一种高纯度羟基酪醇的制备方法与流程

一种高纯度羟基酪醇的制备方法
【技术领域】
1.本发明属于天然产物加工技术领域。更具体地，本发明涉及一种高纯度羟基酪醇的制备方法。


背景技术：

2.羟基酪醇(hydroxytyrosol，ht)化学名为3,4-二羟基苯乙醇，是一种在油橄榄中的天然功能活性成分。现代研究表明，羟基酪醇具有很强的去自由基和抗氧化能力，它还具有抑菌抗炎以及抗肿瘤等等药理活性，它还可有效预防心脑血管疾病以及糖脂代谢相关疾病。近年来，人们还发现羟基酪醇能够与gp41蛋白结合，阻断人免疫缺陷病毒(hiv)进入宿主细胞，用于艾滋病的防治。
3.天然的羟基酪醇是存在于橄榄油中的小分子酚类化合物，含量非常低，其主要以酯化物(橄榄苦苷)的形式存在于油橄榄的各个部位。羟基酪醇和橄榄苦苷的分子结构式如下：
[0004][0005]
目前，利用橄榄苦苷降解制备羟基酪醇的主要技术是酸碱水解法，离子交换树脂法，酶法。其中酸水解主要是硫酸、盐酸水解，例如antonoi等人在wo2008136037、发明名称“chemical-catalytic method for the peracylation of oleuropein and its products of hydrolysis”中公开采用酸催化降解方法是100g橄榄苦苷在硫酸和稀土卤化物催化下水解得到13g羟基酪醇、3g榄香酸、2.8g橄榄苦苷苷元，但羟基酪醇收率很低；cuomo等人在u.s.patent 6361803、发明名称“antioxidant compositions extracted from a wastewater from olive oil production”中公开了采用酸水解橄榄果浆和xad-7树脂分离方法，但羟基酪醇回收率与纯度均较低。leonardis等人在题目“isolation of a hydroxytyrosol-rich extract from olive leaves(olea europaea l.)and evaluation of its antioxidant properties and bioactivity”，《european food research and technology》,226(4):653～659，(2008)中采用10％的盐酸水蒸气(100℃)提取橄榄叶1h，再用乙酸乙酯萃取，其羟基酪醇含量达到92％。villanova等人在ep 1623960、发明名称“process for the recovery of tyrosol and hydroxytyrosol from oil mill wastewaters and catalytic oxidation method in order to convert tyrosol in hydroxytyrosol”中公开了在中性或碱性条件下水解油橄榄加工废水，经过微滤、超滤、纳
滤、反渗透膜分离得到1g/l羟基酪醇。党建章等人在题目“橄榄叶中橄榄苦苷不同提取方法的研究”，《深圳职业技术学院学报》，5(4):34～36，(2006)中公开了采用盐酸水解橄榄苦苷粗提物，在105℃、盐酸浓度0.5mol/l的条件下水解15min，橄榄苦苷转化率为56.3％，羟基酪醇纯度为4.6％。cn104926615a公开了一种以半纤维素酶水解橄榄苦苷制备羟基酪醇的方法，在60℃、ph5.5下反应6h，橄榄苦苷的降解率为85.28％，羟基酪醇含量仅能达到6.07％。cn107217076a公开了一种以富含β-葡萄糖苷酶的纤维素酶水解橄榄苦苷制备羟基酪醇的方法，橄榄苦苷降解率可达95％以上，羟基酪醇得率可达到80％-90％。但是，该方法在酶水解反应后需要控温至100℃以上继续保持24h以上，整体反应时间长达36h以上，且酶不可回收利用，该技术成本较高，难以产业化。cn108610241a公开了一种以oh型离子交换树脂为催化剂催化橄榄苦苷水解，采用含氯溶剂萃取制备羟基酪醇的方法，该方法制备得到的羟基酪醇纯度达到39.5％，但离子交换树脂需要进行复杂的预处理，其中包括酸碱处理，将会造成一定的污染。
[0006]
目前，羟基酪醇的分离富集方法主要是柱层析分离，采用大孔树脂对羟基酪醇进行吸附与洗脱，例如cn102276424a、cn101298411a、cn101973853a等。
[0007]
分子蒸馏是一种在高真空下操作的蒸馏方法，这时蒸气分子的平均自由程大于蒸发表面与冷凝表面之间的距离，从而可利用料液中各组分蒸发速率的差异，对液体混合物进行分离。分子蒸馏技术应用在天然产物分离上可以保护高沸点、易氧化热敏性组分活性。
[0008]
针对现有技术缺陷和特点，本发明人进行了大量研究与分析总结工作，终于完成了本发明。


技术实现要素：

[0009]
[要解决的技术问题]
[0010]
本发明的目的是提供一种高纯度羟基酪醇的制备方法。
[0011]
