一种控释型微针贴片及其在脱敏治疗领域中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于脱敏治疗的速溶型微针贴片及其制备方法和应用。


背景技术：

2.全世界有数亿人受到过敏性疾病的影响，包括过敏性皮肤炎、过敏性鼻炎、食物过敏、过敏性哮喘等。在过去的几十年里，这些疾病的发病率持续上升。过敏性疾病是全球第六大慢性疾病，已被世界卫生组织列为21世纪重点研究和防治的疾病之一，严重威胁着人类的身体健康和生活质量。
3.糖皮质激素和过敏原免疫治疗(allergen immunotherapy,ait)是过敏反应性疾病治疗的两种主要方式，而ait是唯一一种可以对疾病的基本机制产生深远影响的治疗方法。过敏原免疫治疗也叫脱敏治疗，依赖于在一定间隔的时间内逐步增加特定变应原的给药剂量诱导脱敏并产生耐受性。脱敏治疗是由免疫细胞，包括抗原提呈细胞的介导，调节性t细胞和b细胞发挥核心作用，调节体内igg和ige免疫球蛋白的平衡以及增加th1型细胞因子的产生，从而实现免疫耐受。传统的脱敏治疗——皮下免疫治疗是采用皮下注射的方式将过敏原蛋白递送至皮下脂肪组织。而皮下脂肪中的抗原提呈细胞少，一般需要三到五年的时间来实现过敏症状的长期抑制以及改变尘螨、花粉等过敏的自然史，达到耐受。皮下脱敏治疗存在治疗周期长、患者感到疼痛难以坚持，给药剂量大，患者需到医院由专业的医护人员操作，以及过敏原进入血管引起严重的局部或全身不良反应等一系列问题。其他过敏原免疫疗法如口服脱敏治疗、舌下脱敏治疗，也存在着治疗周期长、安全性低等问题。
4.因此，针对现有的脱敏治疗方法中存在的缺点，迫切需要探索一种无痛安全、方便患者携带应用、自行管理的脱敏治疗手段。
5.微针贴片贴于皮肤上可穿透角质层形成一系列孔道，药物通过这些孔道进入皮肤内，提高了药物的递送效率。采用微针的递药方式一方面可以突破角质层屏障，将许多大分子物质如多肽、蛋白等也可以递送至皮肤内，极大地减小了皮肤对药物递送的限制；另一方面微针不会触及皮肤中的神经和血管，不会引起疼痛和全身性不良反应。此外，利用微针进行脱敏治疗时，微针可以将过敏原精准递送至皮肤的活性表皮和真皮上层，那里的抗原提呈细胞要多于皮下脂肪组织，因此采用微针给药的方式可以减少给药剂量，甚至缩短脱敏治疗的整个疗程。微针贴片不需要专业的医护人员操作，患者可以在家自行应用，利用微针进行免疫治疗在临床应用中具有极大的潜力。
6.目前已有文献报导，佐剂的加入会提高脱敏疫苗的功效，传统佐剂能够在免疫部位触发促炎细胞因子的产生，诱导免疫系统做出反应，根据使用的具体佐剂，免疫反应的类型可能会偏向th1细胞，促进igg的产生，减少ige的产生。而且，已有文献证明，佐剂先行被抗原提呈细胞摄取可以促进抗原提呈细胞的活化，提高抗原提呈细胞的摄取功能，摄取更多过敏原，增强免疫应答效果。
7.微针作为进行脱敏治疗有潜力的给药方式，其中可溶性微针插入皮肤内，药物随
着针体的溶解而释放，在实现药物高利用率的同时，通过调整针体材料组成和配比还可以改变微针的溶解速率，进而影响药物的释放速率而不会产生废弃物。考虑到贴片在皮肤上发挥作用需要较长的时间，给患者的日常生活带来不便，且过敏原在体内长期贮存可能对机体带来不良影响，因此可溶性微针贴片更适合于脱敏治疗。
8.目前国内外专利和文献中还没有将过敏原与佐剂同时载入可溶性微针贴片中，通过调节微针针尖和针体的溶解时间实现佐剂与过敏原的控制释放进行脱敏治疗的实例。


技术实现要素：

9.为了解决上述技术存在的不足之处，本发明的目的是提供一种用于脱敏治疗的控释型微针贴片，该控释型微针贴片可简便有效地将佐剂与过敏原先后递送进皮肤表皮和真皮层中而不触及真皮层中的毛细血管和神经末梢，针尖在皮内溶解先行释放佐剂，针体在皮内溶解后释放过敏原，从而实现脱敏治疗的目的。
10.本发明的另一个目的是提供一种用于制造这种微针贴片的方法。
11.具体的，本发明采用以下技术方案：
12.一种用于脱敏治疗的控释型微针贴片，所述控释型微针贴片包括微针和基底层，所述微针包括针尖层、针体层；
13.所述针体层上部连接针尖层，所述针体层位于基底层上；
14.所述针尖层包括基质材料、速溶添加剂及佐剂，
15.所述针体层包括基质材料和过敏原。
16.进一步的，所述针体层的长度为150～500μm，所述针尖层的长度为150～500μm，所述微针呈圆锥型结构，所述控释型微针贴片每1cm2含100～1000根微针。
17.进一步的，所述针尖层与针体层中的基质材料为多糖类、纤维素类、蛋白质类、胶类、聚乙烯醇中的一种或几种；
18.进一步优选的，所述多糖选自透明质酸、蔗糖、麦芽糖、葡聚糖、硫酸软骨素中的一种或几种；
19.所述纤维素类包括羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟乙基纤维素中的一种或几种；
20.所述蛋白质类包括丝素蛋白、胶原蛋白中的一种或几种；
21.所述胶类包括明胶、瓜尔胶、黄原胶、阿胶中的一种或几种；
22.更优选的，所述针尖层与针体层中的基质材料为透明质酸。
23.所述速溶添加剂包括单糖类、二糖、小分子醇类、氨基酸类、低分子量聚乙烯吡咯烷酮、寡聚透明质酸中的一种或几种；
24.优选的，所述单糖类为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖中的一种或几种；
25.所述二糖为蔗糖、乳糖、麦芽糖中的一种或几种；
26.所述小分子醇类为甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、甘油中的一种或几种；
27.所述氨基酸类为精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的一种或几种；
28.更优选的，所述速溶添加剂为精氨酸。
