苍术茎叶HPLC指纹图谱质量评价方法

苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法
技术领域
1.本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法。


背景技术：

2.中药不仅对人且对动物都具有强身健体、防病治病的功效，因此其市场需求量迅速增长。此外，随着中药成分复杂性带来巨大变化的同时，促进了中药质量控制和谱效评价技术和方法的发展。指纹图谱分析是一种公认的、有效的中药质量控制方法。中药指纹图谱分析在中药材标准化生产过程中得到广泛应用。《中国药典》制定的中药质量标准不仅符合中药的特点，而且采用中药指纹图谱的方法控制中药质量已得到国际公认。同时，高效液相色谱法以其高效、高灵敏度、高速、高压等优点，在中草药活性成分的定性定量测定中发挥着至关重要的作用。
3.苍术系菊科植物茅苍术茎叶atractylodeslancea(thunb.)dc.或北苍术茎叶a.chinensis(dc.)koidz.的根茎部分。现代药理学研究表明，苍术作为一种药用材料，具有独特的化学成分和显著的药理活性，具有抗溃疡、抗心律失常、消炎、抗菌、保肝、降血压等作用，被广泛应用。苍术茎叶作为苍术的非药用部位被作为垃圾丢弃，造成资源的严重浪费。研究表明，苍术茎叶具有抗炎、抑菌和抗氧化作用。要推动苍术茎叶的应用，标准制定亟须先行一步。因此，制定苍术茎叶的标准尤为重要。
4.hplc色谱图中色谱峰受许多因素的影响，如检测波长、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温等都会影响苍术茎叶茎叶hplc指纹图谱，尤其是混合流动相各组分比例影响更大，具有不确定性，色谱条件的任何改变，都意味着整体色谱图形变异，给hplc指纹图谱的建立工作造成困难。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法。
6.根据本发明的苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法，包括以下步骤：
7.制备待测苍术茎叶样品的茎叶提取物溶液和苍术茎叶标准品的茎叶提取物溶液；
8.将上述得到的提取物溶液分别进行hplc色谱分析，其中，hplc色谱分析的条件为：
9.流动相为甲醇-0.1vol％三氟乙酸系统，流速为1ml/min、柱温30℃、检测波长260nm、分析时间为40min
10.在检测波长260nm、柱温30℃、流速0.8ml/min，以甲醇-0.1vol％三氟乙酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，进样体积为10μl，梯度洗脱程序为：洗脱梯度0～15min，5％甲醇～35％的0.1％三氟乙酸-水，15～25min，35％甲醇～45％的0.1％三氟乙酸-水，25～30min，45％甲醇～60％的0.1％三氟乙酸-水；30～40min，60％甲醇～95％的0.1％三氟乙酸-水；
11.对比待测苍术茎叶样品的茎叶提取物溶液和苍术茎叶标准品的茎叶提取物溶液的hplc色谱图，待测苍术茎叶样品的茎叶提取物溶液的hplc色谱峰图与苍术茎叶标准品的茎叶提取物溶液的hplc色谱峰图的相似度≥0.998，则判断待测苍术茎叶样品为合格产品。
12.根据本发明的苍术茎叶提取物的hplc指纹图谱质量评价方法，其中，通过以下步骤制备苍术茎叶的提取物溶液：
13.将苍术茎叶研磨成粉，过40目筛网；
14.向过筛的粉末中加入乙醇-水溶液；
15.然后超声提取，离心收集上清液，然后蒸发浓缩，冷冻干燥成粉末；
16.以水溶解粉末。
17.根据本发明的苍术茎叶提取物的hplc指纹图谱质量评价方法，其中，过筛的粉末中与乙醇-水溶液的料液比为1:40。
18.根据本发明的苍术茎叶提取物的hplc指纹图谱质量评价方法，其中，在500w下超声提取30min。
19.根据本发明的苍术茎叶提取物的hplc指纹图谱质量评价方法，其中，上清液在45℃旋转蒸发浓缩，经真空冷冻干燥成粉末，4℃保存备用。