[技术方案]
[0012]
本发明是通过下述技术方案实现的。
[0013]
本发明涉及一种高纯度羟基酪醇的制备方法。
[0014]
该制备方法的步骤如下：
[0015]
a、制备溶液
[0016]
按照以克计橄榄苦苷与以毫升计乙醇水溶液的比20～100：1000，加热搅拌将橄榄苦苷溶于乙醇水溶液中，得到橄榄苦苷乙醇溶液；
[0017]
b、多孔陶瓷球负载酶
[0018]
按照以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比1～5：20～50，分别将纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，接着按照以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比20～50：1～5，添加浓度为以体积计0.8～1.2％戊二醛水溶液，加入清洗干净的多孔陶瓷球，在摇床中在温度10～30℃与转速100～150rpm的条件下处理2～4h，分离得到的多孔陶瓷球在-20～-50℃的条件下预冷冻2～4h，接着在冷冻干燥机中冷冻干燥至水含量为以重量计0.5％以下，得到一种负载酶的多孔陶瓷球；
[0019]
c、负载酶多孔陶瓷球后处理
[0020]
按照以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为1～2：50～100，将热固性丙烯酸树
脂溶解在丙酮中，然后加入步骤b得到的负载酶多孔陶瓷球，搅拌25～35min，过滤分离，其多孔陶瓷球置于通风橱中自然风干，然后使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，洗涤直至清洗液中没有酶，得到一种固定化酶；
[0021]
d、纯化
[0022]
将步骤c得到的固定化酶装载在生物反应器中，让步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速60～100rpm、温度40～55℃与流速5～20升/小时的条件下进行纯化，并且按照回流量与与送到分子蒸馏处理量之比4～20：1，把从生物反应器出料口(7)排出的反应液返回到回流口(10)，余下的反应液送到两级分子蒸馏器中进行分子蒸馏，得到纯度为以重量计93％以上的羟基酪醇。
[0023]
根据本发明的一个优选实施方式，在步骤a中，所述乙醇水溶液的浓度是以体积计20～50％。
[0024]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤a中，所述橄榄苦苷乙醇溶液的浓度是20～100g/l。
[0025]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤b中，将纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶溶解的缓冲液是浓度10毫摩尔、ph4.8～6.0的柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液。
[0026]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤b中，多孔陶瓷球是孔径50～200μm、孔分布数量10～50、球直径3～10mm的多孔陶瓷球。
[0027]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤b中，纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶的酶活都是1000～10000iu/mg。
[0028]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤b中，纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶的量是1：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。
[0029]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤c中，热固性丙烯酸树脂是以丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸正丁酯为单体的聚合物，它们的分子量是10000～20000。
