一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基及其使用方法与流程

1.本发明属于生物化工技术领域，涉及一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基及其使用方法。


背景技术：

2.丝状真菌具有分泌大量酶或次级代谢产物的特殊能力，广泛用于多种工业应用。这种丝状真菌的最大特点就是在固体培养基上可以生长出大量的丝状气生菌体，且生长迅速，甚至相互交织，从而在固体培养皿中甚至形成互相连接的几个或一个大菌落。这种丝状真菌的菌丝形态可以在液体深层发酵条件下人工调节。有论文报道称使用鼠李糖脂和triton x-100将液体深层发酵通常丝状的里氏木霉rutc-30改性成菌丝团，以提高纤维素的产量。此外，有人通过rnai介导的基因沉默破坏了里氏木霉中的trcot1蛋白功能，从而该木霉导致马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)上产孢延迟，而该木霉的一个双重突变体突变体sus2/trcot1i的菌丝生长变慢且菌丝体变短变粗。另外，也有研究者公开了一种自适应诱变筛选高产纤维素酶丝状真菌的方法及获得的突变菌株，具体涉及非洲哈茨木霉的突变。其具体步骤包括：制备野生型非洲哈茨木霉孢子悬浮液；对野生型非洲哈茨木霉进行3轮诱变；诱变菌株的筛选；优良突变株酶活稳定性的测定。还有一种表面活性剂应用在丝状真菌曲霉属或根霉属的液体发酵中。该方法主要步骤为：在丝状真菌液体深层培养过程中，向种子培养基中添加醇胺类物质，这些醇胺类物质包括乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺中的任意一种或者多种，其添加量优选为醇胺类物质的体积占培养基体积的0.1-2.0％，然后按体积比10-20％转接入发酵培养基中进行发酵培养。
3.表面活性剂triton x-114，中文名字曲拉通x-114，为一种具有亲水性聚氧乙烯头部区域的非离子洗涤剂。曲拉通x-114常用于水相蛋白和脂蛋白的分离，如膜蛋白的提取等。有报道称曲拉通x-114可用于在温度诱导的相分离中帮助溶解疏水性膜蛋白和膜相关蛋白。其步骤包括：由来自b.burgdorferi菌的ospa基因编码的ospa膜蛋白被重组表达后，裂解该重组细胞，加入洗涤剂triton x-114并混匀，当加热所获得的裂解混合物适当高温时，洗涤剂相与其他相分离，然后再通过柱层析纯化含有该蛋白质的洗涤相。其次，triton x-114还用于去除内毒素的研究。有报道称用大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b、重组人生长激素、重组葡激酶蛋白粗提液为原料，反复抽提相分离法，用于去除蛋白粗提液中95％的细菌内毒素,蛋白收率保持85％以上，蛋白性质不受影响。也有人公开了一种triton x-114和尿囊素去除重组蛋白质溶液中内毒素的方法，包括以下步骤：将重组蛋白质溶液中加入1ml triton x-114，充分混溶得到混合物a，混合物a冰浴后于37℃条件下水浴放置一段时间并搅拌，25℃条件下，将搅拌均匀的混合物a离心并移出上层水相；将用于去除内毒素的尿囊素直接加到上层水相中，得到混合物b，将混合物b在室温下震荡20min；25℃条件下，将震荡后的混合物b离心去除底层沉淀，保留上清溶液，上清液即为去除内毒素的vp2重组蛋白质溶液。再者，triton x-114还被应用在细胞裂解液组分中。例如有人公开一种人外周血淋巴细胞微核的检测方法，所用的裂解液中的溶质由氯化钠、柠檬酸钠、triton x-114、
rnase酶和绿色荧光染料组成，用于裂解用红色荧光染料染色的人外周血淋巴细胞。
4.在生产实际中，丝状微生物需要先在固体培养基上生长，再计数筛选，然后收集菌丝或孢子用于下一步培养和生产功能鉴定。但由于丝状微生物生长出大量的丝状气生菌体，且生长迅速，甚至相互交织，从而在固体培养皿中甚至形成互相连接的几个或一个大菌落，降低了菌落的独立性，也降低了菌株的一次筛选鉴定数量，从而降低了筛选效率。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基及其使用方法，将曲拉通x-114与其他组分共同作用，使丝状菌在固体培养基上长成独立菌落。
6.本发明提供了下列技术方案：一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基，包括曲拉通x-114和琼脂。
7.作为优选，所述曲拉通x-114在固体培养基中的浓度为0.2-10g/l。
8.表面活性剂triton x-114是一种具有亲水性聚氧乙烯头部区域的非离子洗涤剂，可渗入菌丝细胞双层中膜蛋白周围的正常脂质环境，导致细胞膜完整性轻微受损，一定程度上抑制菌丝呼吸活性，从而使菌丝体形成独立盘状小菌落。并且对孢子萌发抑制率较低，因此可以增加多种丝状菌在培养皿中的菌落数，在直径10cm的培养皿上可以产生50-120个丝状菌的独立菌落。
9.本发明还提供了一种使用固体培养基促进丝状菌长成独立菌落的方法，特征在于，所述的方法包括如下步骤：
10.将曲拉通x-114与水混合后高温蒸汽灭菌，待冷却后与乙醇在无菌环境中混匀，得混合试剂；
11.将含琼脂的初始培养基液加热灭菌后取出，在凝固前加入混合试剂并快速混匀，形成熔化状态的固体培养基；
12.在熔化状态的固体培养基凝固前加入丝状微生物的菌丝体和/或孢子，混匀后倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后保温培养。
13.作为优选，所述曲拉通x-114与水的质量比为1：(4-50)。