29.进一步的，所述佐剂包括免疫调节分子类佐剂、抗原递送类佐剂及复合佐剂中的一种或几种；
30.优选的，所述免疫调节分子类佐剂为cpg的dna序列、r848(雷西莫特，toll样受体7和8激动剂，cas no.：144875-48-9)、细胞因子、去毒的细菌毒素、单磷酰类酯(mpl)中的一种或几种；
31.所述抗原递送类佐剂为磷酸钙、铝盐、mf59(成分为tween80、span85、角鲨烯，粒径为200-300nm)、as03(成分为tween80、α-生育酚、角鲨烯，粒径小于200nm)、af03(成分为角鲨烯、span80、brij56，粒径为90-100nm)中的一种或几种；
32.所述复合类佐剂为as01(成分为皂树皂苷、mpl、二油酰磷脂酰胆碱、胆固醇)、as04(成分为氢氧化铝、mpl)中的一种或几种；
33.进一步优选的，所述cpg的dna序列为cpg odns。
34.进一步的，所述过敏原选自呼吸、食物或皮肤过敏原中的一种或几种；
35.优选的，所述过敏原可制备成提取物、浸出液、肽、重组或合成产品后，与水溶性聚合物溶液混合；
36.进一步优选的，所述过敏原为卵清蛋白(ova)、β-乳球蛋白(β-lg)、α-酪蛋白(α-cn)、花生蛋白提取物(pe)、尘螨蛋白(derp1)、β-伴大豆球蛋白(β-cg)、大豆球蛋白(gl)、卵类粘蛋白(ovm)、卵转铁蛋白(otf)中的一种或几种。
37.进一步的，所述基底层包括一种或多种水溶性聚合物；
38.优选的，所述基底层的水溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、硫酸软骨素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯醇、明胶、葡聚糖、壳聚糖、右旋糖苷、糊精、麦芽糖、支链淀粉、海藻酸钠、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、γ-谷氨酸、聚丙烯酸、丝素蛋白中的一种或多种。
39.进一步优选的，制备基底层的水溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合；
40.更进一步优选的，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的质量比为1：1。
41.进一步的，所述针尖层中佐剂的含量为1～250μg每贴片，所述的针体中过敏原的含量为1～500μg每贴片。
42.本发明的第二个目的是提供一种用于脱敏治疗的控释型微针贴片的制备方法，包括如下步骤：
43.(1)针尖层溶液的制备：称取制备针尖层的基质材料、速溶添加剂、佐剂溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为5％～20％，所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为0.5％～20％，所述佐剂在去离子水中的质量体积浓度为1％～10％，使之成为均一溶液并排气泡，得针尖层溶液；优选的，所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为10％。
44.(2)针体层溶液的制备：称取制备针体层的基质材料、过敏原溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为5％～20％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度为1％～6％，使之成为均一溶液并排除气泡，得针体层溶液；
45.(3)制备控释型微针贴片；
46.优选的，步骤(3)所述控释型微针贴片的制备方法为模具法、滴状喷吹法、3d打印法中的一种或几种；
47.进一步优选的，所述模具法制备方法为：
48.制备基底层溶液：将基底材料溶于体积百分比50％的乙醇中制备成均一溶液后排除气泡，得基底层溶液；基底材料在体积百分比为50％的乙醇的质量体积浓度为10％～50％。
49.取步骤(1)所得针尖层溶液加入微针阴模中，一次或多次加入针尖层溶液在真空度0.07mpa下一次或多次抽真空10min，使针尖层溶液均匀地注入到模具的微针结构中，移除多余的针尖层溶液，通风干燥；将步骤(2)所得针体层溶液加入微针阴模中，一次或多次加入针体层溶液在真空度0.07mpa下一次或多次抽真空10min，使针体层溶液均匀地注入到模具微针结构中，移除多余的针体层溶液，通风干燥；然后将基底层溶液涂覆在微针模具上，将整个微针阴模置于常温干燥器中干燥18～24h，脱模即得控释型微针贴片；
50.进一步优选的，所述滴状喷吹法的制备方法为：采用溶液分配器和自动x、y、z机械臂在0.6kg
·
f/cm条件下放电0.05s，分别将10μl步骤(2)所得针体层溶液滴在上下两组基板阵列上，再将20μl步骤(1)所得针尖层溶液滴在第一滴液滴上，将上板向下移动与液滴相接触，将两基板间预定的距离设置为两个微针长度之和，以5mm/min的速度移动至两极板间预定的距离，室温下对称吹气5min，最后以30mm/min的速度从每个表面分离出2个控释型微针贴片。
51.本发明的第三个目的是提供前述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片在脱敏治疗药物中的应用。
52.进一步的，
53.所述脱敏治疗为皮肤脱敏治疗，使用时将所述药物贴于皮肤表面，所述的针尖层先行释放的佐剂与针体层释放的过敏原的时间间隔为30min-60min；进一步优选的，所述的针尖层先行释放的佐剂与针体层释放的过敏原的时间间隔为30min，在某一个特殊的实施例中，所述的针尖层能够在1min内溶解并释放佐剂，所述的针体层能够在30min内溶解并释放过敏原。