[0030]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤d中，所述生物反应器是由不锈钢圆柱形筒体(1)与位于该圆柱形筒两端的半球形盖(15、16)构成的，在不锈钢圆柱形筒体(1)与不锈钢金属夹层(2)之间容纳蒸汽或冷却水控温介质；在不锈钢金属夹层(2)与不锈钢金属栅网(3)之间装填负载酶的多孔陶瓷球；在左半球形盖(15)与右半球形盖(16)之间以与不锈钢圆柱形筒体(1)中心轴重叠方式安装搅拌桨轴(41)，它在左半球形盖(15)的一端安装搅拌桨电机(4)，在搅拌桨轴(41)上均匀地安装搅拌桨叶(42)；在不锈钢圆柱形筒体(1)一侧安装进料口(5)、回流口(10)与蒸汽进口(13)，进料口(5)通过管道与进料泵(6)相连；在它的相对一侧安装出料口(7)与冷凝水出口(14)；出料口(7)通过回流管道(9)经出料泵(8)与回流液阀门(11)与回流口(10)相连。
[0031]
根据本发明的另一个优选实施方式，在步骤d中，所述的两级分子蒸馏是一级分子蒸馏与二级分子蒸馏相继进行的；其中，一级分子蒸馏是在温度40～60℃、刮膜转速60～100rpm、压力50～100pa与进料流速4l/h的条件下进行的；二级分子蒸馏是在温度120～160℃、刮膜转速80～120rpm、压力0.5～10pa与进料流速2l/h的条件下进行的。
[0032]
下面将更详细地描述本发明。
[0033]
本发明涉及一种高纯度羟基酪醇的制备方法。
[0034]
该制备方法的步骤如下：
[0035]
a、制备溶液
[0036]
按照以克计橄榄苦苷与以毫升计乙醇水溶液的比20～100：1000，加热搅拌将橄榄苦苷溶于乙醇水溶液中，得到橄榄苦苷乙醇溶液；
[0037]
在本发明中，使用乙醇水溶液的浓度是以体积计20～50％。如果乙醇水溶液的浓度低于20％，则会导致所述用量橄榄苦苷无法全部溶解；如果乙醇水溶液的浓度高于50％，则会造成后续使用的酶失活；因此，乙醇水溶液的浓度为20～50％是合理的，优选地是30～40％；
[0038]
使用橄榄苦苷乙醇溶液的浓度是20～100g/l。如果橄榄苦苷乙醇溶液的浓度低于20g/l，则会因其浓度太低而造成生产效率过低；如果橄榄苦苷乙醇溶液的浓度高于100g/l，则会造成橄榄苦苷乙醇溶液中还会存在一些未溶解的橄榄苦苷；因此，橄榄苦苷乙醇溶液的浓度为20～100g/l是合理的，优选地是40～80％；
[0039]
在这个步骤中，加热搅拌将橄榄苦苷溶于乙醇水溶液中，这个加热温度通常是40～45℃，如果这个溶解温度低于40℃，则会导致橄榄苦苷溶解不完全，如果这个溶解温度高于45℃，则会影响后续使用酶的酶活。
[0040]
本发明使用的橄榄苦苷是目前市场上销售的产品，例如由铼博(上海)生化科技有限公司以商品名橄榄苦甙销售的产品。
[0041]
b、多孔陶瓷球负载酶
[0042]
按照以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比1～5：20～50，分别将纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，接着按照以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比20～50：1～5，添加浓度为以体积计0.8～1.2％戊二醛水溶液，加入清洗干净的多孔陶瓷球，在摇床中在温度10～30℃与转速100～150rpm的条件下处理2～4h，分离得到的多孔陶瓷球在-20～-50℃的条件下预冷冻2～4h，接着在冷冻干燥机中冷冻干燥至水含量为以重量计0.5％以下，得到一种负载酶的多孔陶瓷球；
[0043]
在本发明中，纤维素酶在本发明高纯度羟基酪醇制备方法中的主要作用是催化橄榄苦苷分子结构中的糖苷键；
[0044]
半纤维素酶在本发明高纯度羟基酪醇制备方法中的主要作用是协同纤维素酶催化橄榄苦苷分子结构中的糖苷键；
[0045]
褶皱假丝酵母脂肪酶在本发明高纯度羟基酪醇制备方法中的主要作用是催化橄榄苦苷分子结构中的酯键；
[0046]
β-葡萄糖苷酶在本发明高纯度羟基酪醇制备方法中的主要作用是与纤维素酶和半纤维素酶共同催化橄榄苦苷分子结构中的糖苷键；
[0047]
在本发明中，将纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶四种酶联合使用的基本目的在于促使橄榄苦苷高效降解释放羟基酪醇。
[0048]
本发明使用的纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶的酶活都是1000～10000iu/mg。纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶的量是1：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。
[0049]
在这个步骤中，将纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶溶
解的缓冲液是浓度10毫摩尔、ph4.8～6.0的柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液。