14.作为优选，所述高温蒸汽灭菌的温度为115-121℃，时间为20-40min。
15.作为优选，所述混合试剂中乙醇的浓度为50-500g/l。
16.进一步优选，所述乙醇在熔化状态的固体培养基中的浓度为0.5-25g/l。
17.更进一步优选，所述无水乙醇的纯度在98.5％以上。
18.作为优选，所述琼脂的浓度为15-30g/l。
19.作为优选，所述混合试剂与初始培养基液的体积比为1：(10-100)。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
21.1、本发明的试剂适用的丝状菌范围广，对孢子萌发抑制率较低，有利于独立菌落的形成，便于菌落的筛选计数。
22.2、本发明的试剂制备简单、易操作，实验稳定性高，保存时间久。
23.3、本发明的试剂的使用方法简单，只需要将混合试剂充分混匀到凝固前的固体培养基中即可。
24.4、通过本发明的方法制得的含丝状微生物的菌丝体和/或孢子的固体培养基中经过保温培养后可在直径10cm的培养皿上产生50-120个丝状菌的独立菌落。
25.说明书附图
26.图1为本发明实施例1培养皿培养结果图。
27.图2为本发明实施例2培养皿培养结果图。
28.图3为本发明实施例3培养皿培养结果图。
29.图4为本发明对比例1培养皿培养结果图。
30.图5为本发明对比例2培养皿培养结果图。
31.图6为本发明对比例3培养皿培养结果图。
32.图7为本发明对比例4培养皿培养结果图。
具体实施方式
33.以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
34.实施例1
35.将20g曲拉通x-114与80ml水混合后在121℃中高温蒸汽灭菌20min，待冷却后与50g乙醇在无菌环境中混匀得混合试剂。将1.5g琼脂与3g商品葡萄糖马铃薯培养基粉末配制成100ml初始培养基液，加热灭菌后取出，在凝固前加入制得的混合试剂1ml并快速混匀，形成熔化状态的固体培养基；待温度降到40℃左右时在熔化状态的固体培养基中加入100μl的绿色木霉cicc41187的孢子悬液，混匀，以大约10ml体积倒入10个无菌培养皿中，待冷却凝固后在28℃保温培养7天。观察培养皿发现均为独立菌落，计数得约有50个菌落产生。
36.实施例2
37.将2.0g曲拉通x-114与100ml水混合后在121℃中高温蒸汽灭菌40min，待冷却后与5g乙醇在无菌环境中混匀得混合试剂。将3g琼脂与2g商品葡萄糖马铃薯培养基粉末配制成100ml初始培养基液，加热灭菌后取出，在凝固前加入制得的混合试剂10ml并快速混匀，形成熔化状态的固体培养基；待温度降到40℃左右时在熔化状态的固体培养基中加入100μl的长枝木霉cicc 2524的孢子悬液，混匀，以大约10ml体积倒入10个无菌培养皿中，待冷却凝固后在30℃保温培养7天。观察培养皿发现均为独立菌落，计数得约有120个菌落产生。
38.实施例3
39.将20g曲拉通x-114与80ml水混合后在121℃中高温蒸汽灭菌20min，待冷却后与5g乙醇在无菌环境中混匀得混合试剂。将2.0g琼脂与0.03g尿素、0.025g酵母浸出粉、0.075g蛋白胨、0.14g硫酸铵、1.5g膨胀纤维素、0.2g磷酸二氢钾、0.05g氯化钙、0.05g七水硫酸镁混合，配制成100ml初始培养基液，加热灭菌后取出，在凝固前加入制得的混合试剂1ml并快速混匀，形成熔化状态的固体培养基；待温度降到40℃左右时在熔化状态的固体培养基中加入100μl的绿色木霉cicc41187的孢子悬液，混匀，以大约10ml体积倒入10个无菌培养皿中，待冷却凝固后在28℃保温培养5天。观察培养皿发现均为独立菌落，且有些菌落周围有透明圈；计数得约有70个菌落产生。
40.对比例1
41.与实施例1相比，区别在于混合试剂由10g十二烷基硫酸钠(sds)、100ml去离子水、
5g无水乙醇组成。将100μl的绿色木霉cicc41187的孢子悬液加入到熔化状态的固体培养基中混匀后倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后在28℃保温培养7天后发现没有孢子萌发。
42.对比例2
43.与实施例1相比，区别在于混合试剂由20g tween 80、80ml去离子水、5g无水乙醇组成。100μl的绿色木霉cicc41187的孢子悬液加入到熔化状态的固体培养基中混匀后倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后在28℃保温培养7天后发现菌丝体连成一片，没有独立菌落产生。
44.对比例3
45.与实施例1相比，区别在于混合试剂由20g triton x-100、80ml去离子水、5g无水乙醇组成。100μl的绿色木霉cicc41187的孢子悬液加入到熔化状态的固体培养基中混匀后倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后在28℃保温培养7天后发现菌丝体连成一片，几乎没有独立菌落产生。
46.对比例4
47.与实施例1相比，区别在于混合试剂由20g辛基酚聚氧乙烯醚op-15、80ml去离子水、5g无水乙醇组成。100μl的绿色木霉cicc41187的孢子悬液加入到熔化状态的固体培养基中混匀后倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后在28℃保温培养7天后发现只有少数独立菌落产生，绝大部分孢子没有萌发。
48.综上所述，本发明的固体培养基能够促进丝状菌长成独立菌落，便于筛选、计数，提高了筛选效率。
49.本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