20.本技术采用高效液相色谱法建立苍术茎叶的质量控制方法，通过考察波长、流动相、改性剂、柱温、流速和分析时间等对苍术茎叶化学成分数量和分离度的影响，确定苍术茎叶的高效液相色谱分析方法，进一步对建立的液相分析方法进行精密度、稳定性和重复性验证，采用相似度分析和化学计量学方法来评价hplc指纹图谱与抑菌活性之间的谱效关系，最终确定苍术茎叶批间质控点，为苍术茎叶的应用奠定质量基础。
附图说明
21.图1显示260nm波长下苍术茎叶提取物分离效果；
22.图2显示340nm波长下苍术茎叶提取物分离效果；
23.图3显示苍术茎叶提取物全波长扫描结果；
24.图4显示甲醇-水体系对苍术茎叶提取物的分离效果；
25.图5显示乙腈-水体系对苍术茎叶提取物的分离效果；
26.图6显示甲醇-水-甲酸改性剂对苍术茎叶提取物分离效果；
27.图7显示甲醇-水-乙酸改性剂对苍术茎叶提取物分离效果；
28.图8显示甲醇-水-磷酸改性剂对苍术茎叶提取物分离效果；
29.图9显示甲醇-水-三氟乙酸改性剂对苍术茎叶提取物分离效果；
30.图10洗脱程序1对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
31.图11显示洗脱程序2对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
32.图12显示洗脱程序3对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
33.图13显示洗脱程序4对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
34.图14显示柱温25℃对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
35.图15显示柱温30℃对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
36.图16显示柱温35℃对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
37.图17显示流速0.8ml/min对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
38.图18显示流速1.0ml/min对苍术茎叶叶提取物分离效果的影响；
39.图19显示流速1.2ml/min对苍术茎叶提取物分离效果的影响；
40.图20显示苍术茎叶提取物特征指纹图谱；
41.图21为hplc指纹图谱中10批次苍术茎叶提取物样品叠加图；
42.图22为10批苍术茎叶提取物聚类图；
43.图23显示主成分分析；
44.图24显示苍术茎叶提取物抑菌活性回归系数(pls)；
45.图25显示苍术茎叶提取物抑菌活性vip值(pls)。
具体实施方式
46.实施例1
47.1.试剂
48.使用milliporemilli－q净水系统(billerica,ma,usa)获得高纯水。分析级乙醇购自北京化工厂(中国北京)。分析级磷酸、甲酸和三氟乙酸均购自中国天津艾杰尔技术有限公司。色谱级甲醇和乙腈采购自赛默飞世尔科技(沃尔瑟姆，ma，美国)。
49.2.苍术茎叶茎叶
50.于2020年9月在内蒙古采集苍术茎叶标本。
51.3.样品准备
52.将苍术茎叶研磨成粉，过40目筛网。准确称量粉碎过筛后的样品20g，加入800ml50％(v/v)乙醇-水溶液(料液比为1:40)，在500w下超声提取30min。5000rpm离心10min后，收集上清液在45℃旋转蒸发浓缩，经真空冷冻干燥成粉末，4℃保存备用。
53.4.样品溶液制备
54.取苍术茎叶提取物细粉，精密称量100mg，置于15ml离心管中，精密加入10ml超纯水，涡旋溶解，经0.22μm过滤器过滤后，取滤液用于后续色谱分析。
55.5.仪器条件
56.所有色谱分析采用岛津高效液相色谱系统，由lc-20ad泵、自动进样器(sil-20a)、系统控制器(cbm-20a)、柱温室(ct0-20a)和紫外可见二极管阵列检测器(spd-m20a230v)组成。安捷伦zorbaxsb-c18色谱柱用于研究(4.6