54.优选的，针尖层保证佐剂先行释放一方面佐剂的释放促进反应向th1的偏转，一方面提高抗原提呈细胞免疫功能，摄取更多过敏原，提高免疫应答。
55.优选的，所述微针贴片可在皮内迅速溶解并释放过敏原，在临床上应用于脱敏治疗中，具有无痛安全、方便快捷、无需专业人员操作、患者顺应性高等优点。
56.本发明提供的用于过敏性疾病治疗的控释型微针贴片，与现有的技术相比，具有如下有益效果：
57.1)本发明制备的控释型微针贴片在刺入皮肤之后，未触及真皮层中的毛细血管，不会引起严重不良反应，大大提高患者安全性。
58.2)本发明通过调节药物浓度、制备工艺等手段来达到不同的载药量，结合对针尖层、针体层基质材料、促溶剂及材料间的比例的筛选，实现微针针尖层与针体层的溶解速度不同，所述的针尖层先行释放的佐剂与针体层释放的过敏原的时间间隔可以达到30min-60min，这种佐剂与过敏原的先后释放间隔时间，有利于佐剂先行达到皮肤内的抗原提呈细胞，提高了抗原提呈细胞的活性，可以有更多的抗原提呈细胞活化来摄取过敏原，且佐剂的先行释放也会诱导整个免疫反应向th1型有利的方向偏转，使得皮肤脱敏治疗中，比现有技术中只递送过敏原或者同时递送过敏原与佐剂更加有效。为了减少患者应用贴片的时间，优选佐剂在1min内被释放出来，过敏原30min内被释放出来。
59.3)本发明制备的控释型微针贴片可以促进免疫反应向th1细胞偏转，提高抗原提呈细胞摄取过敏原的能力，增强免疫应答效果。
附图说明
60.图1为控释型微针贴片的结构示意图；
61.图2为制备控释型微针贴片的流程示意图；
62.图3为控释型微针贴片局部和整体形态图；
63.图4为实施例1-6中载过敏原的不同材料微针的溶解速度；
64.图5为实施例7-12中不同促溶剂对微针溶解速度的影响；
65.图6为实施例16-21中精氨酸浓度对微针刺入率的影响；
66.图7为实施例16中微针刺入成功形态图与实施例21中微针刺入未成功形态图(左侧成功刺入，右侧未刺入)；
67.图8为实施例16-21中精氨酸浓度对微针溶解速度的影响；
68.图9为实施例34中不同质量体积浓度的ova对微针刺入率的影响；
69.图10为实施例35-38微针针尖层和针体层中佐剂及过敏原的体外累积释放率图；
70.图11为实施例39-41不同给药组小鼠血液中igg和ige免疫球蛋白的含量；其中，(a)为不同给药组小鼠血液中igg免疫球蛋白的含量，(b)为不同给药组小鼠血液中ige免疫球蛋白的含量；
71.图12为实施例39-41不同给药组小鼠血液中不同细胞因子的含量，其中，(a)为不同给药组小鼠血液中il-4的含量，(b)为不同给药组小鼠血液中il-13的含量，(c)为不同给药组小鼠血液中il-10的含量。
具体实施方式
72.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合发明中的附图，对本实施例中的技术方案进行具体说明。必须说明的是，下述实施例仅用来解释本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权力要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
73.为实现上述研发思路，本发明采用的技术方案具体如下：
74.1.针体层材料的筛选
75.完全以针体层材料制备微针贴片主要包括如下几个步骤：
76.(1)针体层溶液的制备：将基质材料、过敏原(卵清蛋白，ova)按质量比为5：2溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度为4％，配制针体层溶液。
77.本实施例所述基质材料为：透明质酸(ha)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、羧甲基纤维素(cmc)、硫酸软骨素(cs)、聚乳酸(pla)。
78.(2)基底溶液的制备：所述的水溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合，将两者按质量比为1：1溶解在体积百分比50％乙醇溶液中，制备成均一溶液后排除气泡，配制基底溶液。
79.(3)微针贴片的制备：采用模具法，将针体层溶液一次性注入微针阴模中，在真空
度0.07mpa条件下抽真空10min，将多余溶液移除，通风干燥1h，将模具中注入基底溶液，在常温干燥器中干燥20h，脱模即得微针贴片。
80.表1.微针贴片针体层的合成处方
[0081] 处方组成(w/w)实施例1ha:ova＝5：2实施例2pvp:ova＝5：2实施例3cmc:ova＝5：2实施例4pla:ova＝5：2实施例5pva:ova＝5：2实施例6cs:ova＝5：2
[0082]
根据表1不同针体层材料配比的处方制备微针贴片，所述微针的长度为600μm，圆锥型结构，1cm2微针贴片上有100根微针。
[0083]
2.针尖层材料的筛选
[0084]
微针贴片完全以针尖层材料制备微针贴片主要包括如下几个步骤：
[0085]
(1)针尖层溶液的制备：将所述基质材料、速溶添加剂、佐剂按质量比为5：2：1溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为10％，所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为4％，所述佐剂在去离子水中的质量体积浓度为2％，配制针体层溶液。
[0086]
本实施例基质材料为透明质酸(ha)；
[0087]
速溶添加剂为蔗糖(suc)、葡萄糖(glu)、山梨醇(sorbitol)、精氨酸(arg)、低分子量聚乙烯吡咯烷酮(pvp k17)和寡聚透明质酸(寡聚ha)；
[0088]