技术特征：
1.一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基，其特征在于，包括曲拉通x-114和琼脂。2.根据权利要求1所述的固体培养基，其特征在于，所述曲拉通x-114在固体培养基中的浓度为0.2-10g/l。3.一种使用如权利要求1所述的固体培养基促进丝状菌长成独立菌落的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将曲拉通x-114与水混合后高温蒸汽灭菌，待冷却后与乙醇在无菌环境中混匀，得混合试剂；将含琼脂的初始培养基液加热灭菌后取出，在凝固前加入混合试剂并快速混匀，形成熔化状态的固体培养基；在熔化状态的固体培养基凝固前加入丝状微生物的菌丝体和/或孢子，混匀后倒入无菌培养皿中，待冷却凝固后保温培养。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述曲拉通x-114与水的质量比为1：(4-50)。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高温蒸汽灭菌的温度为115-121℃，时间为20-40min。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合试剂与初始培养基液的体积比为1：(10-100)。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述混合试剂中乙醇的浓度为50-500g/l。8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乙醇在熔化状态的固体培养基中的浓度为0.5-25g/l。

技术总结
本发明涉及一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基及其使用方法，属于生物化工技术领域。本发明提供了一种促进丝状菌长成独立菌落的固体培养基，包括曲拉通X-114和琼脂；曲拉通X-114在固体培养基中的浓度为0.2-10g/L。本发明还提供了使用固体培养基促进丝状菌长成独立菌落的方法，包括如下步骤：将曲拉通X-114与水混合后高温蒸汽灭菌，待冷却后与乙醇在无菌环境中混匀，得混合试剂；将含琼脂的初始培养基液加热灭菌后取出，在凝固前依次加入混合试剂、丝状微生物的菌丝体和/或孢子，待冷却凝固后保温培养。本发明涉及的固体培养基及其使用方法，有利于独立菌落的形成，便于菌落的筛选计数，试剂制备简单，实验稳定性高，保存时间久，并且使用方法简单。并且使用方法简单。并且使用方法简单。


技术研发人员：王恒伟
受保护的技术使用者：汉元清正生态科技（舟山）有限公司
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2022/3/8