×
250mm,5μm；安捷伦科技公司，圣克拉拉，加州，美国)。mtt采用酶标仪进行测定(multiskan
tm skyhigh,thermofisherscientific,ma,usa)。
57.实施例2高效液相色谱条件的优化
58.基础优化苍术茎叶提取物的分离条件。整个实验的进样量均设置为10μl。
59.2.1检测波长的选择
60.提取物成分的复杂性，经过比较不同波长下苍术茎叶提取物分离效果(图1、图2)以及在200～600nm波长进行全波长扫描(图3)后，结果表明，波长为260nm附近有最大吸收峰，且吸收峰峰信号强，获得的峰的数量多，故选择260nm为最佳检测波长。
61.2.2流动相体系的选择
62.确定最佳检测波长后，比较了乙腈-水、甲醇-水流动相体系对苍术茎叶提取物分离效果的影响，结果如图4、5，在260nm波长下，乙腈-水和甲醇-水体系对苍术茎叶茎叶提取物的分离效果和分析时间相差不大，但甲醇-水体系比乙腈-水体系获得的峰数量多一个，故选择甲醇-水作为苍术茎叶提取物分析流动相。
63.2.3改性剂的选择
64.在确定波长和流动相的条件下，考察改性剂对苍术茎叶提取物分离效果的影响，结果如图6-9所示，当改性剂为甲酸、乙酸和磷酸时，与改性剂为三氟乙酸的流动相体系相比较，出峰数量少且保留时间长。改性剂为三氟乙酸流动相体系则是分离效果最好，出峰数量多达91个，且吸收峰信号明显，峰信号保留时间较短。故选择甲醇—水—0.1vol％三氟乙酸流动相体系作为苍术茎叶提取物色谱分析的流动相体系。
65.2.4洗脱程序的选择
66.在确定波长、流动相和改性剂的条件下，考察洗脱程序(表)对苍术茎叶提取物分离效果的影响，结果如图10-13和表1-4所示，洗脱程序1获得的色谱峰数量最多，但分析时间也最长；尽管洗脱程序3获得的色谱峰数量最少，但所用的分析时间最短，仅比洗脱程序1少了5个含量很低的色谱峰，不影响对苍术茎叶提取物化学成分的整体评价，故选择洗脱程序3为最终苍术茎叶提取物的洗脱程序。
67.表1洗脱程序1
[0068][0069]
表2洗脱程序2
[0070][0071]
表3洗脱程序3
[0072][0073]
表4洗脱程序4
[0074][0075]
2.5柱温的选择
[0076]
进一步优化hplc条件，选择不同的柱温进行分离。结果表明，相较于25℃和35℃(图14、16)，当柱温设置为30℃(图15)，可获更多的色谱峰数量和更强的峰信号，分离效果更好。
[0077]
2.6流速的选择
[0078]
流速是影响苍术茎叶提取物指纹图谱建立的重要因素之一。考察流速对苍术茎叶提取物分离效果的影响，结果如图17-19，流速为0.8ml/min分离得到的峰数量最多，保留时间最短，故确定流速为0.8ml/min。
[0079]
综上所述，苍术茎叶提取物最优hplc条件建立：采用agilentzorbaxsb-c18(4.6
×
250mm,5μm)色谱柱，在检测波长260nm、柱温30℃、流速0.8ml/min下，以甲醇(a)-0.1vol％三氟乙酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，进样体积为10μl。梯度洗脱程序为：洗脱梯度0～15min，5％～35％(a)；15～25min，35％～45％(a)；25～30min，45％～60％(a)；30～40min，60％～95％(a)。
[0080]
实施例3苍术茎叶提取物的高效液相色谱检测方法的稳定性、重复性和准确性
[0081]
根据本技术的技术方案，优化了苍术茎叶提取物的高效液相色谱分析条件，所获得的色谱图作为苍术茎叶提取物的标准特征指纹图谱(图20)。具有高分辨率和合理的峰高，被认为是样品鉴定的共同峰。基于色谱强度、峰形和稳定性的指纹图谱参数评价在检测的40min内出现在所有样品中的19个峰。
[0082]
以含量稳定的10号峰作为参照峰(s)，选择其余18个峰作为苍术茎叶提取物吸收强度较高的特征峰，评价其在保留时间领域的相关差异。rrt和rpa的公式分别为rrt＝rtpeak/rtpeak10和rpa＝papeak/papeak10。
[0083]
