射后24小时，抽取不同照射剂量小鼠的全血至无rna酶的ep管中，整个过程避免剧烈晃动，并且不要让杂质落入管中，以防溶血。将全血在室温下放置1h，4000转/min离心10分钟，吸取上层澄清的血清，放入新的无rna酶管中，再4000转/min离心10分钟，吸取上清，即可分离得到检测所需的血清样本，储存于-80℃保存。
[0125]
2、所述trna片段组合分子的检测
[0126]
按照实施例1中的步骤进行血清样本中三种trna片段分子trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019的相对表达检测。
[0127]
3、检测结果分析
[0128]
通过对受到电离辐射小鼠的血清trf-gln-ctg-018，trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019进行rt-qpcr相对定量检测可以发现，血清中三种分子在小鼠受到0.1gy、0.5gy和1gy的碳离子或x射线照射后，相对表达变化都显著降低且变化倍数超过了1.5倍(图2—图4)，说明这三种血清trna片段分子对低let和高let电离辐射都具有较强敏感性，可作为电离辐射标志物。
[0129]
为了进一步保证本发明所述trna片段分子在应用于电离辐射检测中的准确性，需结合三种trna片段分子进行判断，即当trf-gln-ctg-018，trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019三种分子的相对表达都下降且变化量都超过1.5倍时，则判定待测对象有受到电离辐射损伤或暴露的风险，该血清trna片段组合可作为判定个体受到电离辐射损伤或暴露的依据。
[0130]
4、trna衍生片段生物标志物应用于电离辐射检测或评估的效果
[0131]
利用roc曲线(受试者工作特征曲线)分析本发明所述血清trna片段分子应用于电离辐射损伤或暴露判定的特异性和敏感性，其中，auc(曲线下面积)值表示该标志物的评估效果，auc值在0到1之间，auc值越大说明该标志物在判定电离辐射暴露时的特异性和敏感性越好。roc曲线分析显示，血清trf-gln-ctg-018在区分未照射对象和受照射对象时，对于碳离子辐射，其auc值达到0.889，对于x射线辐射，其auc值达到0.825(图5)；血清trf-lys-ctt-008在区分未照射对象和受照射对象时，对于碳离子辐射，其auc值达到1，对于x射线辐射，其auc值达到0.917(图6)；血清trf-lys-ttt-019在区分未照射对象和受照射对象时，对于碳离子辐射，其auc值达到0.964，对于x射线辐射，其auc值达到0.982(图7)。通常，roc曲线分析中auc值达到0.80以上说明该标志物具有较好的评估效果。本发明所述血清trf-gln-ctg-018，trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019在进行不同let的电离辐射暴露判定时，其auc值都明显大于0.80，说明这三种血清trna片段分子作为电离辐射标志物具有较好的评估效果。
[0132]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种检测或评估电离辐射损伤或暴露的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物选自trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019这三个trna衍生片段中的一种或者几种，所述trf-gln-ctg-018的核苷酸序列为seq id no.1，所述trf-lys-ctt-008的核苷酸序列为seq id no.2，所述trf-lys-ttt-019的核苷酸序列为seq id no.3。2.trna衍生片段作为生物标志物在检测或评估电离辐射损伤或暴露中的应用或在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用；所述trna衍生片段选自trf-gln-ctg-018、trf-lys-ctt-008和trf-lys-ttt-019这三个trna衍生片段中的一种或者几种，所述trf-gln-ctg-018的核苷酸序列为seq id no.1，所述trf-lys-ctt-008的核苷酸序列为seq id no.2，所述trf-lys-ttt-019的核苷酸序列为seq id no.3。3.用于检测权利要求1或2中所述生物标志物的试剂在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增所述生物标志物或其基因的引物，和/或，特异性识别所述生物标志物或其基因的探针，和/或，特异性结合所述生物标志物或其基因的结合剂。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述引物选自下述至少一对引物：a1)引物f1和引物r1；所述引物f1为seq id no.4所示的单链dna分子；a2)引物f2和引物r1；所述引物f2为seq id no.5所示的单链dna分子；a3)引物f3和引物r1；所述引物f3为seq id no.6所示的单链dna分子；所述引物r1为seq id no.7所示的单链dna分子。6.检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品，其特征在于，所述产品包括用于检测权利要求1或2中所述生物标志物的试剂。7.一种检测或评估受试者电离辐射损伤或暴露的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：b1)从受试者血清样本中提取总rna；b2)将所述总rna逆转录为cdna；b3)从所述cdna中特异性扩增权利要求1中所述生物标志物的基因，检测所述生物标志物的表达量变化；b4)所述生物标志物的表达量变化可以作为判断受试者是否受到电离辐射损伤或暴露及暴露程度的依据。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，b3)中所述检测所述生物标志物的表达量变化为利用权利要求5中所述引物通过实时荧光定量pcr检测所述生物标志物基因相对表达量变化。9.权利要求1中所述的生物标志物在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用。10.权利要求5中所述的引物，和/或，权利要求5中所述的引物在制备检测或评估电离辐射损伤或暴露的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了检测或评估电离辐射损伤或暴露的试剂及其所用tRNA衍生片段。具体地公开了一种检测或评估电离辐射损伤或暴露的生物标志物tRF-Gln-CTG-018、tRF-Lys-CTT-008和tRF-Lys-TTT-019。通过RT-qPCR技术验证和ROC曲线分析，所述生物标志物基因表达水平与辐射暴露显著相关，在判断是否受到电离辐射时具有较高的特异性和敏感性，可作为支持个体遭受电离辐射损伤或暴露的依据。利用所述生物标志物评估受试者受电离辐射损伤或暴露风险的方法具有灵敏度高、特异性好、无创、检测快捷，稳定性好的特点，具有广泛的临床应用前景。具有广泛的临床应用前景。


技术研发人员：危文俊 王菊芳 白皓 张亚楠 陈亚雄
受保护的技术使用者：中国科学院近代物理研究所
技术研发日：2021.12.03
技术公布日：2022/3/8