佐剂为cpg odn。
[0089]
(2)基底溶液的制备：所述的水溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇，将两者按质量比为1：1溶解在体积百分比为50％乙醇溶液中，制备成均一溶液后排除气泡，配制基底溶液。
[0090]
(3)微针贴片的制备：采用模具法，将针尖层溶液一次形注入微针阴模中，在真空度0.07mpa条件下抽真空10min，将多余溶液移除，通风干燥1h，将模具中注入基底溶液，在常温干燥器中干燥20h，脱模即得微针贴片。
[0091]
表2.微针贴片针尖层的合成处方
[0092] 处方组成(w/w)实施例7ha:glu：cpg odn＝5：2：1实施例8ha:suc：cpg odn＝5：2：1实施例9ha:arg：cpg odn＝5：2：1实施例10ha:sorbitol：cpg odn＝5：2：1实施例11ha:pvp k17：cpg odn＝5：2：1实施例12ha:寡聚ha：cpg odn＝5：2：1
[0093]
根据表2不同针尖层材料配比的处方制备微针贴片，所述微针的长度为600μm，圆锥型结构，1cm2微针贴片上有100根微针。
[0094]
实施例13：实施例1-6中制备的微针贴片在皮内的溶解速度比较
[0095]
该实施例对实施例1-6中制备的的微针贴片在皮肤内的溶解速度进行筛选。将实施例1-6中制备的速溶型微针贴片以一定的力按入小鼠皮肤内部，分别在5min、10min、15min、20min、30min时将贴片移除，显微镜下观察并计算微针溶解的体积。结果如图4。
[0096]
从图4的结果可以看出，pvp溶解速度太快，不宜制备出具有时间差的两部分微针，而pla溶解速度太慢，导致贴片需要贴敷时间过长，聚乙烯醇(pva)、羧甲基纤维素(cmc)、硫酸软骨素(cs)分别在50min、60min、90min内完全溶解，相比于用透明质酸制备的微针贴片，这三种在皮肤上的贴敷时间长，能够满足过敏原和佐剂的释放时间间隔；而透明质酸可以在30min内溶解完全，在满足与针尖层的溶解时间创造合理的时间差的同时，且在皮肤上的贴敷时间短，因此后续实验中，针体层基质材料选择透明质酸。
[0097]
实施例14：实施例7-12中制备的微针贴片在皮内的溶解速度比较
[0098]
该实施例对实施例7-12中制备的的微针贴片在皮肤内的溶解速度进行筛选。将实施例7-12中制备的速溶型微针贴片以一定的力按入小鼠皮肤内部，分别在5min、10min、15min、20min时将贴片移除，显微镜下观察并计算微针溶解的体积。结果如图5。
[0099]
从图5的结果可以看出，各速溶添加剂的促溶效果分别为加入葡萄糖的微针在20min内溶解的体积为63％、加入蔗糖的微针在20min内溶解的体积为61％、加入甘露醇的微针在20min内溶解的体积为70％、加入精氨酸的微针在20min内溶解的体积为83％、加入聚乙烯吡咯烷酮k17的微针在20min内溶解的体积为40％、加入寡聚透明质酸的微针在20min内溶解的体积为44％，每种速溶添加剂的都可以显著提高微针的溶解速度，但其中精氨酸的促溶效果要明显优于其他速溶添加剂，因此后续实验中，针体材料中速溶添加剂选择精氨酸。
[0100]
实施例15：不同速溶添加剂浓度对微针贴片溶解速度的影响
[0101]
根据表3分别制备以精氨酸为速溶添加剂，精氨酸与精氨酸和透明质酸总质量的质量比为10％、20％、30％、40％、50％、60％的微针贴片。通过微针的致孔率和溶解速度综合选择合适的精氨酸浓度。结果见图6、图7、图8。
[0102]
表3.不同含量速溶添加剂的载药微针贴片的合成处方
[0103][0104]
从图6的结果可以看出，精氨酸与精氨酸和透明质酸总质量的质量比为10％、20％、30％这三个浓度在前三个刺入深度的刺入率都是100％，精氨酸的质量比在50％以内(10％～50％)时能够保证足够的机械强度刺入皮肤，60％比例下的刺入效果无法达到要求(图7)；从图8结果可以看出，精氨酸的质量比为50％时微针的溶解速度最快。因此，针尖层选择ha和质量比为50％的精氨酸混合。在针尖层溶液的制备中，同时考虑制备出微针贴片
所需的机械强度和溶解速度，选择所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为0.5％～20％，优选速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为1.1％、2.5％、4.3％、6.7％、10％，最优选为10％(即精氨酸与精氨酸和透明质酸总质量的的质量比为50％)。
[0105]
3.模具法制备控释型微针贴片
[0106]
表4.控释型微针贴片的制备处方
[0107][0108]
按照上表处方分别配制针尖层、针体层和基底层溶液，取针尖层溶液加入微针阴模中，一次性在真空度0.07mpa下抽真空10min，使溶液均匀地注入到模具微针结构中，刮去多余的溶液，通风干燥；将针体层溶液加入微针阴模中，一次性加入针体溶液在真空度0.07mpa下抽真空10min，使溶液均匀地注入到模具微针结构中，刮去多余的溶液，通风干燥；然后将基底层溶液涂覆在微针模具上，将整个微针阴模置于常温干燥器中干燥24h，脱模即得控释型微针贴片。
[0109]
制备得到的贴片尺寸为，所述针尖层的长度为300μm、针体层的长度为300μm(图1、图2、图3)。
[0110]
针尖层中佐剂的含量为20μg每贴片，所述的针体中过敏原的含量为20μg每贴片。
[0111]
实施例31：滴状喷吹法制备控释型微针贴片
[0112]
根据实施例22的处方，采用滴状喷吹法制备控释型微针贴片，具体方法如下：
[0113]