[0050]
本发明使用的纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶都是目前市场上销售的产品，例如由南宁东恒华道生物科技有限责任公司以商品名纤维素酶销售的纤维素酶、由上海翔洋实业有限公司以商品名半纤维素酶销售的半纤维素酶、由夏盛(北京)生物科技开发有限公司以商品名纤维二糖酶销售的β-葡萄糖苷酶、由上海甄准生物科技有限公司以商品名lipaseaysamano销售的褶皱假丝酵母脂肪酶。
[0051]
在本发明中，以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比是1～5：20～50。缓冲液的用量为20～50时，如果酶粉的用量低于1，则多孔陶瓷球负载酶的催化效率较低；如果酶粉的用量高于5，则这些酶粉不能完全溶于缓冲液中，影响多孔陶瓷球负载酶的效果；因此，酶粉的用量为1～5是合适的；
[0052]
酶粉的用量为1～5时，如果缓冲液的用量低于20，则酶粉不能完全溶解，影响多孔陶瓷球负载酶的效果；如果缓冲液的用量高于50，则多孔陶瓷球负载酶的酶活低，无法满足生产需要；因此，缓冲液的用量为20～50是恰当的；
[0053]
在这个步骤中，添加戊二醛水溶液的主要作用在于作为交联剂将酶固定在多孔陶瓷球内部。
[0054]
以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比20～50：1～5。戊二醛水溶液的用量为1～5时，如果酶液的用量低于20，则制备的固定化酶由于交联剂比例过高，酶的活力将会大大降低；如果酶液的用量高于50，则负载在陶瓷球内部的酶量较低，制备的固定化酶催化活力不够；因此，酶液的用量为20～50是合适的；
[0055]
酶液的用量为20～50时，如果戊二醛水溶液的用量低于1，则制备的固定化酶负载量较低，催化效果较差；如果戊二醛水溶液的用量高于5，则又会因为交联剂浓度过高，影响酶活；因此，戊二醛水溶液的用量为1～5是可取的。
[0056]
本发明使用的戊二醛是目前市场上销售的产品，例如由济南英顺化工有限公司以商品名戊二醛销售的产品。
[0057]
在本发明中，多孔陶瓷球的主要作用机制是作为多酶的载体将酶固定化在其内部孔隙中，制备的固定化酶可长期重复使用。本发明使用的多孔陶瓷球是孔径50～200μm、孔分布数量10～50、球直径3～10mm的多孔陶瓷球。多孔陶瓷球的参数超过所述的范围是不可取的，因为超出该范围时，酶不易固定在陶瓷球内部或制备的固定化酶催化效果差。本发明使用的多孔陶瓷球是目前市场上销售的产品，例如由萍乡市东陶陶瓷有限责任公司以商品名填料瓷球销售的产品。
[0058]
清洗干净的多孔陶瓷球在摇床中在温度10～30℃与转速100～150rpm的条件下处理2～4h的基本作用是使得酶液均匀吸附在多孔陶瓷球上；
[0059]
在转速100～150rpm与处理时间2～4h的情况下，如果温度低于10℃，则多孔陶瓷球的吸附效果较差；如果温度高于30℃，则可能会影响酶活。因此，处理温度为10～30℃是合适的，优选地是14℃～26℃。在处理温度10～30℃与处理时间2～4h的情况下，如果转速低于100rpm，则酶液不能均匀吸附；如果转速高于150rpm，则是不必要的，多次实验证明转速在150rpm以下已能充分混合均匀该体系。因此，转速为100～150rpm是恰当的，优选地是110～140rpm。在温度10～30℃与转速100～150rpm的情况下，如果处理时间少于2h，则酶液未能充分的吸附在多孔陶瓷球内；如果处理时间长4h，则制备出的陶瓷球催化活性反而会
降低。因此，处理时间为2～4h是可行的，优选地是2.4～3.6h。
[0060]
处理的多孔陶瓷球在-20～-50℃的条件下预冷冻2～4h的基本作用是使其水分充分冷冻结冰；
[0061]
在预冻时间为2～4h时，如果预冷冻温度高于-20℃，则多孔陶瓷球内水分无法完全冷冻结晶；如果预冷冻温度低于-50℃，则会影响多孔陶瓷球的刚度，导致其在反应器中会出现破碎现象。因此，预冷冻温度为-20～-50℃是合适的，优选地是-28℃～-40℃。在预冻温度-20～-50℃的情况下，如果预冻时间少于2h，则陶瓷球水分不能充分冷冻结冰。如果预冻时间长于4h，则多个陶瓷球可能会黏连。因此，预冻时间为2～4h是适当的，优选地是2.5～3.5h。
[0062]
将多孔陶瓷球水含量控制在以重量计0.5％以下是因为水分含量高于0.5％会影响酶的催化效果。
[0063]
根据称量负载酶前后的多孔陶瓷球质量，检测所得到的负载酶多孔陶瓷球的酶含量是以质量计3％～5％。
[0064]
本发明使用的摇床与冷冻干燥机都是目前市场上销售的产品，例如由苏州培英实验设备有限公司以商品名thz-c恒温振荡器销售的摇床，由北京四环起航科技有限公司以商品名lgj-25d压盖型真空冷冻干燥机销售的冷冻干燥机。