配制苍术茎叶提取物溶液，按照最优色谱条件连续测定6次，记录峰面积和出峰时间，计算得到各共有峰相对保留时间的rsd《0.57％，相对峰面积的rsd《2.57％,表明仪器精密度良好。
[0084]
在最佳色谱条件下，提取物溶液分别在0、1、2、4、6、8、10、12h进样检测。溶液保持在室温下。19个共有峰的rsd《0.87％和相对峰面积的rsd《3.90％。结果表明，提取物溶液在12小时内稳定。
[0085]
一次性制备6批苍术茎叶提取物，并在最佳色谱条件对其进行评价。19个共有峰的rsd《0.34％和相对峰面积的rsd《4.33％。结果表明，该方法重复性好，效果显著。
[0086]
本技术的方法具有稳定性、重复性和准确性，上述结果的相似性证明了该方法的有效性。利用该方法可获得相对稳定的苍术茎叶提取物，可作为后续功能实验的依据。
[0087]
3.1苍术茎叶提取物的相似度分析
[0088]
相似度已被广泛认可为中药指纹图谱评价指标。本技术采用指纹图谱中19个共有峰的数据进行质量控制，采用相似度评价法进行质量控制。为确定每批药材的一致性，对10批苍术茎叶提取物进行hplc指纹图谱分析。制备10批次苍术茎叶提取物并制备成溶液，按照最优色谱条件进样测定，记录色谱图，将260nm处的色谱数据导入中国药典委员会提供的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)”，进行多点校正和色谱峰匹配，经全峰匹配后得到叠加图谱及对照图谱(图21)，计算得到每个样品的指纹图谱之间的相似度值(表5)，很容易发现10批样品的相似度较高，均≥0.998(表5)。
[0089]
3.2抑菌效果
[0090]
mtt测定用于评估苍术茎叶提取物对大肠杆菌的抑制作用。检测10批次苍术茎叶茎叶提取物(10mg/ml)在大肠杆菌中的抑制作用。如表5所示，10批苍术茎叶提取物对大肠杆菌的抑制率相对稳定，无统计学差异。结果表明，10批次苍术茎叶提取物对大肠杆菌具有
稳定的抑制作用，表明良好的质量控制可以保证苍术茎叶批间生物活性的稳定性。
[0091]
表510批次苍术茎叶提取物指纹图谱相似度及抑菌率
[0092][0093]
3.3化学计量学分析
[0094]
3.3.1层次聚类分析
[0095]
以10批苍术茎叶提取物中19个共有峰的峰面积为变量，得到10
×
19阶原始数据矩阵，运用spss23.0软件，采用组间连接法，以欧式平方距离为度量标准，进行聚类分析，结果见图22。当分类距离为15时，10批苍术茎叶提取物可以聚为3类，，s2、s3、s5～s7、s9聚为a类，s1、s4、s10聚为b类，s8单独为c类样品。该聚类结果表明此样品采集可能非同一时间。
[0096]
3.3.2主成分分析
[0097]
pca将多个变量转化为少数几个综合变量(即主成分)，是一种有效的降维统计方法，该方法消除了评价指标间的相关影响，有助于更客观地描述样品的相对地位，这对于苍术茎叶提取物质量的综合评价具有重要意义。采用spss23.0统计软件，将10批样品19个峰的相对峰面积组成矩阵，数据经软件进行因子分析后，提取到6个主成分，计算pca特征值及贡献率见。由表6可见，前6个主成分的特征值均＞1，表明前6个主成分在苍术茎叶提取物质量评价中起主导作用，是样品产生分类差异的标志性成分。6个主成分的累积贡献率达93.546％(》90％)，能客观反映出苍术茎叶提取物的综合质量，选取前6个主成分进行分析。另外，将共有峰面积导入simca10.0软件绘制主成分分析得分图23，10批次苍术茎叶提取物被分为3类，与聚类分析结果基本一致。
[0098]
表13：苍术茎叶提取物主成分特征值及贡献率
[0099]
主成分特征值贡献率％累积贡献率17.88841.51341.51323.20716.88158.39432.12911.20669.60141.90710.03579.63551.4707.73587.3761.1736.17593.546
[0100]
3.3.3谱效关系
[0101]