(1)针尖层溶液的制备：将制备针尖层的基质材料、速溶添加剂、佐剂按照实施例22的种类和重量份称取，溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为
10％，所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为10％，所述佐剂在去离子水中的质量体积浓度为2％，使之成为均一溶液并排气泡，得针尖层溶液；
[0114]
(2)针体层溶液的制备：将制备针体层的基质材料、过敏原ova按照表5的种类和重量份称取，溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度为2％，使之成为均一溶液并排除气泡，得针体层溶液；
[0115]
(3)基底层溶液的制备：称取基底材料cmc溶于去离子水中，所述基底材料在去离子水中的质量体积浓度为20％，制备成均一溶液后排除气泡，得基底层溶液；
[0116]
(4)控释型微针贴片的制备：采用溶液分配器和自动x、y、z机械臂在0.6kg
·
f/cm条件下放电0.05s，分别将10μl含过敏原的针体层溶液滴在上下两组基板阵列上，再将20μl含佐剂的针尖层溶液滴在第一滴液滴上，将上板向下移动与液滴相接触，以5mm/min的速度移动至两极板间预定的距离(两个微针长度之和)，室温下对称吹气5min，最后以30mm/min的速度从每个表面分离出2个控释型微针贴片。
[0117]
制备得到的贴片尺寸为，所述针尖层的长度为300μm、针体层的长度为300μm(图1、图2、图3)。
[0118]
针尖层中佐剂的含量为20μg每贴片，所述的针体中过敏原的含量为20μg每贴片。
[0119]
实施例32：不同制备工艺与过敏原载药量之间的关系
[0120]
将基质材料(透明质酸，ha)、过敏原(卵清蛋白，ova)按质量比为5：1溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度浓度为2％，配制针体溶液。将针体溶液覆盖在模具上，分别采用一次加压法和两次加压法制备微针贴片。一次加压法是在真空度0.07mpa条件下抽真空10min，，刮掉多余溶液后干燥，然后加入基底溶液，干燥脱模；两次加压法与一次加压法的区别在于加入基底溶液前，两次加压法需再次加入针体溶液，在真空度0.07mpa条件下抽真空10min，干燥后加入基底溶液。将制备好的微针贴片用手术刀片刮下微针针体，收集后溶解在0.5ml pbs中，用bca试剂盒法测微针针体的过敏原载药量。结果如表3。
[0121]
表5.不同制备工艺下的载药量
[0122][0123]
从结果可以看出，制备过程中再次加压可以有效提高微针贴片的载药量。因此，可以通过调整制备工艺控制微针贴片的载药量。
[0124]
实施例33：不同过敏原浓度与过敏原载药量之间的关系
[0125]
将基质材料(透明质酸，ha)、过敏原(卵清蛋白，ova)溶解在去离子水中，所述基质
材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度浓度分别为1％、2％、4％，配制针体溶液。采用实施例25所述一次加压法制备不同载药量的微针贴片；用手术刀片刮下微针针体，收集后溶解在0.5mlpbs中，用bca试剂盒法测微针针体的载药量。结果见表6。
[0126]
表6.ova浓度与微针载药量的关系
[0127][0128]
根据表6中的结果，ova质量体积比为2％时得到的微针载药量是1％的1.97倍，4％是2％的2.01倍。结果表明微针载药量同ova浓度基本呈线性关系增长。因此，可以通过调节过敏原浓度来控制载药量。
[0129]
实施例34：微针所载过敏原在去离子水中的质量体积浓度范围
[0130]
将基质材料(透明质酸，ha)、过敏原(卵清蛋白，ova)溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％，配制针体溶液，采用实施例25所述一次加压法制备不同载药量的微针贴片。将制备出的微针贴片应用于人工皮肤，观察微针贴片的刺入率。结果如图9所示。
[0131]
根据图9所示的结果，当ova的质量体积浓度浓度为1％-6％时，微针在375μm处的刺入率都在80％以上，满足微针在临床上应用的条件；当ova的质量体积浓度浓度大于6％时，微针在125μm处的刺入率都在80％以下，无法正常使用。因此过敏原在去离子水中的质量体积浓度范围在1％-6％之间。
[0132]
4.微针贴片的针尖层和针体层药物释放速率考察
[0133]
利用fam标记ova，制备不同处方的微针贴片，处方如表7所示。
[0134]
具体方法如下：
[0135]
(1)针尖层溶液的制备：将制备针尖层的基质材料、速溶添加剂、佐剂按照表5的种类和重量份称取，溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为5％～20％，所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为0.5％～20％，所述佐剂在去离子水中的质量体积浓度为1％～10％，使之成为均一溶液并排气泡，得针尖层溶液；
[0136]
(2)针体层溶液的制备：将制备针体层的基质材料、过敏原fam-ova按照表5的种类
和重量份称取，溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为5％～20％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度为1％～6％，使之成为均一溶液并排除气泡，得针体层溶液；
[0137]
(3)基底层溶液的制备：将基底材料(聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合，二者的质量比为1：1)溶于体积百分比为50％乙醇中，制备成均一溶液后排除气泡，得基底层溶液；
[0138]
(4)控释型微针贴片的制备：取步骤(1)所得针尖层溶液加入微针阴模中，一次性在真空度0.07mpa下抽真空10min，使溶液均匀地注入到模具微针结构的针体中，刮去多余的溶液，通风干燥；将步骤(2)所得针体层溶液加入微针阴模中，一次性加入针体溶液在真空度0.07mpa下抽真空10min，使溶液均匀地注入到模具3d微针结构的针体中，刮去多余的溶液，通风干燥；然后将步骤(3)所得的基底层溶液涂覆在微针模具上，将整个微针阴模置于常温干燥器中干燥24h，脱模即得控释型微针贴片。
[0139]
制备得到的贴片尺寸为，所述针尖层的长度为300μm、针体层的长度为300μm(图1、图2、图3)。
[0140]
针尖层中佐剂的含量为20μg每贴片，所述的针体中过敏原的含量为20μg每贴片。
[0141]
将装载了fam-ova的微针贴片插入单层parafilm m1(pf)膜中，然后将pf膜绕着贴片底板折叠密封，并将一枚硬币应用在系统背面以便贴片下沉。释放实验是将闭合的pf/mn系统放置在盛有30ml磷酸盐缓冲溶液(ph7.4)的烧杯中，置于32℃恒温槽中，搅拌速度220r/min。在预定的时间间隔提取样品(1ml)，并用等体积的pbs代替。药物的释放情况如图10所示。
[0142]
表7.释放实验不同微针贴片处方
[0143][0144]
图10结果表明，针尖层中不加促溶剂组需要30min可完全释放过敏原，加入质量体
积浓度为4.3％(即精氨酸与精氨酸和透明质酸总质量的的质量比为30％)的速溶添加剂葡萄糖、精氨酸组(实施例36、37)分别需要8min、6min完全释放佐剂；而加了质量体积浓度为10％(即精氨酸与精氨酸和透明质酸总质量的的质量比为50％)的速溶添加剂精氨酸的制剂组只需要1min即可释放100％的佐剂；本发明微针的针体层溶液与针尖层溶液的组合为：以ha为基质材料的针体层与加了质量体积浓度为10％的速溶添加剂精氨酸的针尖层时，可以实现佐剂在1min释放，过敏原在30min内可以完全释放，从而在保证时间间隔的同时，减少贴片的贴敷时间。而本发明微针的针尖层溶液与针体层溶液的组合不限于此，只要针尖层中佐剂与针体层中过敏源的释放时间间隔在30min～60min的任意组合，均能够用于制备本发明的控释型微针贴片。
[0145]
5.药效学评价
[0146]
利用balb/c小鼠构建哮喘模型，造模成功后，这些致敏小鼠休息3周，分为四组，对照组(不给药)，a组、b组、c组按照实施例29-31中的处方制备的微针贴片进行给药，即：a组为实施例39微针贴片处理组，b组为实施例40微针贴片处理组，c组为实施例414微针贴片处理组，每周1次，连续三周，治疗结束后，取肺泡灌洗液和血液，对肺泡灌洗液中的炎性细胞进行计数(表8)，检测小鼠血液中igg、ige免疫球蛋白的含量(图11)以及细胞因子的含量(图12)。
[0147]
实施例39：
[0148]
将基质材料(透明质酸，ha)、过敏原(卵清蛋白，ova)溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度浓度为2％，配制微针溶液。
[0149]
采用一次加压法制备只包含过敏原的微针贴片。
[0150]
实施例40：
[0151]
将基质材料(透明质酸，ha)、过敏原(卵清蛋白，ova)、佐剂(cpg odn)溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度浓度为2％，所述佐剂在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为2％配制微针溶液。采用一次加压法制备包含过敏原和佐剂的微针贴片，但该微针贴片过敏原与佐剂同时释放。
[0152]
实施例41：
[0153]
(1)针尖层溶液的制备：将基质材料(透明质酸，ha)、佐剂(cpg odn)、速溶添加剂(精氨酸，arg)溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，所述佐剂在去离子水中的质量体积浓度浓度为2％，所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，使之成为均一溶液并排除气泡，配制针尖层溶液。
[0154]
(2)针体层溶液的制备：将基质材料(透明质酸，ha)、过敏原(卵清蛋白，ova)、溶解在去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度(w/v)为10％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度浓度为2％，使之成为均一溶液并排除气泡，配制针体层溶液。
[0155]
(3)基底层溶液的制备：将基底材料(聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合，二者的质量比为1：1)溶于体积百分比为50％的乙醇中制备成均一溶液后排除气泡，得基底层溶液；
[0156]
(4)控释型微针贴片的制备：取步骤(1)所得针尖层溶液加入微针阴模中，一次或
多次在真空度0.07mpa下抽真空10min，使针尖层溶液均匀地注入到模具的微针结构中，移除多余的针尖层溶液，通风干燥；将步骤(2)所得针体层溶液加入微针阴模中，一次加入针体层溶液在真空度0.07mpa下一次抽真空10min，使针体层溶液均匀地注入到模具微针结构中，移除多余的针体层溶液，通风干燥；然后将步骤(3)所得的基底层溶液涂覆在微针模具上，将整个微针阴模置于常温干燥器中干燥24h，脱模即得包含针尖层和针体层的控释型微针贴片。该微针贴片先在1min内迅速释放佐剂，然后在30min内释放过敏原，达到佐剂与过敏原先后释放的效果。