将色谱指纹图谱与药效评价相结合，可以发现和识别中药药效的相关标志成分。谱效关系的研究，将中医的“视觉”性质转化为“谱”与“效”的一致性。用bca模型建立19个常见峰面积数据与大肠杆菌抑制率的谱效关系，相关系数如图24所示，p1、p3、p5、p11、p13、p14、p15、p16和p19对抑制大肠杆菌有积极作用。在plsr模型中，19个共同峰的峰面积被定义为自变量，因变量为抑菌率。从simca软件(版本14.1)获得vip值。如图25所示，以vip》1为筛选标准，p1、p5、p3、p6和p4是影响抑制大肠杆菌的主要标记成分。
[0102]
中药不同化学成分联合作用的结果是大多数中药的疗效。本技术建立了苍术茎叶提取物的hplc指纹图谱，充分反映了苍术茎叶提取物化学成分的种类和数量。10批提取物的色谱指纹图谱相似度高达0.998，峰间分布稳定一致，说明同一产地的苍术茎叶提取物在化学成分上具有足够的相似性，可以证明其质量稳定。同时，结合化学计量学方法对苍术茎叶提取物质量控制和抑菌效果之间的谱效关系进行评价。综上，本技术建立的苍术茎叶茎叶提取物的hplc指纹图谱质量评价方法，对进一步完善苍术茎叶提取物质量标准有一定的参考意义。

技术特征：
1.一种苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(1)制备待测苍术茎叶样品的茎叶提取物溶液和苍术茎叶标准品的茎叶提取物溶液；(2)将上述得到的提取物溶液分别进行hplc色谱分析，其中，hplc色谱分析的条件为：流动相为甲醇-0.1vol％三氟乙酸系统，流速为1ml/min、柱温30℃、检测波长260nm、分析时间为40min在检测波长260nm、柱温30℃、流速0.8ml/min，以甲醇-0.1vol％三氟乙酸溶液为流动相，进行梯度洗脱，进样体积为10μl，梯度洗脱程序为：洗脱梯度0～15min，5％甲醇～35％的0.1％三氟乙酸-水，15～25min，35％甲醇～45％的0.1％三氟乙酸-水，25～30min，45％甲醇～60％的0.1％三氟乙酸-水；30～40min，60％甲醇～95％的0.1％三氟乙酸-水；(3)对比待测苍术茎叶样品的茎叶提取物溶液和苍术茎叶标准品的茎叶提取物溶液的hplc色谱图，待测苍术茎叶样品的茎叶提取物溶液的hplc色谱峰图与苍术茎叶标准品的茎叶提取物溶液的hplc色谱峰图相同的相似度≥0.998，，则判断待测苍术茎叶样品为合格产品。2.根据权利要求1所述的苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法，其特征在于，通过以下步骤制备苍术茎叶的提取物溶液：将苍术茎叶研磨成粉，过40目筛网；向过筛的粉末中加入乙醇-水溶液；然后超声提取，离心收集上清液，然后蒸发浓缩，冷冻干燥成粉末；以水溶解粉末。3.根据权利要求2所述的苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法，其特征在于，过筛的粉末中与乙醇-水溶液的料液比为1:40。4.根据权利要求2所述的苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法，其特征在于，在500w下超声提取30min。5.根据权利要求2所述的苍术茎叶hplc指纹图谱质量评价方法，其特征在于，上清液在45℃旋转蒸发浓缩。

技术总结
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及苍术茎叶提取物的HPLC指纹图谱质量评价方法。本申请采用高效液相色谱法建立苍术茎叶的质量控制方法，通过考察波长、流动相、改性剂、柱温、流速和分析时间等对苍术茎叶化学成分数量和分离度的影响，确定苍术茎叶的高效液相色谱分析方法，进一步对建立的液相分析方法进行精密度、稳定性和重复性验证，采用相似度分析和化学计量学方法来评价HPLC指纹图谱与抑菌活性之间的谱效关系，最终确定苍术茎叶批间质控点，为苍术茎叶的应用奠定质量基础。为苍术茎叶的应用奠定质量基础。为苍术茎叶的应用奠定质量基础。


技术研发人员：李秀梅 戴小枫 杨娟 石冬冬 田薇
受保护的技术使用者：中国农业科学院饲料研究所
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2022/3/8