[0157]
实施例39、40、41制备得到的微针长度为600μm，实施例41所得微针针体层的长度为300μm，所述针尖层的长度为300μm，所述微针呈圆锥型结构，所述控释型微针贴片每1cm2含100根微针。
[0158]
实施例39、40、41制备得到的微针中过敏原的含量为20μg每贴片，实施例40、41所得微针中佐剂的含量为20μg每贴片。
[0159]
表8.肺泡灌洗液中炎细胞计数(mean
±
sd，
×
104/ml)
[0160] 总数淋巴细胞中性粒细胞嗜酸性粒细胞巨噬细胞对照组146
±
28.08.52
±
0.6842.8
±
2.4817.0
±
1.8270.2
±
1.25a组75
±
5.16.23
±
0.5124.8
±
2.5110.9
±
2.3430.7
±
1.18b组32
±
1.33.88
±
0.355.6
±
0.641.8
±
1.2221.1
±
0.15c组18.4
±
2.00.38
±
0.060.51
±
0.0380.019
±
0.003816.2
±
0.37
[0161]
表8结果表明，与对照组不给药相比，a、b、c三个给药组的淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞要显著减少，说明造模过程显著降低了小鼠的气道炎性反应。但其中，加入佐剂组(b组)要比不加佐剂组(a组)降低气道炎性反应的效果要好，而佐剂与过敏原先后释放(c组)的效果要明显好于佐剂与过敏原同时释放(b组)及只递送过敏原(a组)，这说明佐剂的先行释放提高了抗原提呈细胞的活性，增强了小鼠整体的免疫应答，显著降低气道炎性反应。
[0162]
图11结果表明，与对照组不给药相比，只递送过敏原(a组)对于小鼠体内igg含量的增加、ige含量的降低，效果并不明显。递送过敏原与佐剂(b、c组)可明显增加小鼠体内igg含量、降低ige含量；而且佐剂与过敏原先后释放(c组)的效果要明显好于佐剂与过敏原同时释放(b组)的效果。这说明，佐剂先行释放促进了整个免疫反应向th1型有利的方向偏转，产生较多的igg免疫球蛋白，降低了ige免疫球蛋白的量。
[0163]
il-4、il-13属于th2型细胞因子，il-10属于th1性细胞因子。图12结果表明，与对照组不给药相比，只递送过敏原(a组)与同时递送过敏原与佐剂(b组)对降低il-4细胞因子的效果不明显，而佐剂与过敏原先后释放(c组)可显著减低小鼠体内il-4的含量；与对照组不给药相比，a、b、c组都可降低小鼠体内il-13的含量，但是佐剂与过敏原先后释放(c组)的效果最好；与对照组不给药相比，只递送过敏原(a组)与同时递送过敏原与佐剂(b组)对增加il-10细胞因子的效果不明显，而佐剂与过敏原先后释放(c组)可显著增加小鼠体内il-10的含量。这些结果表明，佐剂的先行释放释放促进了整个免疫反应向th1型有利的方向偏转，增加了th1型细胞因子il-10的含量，降低了th2型细胞因子il-4、il-13的含量。
[0164]
综上，本专利设计佐剂与过敏原间隔一定时间先后释放，有利于佐剂先行达到皮肤内的抗原提呈细胞，提高了抗原提呈细胞的活性，可以有更多的抗原提呈细胞活化来摄
取过敏原，且佐剂的先行释放也会诱导整个免疫反应向th1型有利的方向偏转，使得表皮脱敏治疗中，比现有技术中只递送过敏原或者同时递送过敏原与佐剂更加有效。

技术特征：
1.一种用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述控释型微针贴片包括微针和基底层，所述微针包括针尖层、针体层；所述针体层上部连接针尖层，所述针体层位于基底层上；所述针尖层包括基质材料、速溶添加剂及佐剂；所述针体层包括基质材料和过敏原。2.根据权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述针尖层的长度为150～500μm，所述针体层的长度为150～500μm，所述微针呈圆锥型结构，所述控释型微针贴片每1cm2含100～1000根微针。3.根据权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述针尖层与针体层中的基质材料为多糖类、纤维素类、蛋白质类、胶类、聚乙烯醇中的一种或几种；优选的，所述多糖类选自透明质酸、蔗糖、麦芽糖、葡聚糖、壳聚糖、硫酸软骨素中的一种或几种；所述纤维素类包括羧甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羟乙基纤维素中的一种或几种；所述蛋白质类包括丝素蛋白、胶原蛋白中的一种或几种；所述胶类包括明胶、瓜尔胶、黄原胶、阿胶中的一种或几种；进一步优选的，所述针尖层与针体层中的基质材料为透明质酸。4.根据权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述速溶添加剂包括单糖类、二糖、小分子醇类、氨基酸类、低分子量聚乙烯吡咯烷酮、寡聚透明质酸中的一种或几种；优选的，所述单糖类为葡萄糖、果糖、半乳糖、核糖中的一种或几种；所述二糖为蔗糖、乳糖、麦芽糖中的一种或几种；所述小分子醇类为甘露醇、山梨醇、木糖醇、赤藓糖醇、甘油中的一种或几种；所述氨基酸类为精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸中的一种或几种；进一步优选的，所述速溶添加剂为精氨酸。5.根据权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述佐剂包括免疫调节分子类佐剂、抗原递送类佐剂及复合佐剂中的一种或几种；优选的，所述免疫调节分子类佐剂为cpg的dna序列、r848、细胞因子、去毒的细菌毒素、单磷酰类酯中的一种或几种；所述抗原递送类佐剂为磷酸钙、铝盐、mf59、as03、af03中的一种或几种；所述复合类佐剂为as01、as04中的一种或几种；进一步优选的，所述cpg的dna序列为cpg odns。6.根据权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述过敏原选自呼吸、食物或皮肤过敏原中的一种或几种；优选的，所述过敏原可制备成提取物、浸出液、肽、重组或合成产品后，与水溶性聚合物溶液混合；优选的，所述过敏原为卵清蛋白、β-乳球蛋白、α-酪蛋白、花生蛋白提取物、尘螨蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、卵类粘蛋白、卵转铁蛋白中的一种或几种。7.根据权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述基底层包括一种或多种水溶性聚合物；
优选的，基底层的水溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮、透明质酸、硫酸软骨素、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素、聚乙烯醇、明胶、葡聚糖、壳聚糖、右旋糖苷、糊精、麦芽糖、支链淀粉、海藻酸钠、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、γ-谷氨酸、聚丙烯酸、丝素蛋白中的一种或多种；进一步优选的，所述基底层水溶性聚合物为聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的混合，更优选的，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇的质量比为1：1。8.根据权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片，其特征在于，所述针尖层中佐剂的含量为1～250μg每贴片，所述的针体中过敏原的含量为1～500μg每贴片。9.权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片的制备方法，其特征在于，(1)针尖层溶液的制备：称取制备针尖层的基质材料、速溶添加剂、佐剂溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为5％～20％，所述速溶添加剂在去离子水中的质量体积浓度为0.5％～20％，所述佐剂在去离子水中的质量体积浓度为1％～10％，使之成为均一溶液并排气泡，得针尖层溶液；(2)针体层溶液的制备：称取制备针体层的基质材料、过敏原溶于去离子水中，所述基质材料在去离子水中的质量体积浓度为5％～20％，所述过敏原在去离子水中的质量体积浓度为1％～6％，使之成为均一溶液并排除气泡，得针体层溶液；(3)制备控释型微针贴片；优选的，步骤(3)所述控释型微针贴片的制备方法选自模具法、滴状喷吹法、3d打印法中的一种或几种；进一步优选的，所述模具法制备方法为：制备基底层溶液：将基底材料溶于体积百分比50％的乙醇中制备成均一溶液后排除气泡，得基底层溶液；取步骤(1)所得针尖层溶液加入微针阴模中，一次或多次加入针尖层溶液在真空度0.07mpa下一次或多次抽真空10min，使针尖层溶液均匀地注入到模具的微针结构中，移除多余的针尖层溶液，通风干燥；将步骤(2)所得针体层溶液加入微针阴模中，一次或多次加入针体层溶液在真空度0.07mpa下一次或多次抽真空10min，使针体层溶液均匀地注入到模具微针结构中，移除多余的针体层溶液，通风干燥；然后将基底层溶液涂覆在微针模具上，将整个微针阴模置于常温干燥器中干燥18～24h，脱模即得控释型微针贴片；进一步优选的，所述滴状喷吹法的制备方法为：采用溶液分配器和自动x、y、z机械臂在0.6kg
·
f/cm条件下放电0.05s，分别将10μl步骤(2)所得针体层溶液滴在上下两组基板阵列上，再将20μl步骤(1)所得针尖层溶液滴在第一滴液滴上，将上板向下移动与液滴相接触，将两基板间预定的距离设置为两个微针长度之和，以5mm/min的速度移动至两极板间预定的距离，室温下对称吹气5min，最后以30mm/min的速度从每个表面分离出2个控释型微针贴片。10.权利要求1所述的用于脱敏治疗的控释型微针贴片在脱敏治疗药物中的应用，优选的，所述脱敏治疗为皮肤脱敏治疗，使用时将所述药物贴于皮肤表面，所述的针尖层先行释放的佐剂与针体层在后释放的过敏原的时间间隔为30min-60min；进一步优选的，所述的针
尖层先行释放的佐剂与针体层在后释放的过敏原的时间间隔为30min；更优选的，所述的针尖层在1min内溶解并释放佐剂，所述的针体层在30min内溶解并释放过敏原。

技术总结
本发明提供了一种控释型微针贴片及其在脱敏治疗领域中的应用，该控释型微针贴片主要包括针尖层、针体层及基底层；针尖层是由基质材料、速溶添加剂及佐剂组成，针体层由基质材料和过敏原组成，基底层由一种或多种水溶性聚合物组成。该控释型微针贴片插入皮肤后，针尖层先行溶解、释放佐剂，针体层后溶解、释放过敏原。佐剂与过敏原的释放间隔达30～60min。本发明制备的控释型微针贴片由于佐剂的先行释放可提高抗原提呈细胞的免疫功能，增强机体免疫应答，在脱敏治疗的临床应用中具有无痛安全、方便快捷、降低给药剂量、无需专业人员操作、患者顺应性高等优点。者顺应性高等优点。者顺应性高等优点。


技术研发人员：丁杨 朱晓鸿 任建业 张华清 汪瑱 周建平
受保护的技术使用者：中国药科大学
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2022/3/8