[0065]
c、负载酶多孔陶瓷球后处理
[0066]
按照以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为1～2：50～100，将热固性丙烯酸树脂溶解在丙酮中，然后加入步骤b得到的负载酶多孔陶瓷球，搅拌25～35min，过滤分离，其多孔陶瓷球置于通风橱中自然风干，然后使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，洗涤直至清洗液中没有酶，得到一种固定化酶；
[0067]
本发明使用热固性丙烯酸树脂的目的在于完全将酶固定化在多孔陶瓷球内。
[0068]
本发明使用的热固性丙烯酸树脂是聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸乙酯、聚丙烯酸正丁酯、聚甲基丙烯酸甲酯与聚甲基丙烯酸正丁酯等聚合物其中一种或多种，它们的分子量是10000～20000。
[0069]
这些聚合物都是目前市场上销售的产品，例如由博高合成材料有限公司以商品名rs2901-50xnb销售的以丙烯酸甲酯为单体的聚合物、由博高合成材料有限公司以商品名rs2997-70s1销售的以甲基丙烯酸正丁酯为单体的聚合物。
[0070]
在这个步骤中，以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为1～2：50～100。丙酮的用量为50～100时，如果丙烯酸树脂的用量低于1，则多孔陶瓷球封闭效果不佳，在后续处理过程中酶会脱离多孔陶瓷球而造成酶活损失，影响连续生产；如果丙烯酸树脂的用量高于2，则可能导致多孔陶瓷球空隙完全封闭，则制备的固定化酶被完全封闭，无法与底物接触而失效；因此，丙烯酸树脂的用量为1～2是恰当的；丙烯酸树脂的用量为1～2时，如果丙酮的用量低于50，则丙烯酸树脂浓度过高，可能会造成多孔陶瓷球完全封闭，底物无法与酶接触；如果丙酮的用量高于100，则又可能会造成多孔陶瓷球空隙过大，在生产过程中，酶会脱离固定化基质造成酶活损失，影响连续生产；因此，丙酮的用量为50～100是适当的。
[0071]
本发明使用的多孔陶瓷球是采用喷淋和冲洗方法使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液进行清洗的。
[0072]
本发明采用本领域技术人员鉴定蛋白所熟知的双缩脲试剂来检测清洗液中是否
含有酶。
[0073]
d、纯化
[0074]
将步骤c得到的固定化酶装载在生物反应器中，让步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速60～100rpm、温度40～55℃与流速5～20升/小时的条件下进行纯化，并且按照回流量与与送到分子蒸馏处理量之比4～20：1，把从生物反应器出料口(7)排出的反应液返回到回流口(10)，余下的反应液送到两级分子蒸馏器中进行分子蒸馏，得到纯度为以重量计93％以上的羟基酪醇。
[0075]
在这个步骤中，所述生物反应器是由不锈钢圆柱形筒体(1)与位于该圆柱形筒两端的半球形盖(15、16)构成的，该生物反应器的具体结构参见附图4。
[0076]
在本发明使用的生物反应器中，在不锈钢圆柱形筒体(1)与不锈钢金属夹层(2)之间容纳蒸汽或冷却水控温介质；在不锈钢金属夹层(2)与不锈钢金属栅网(3)之间装填负载酶的多孔陶瓷球；在左半球形盖(15)与右半球形盖(16)之间以与不锈钢圆柱形筒体(1)中心轴重叠方式安装搅拌桨轴(41)，它在左半球形盖(15)的一端安装搅拌桨电机(4)，在搅拌桨轴(41)上均匀地安装搅拌桨叶(42)；在不锈钢圆柱形筒体(1)一侧安装进料口(5)、回流口(10)与蒸汽进口(13)，进料口(5)通过管道与进料泵(6)相连；在它的相对一侧安装出料口(7)与冷凝水出口(14)；出料口(7)通过回流管道(9)经出料泵(8)与回流液阀门(11)与回流口(10)相连。
[0077]
步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中进行反应的机制是，橄榄苦苷溶液泵入生物反应器中，它在搅拌作用下与所固定的载酶多孔陶瓷球充分接触，在酶的作用下橄榄苦苷分子结构中的糖苷键和酯键断裂，降解为羟基酪醇，由出料口(7)流出该生物反应器。
[0078]
该橄榄苦苷乙醇溶液在转速60～100rpm、温度40～55℃与流速5～20升/小时的条件下进行纯化。在温度为40～55℃与流速为5～20升/小时的情况下，如果生物反应器的转速低于60rpm，则由出料口(7)排出的反应液经检测橄榄苦苷降解率(s)为95％以下，羟基酪醇得率(r)低于60％；如果生物反应器的转速高于100rpm，则会影响装载的固定化酶使用寿命，不能长期使用。在转速60～100rpm与流速5～20升/小时的情况下，如果温度低于40℃时，则反应温度过低，由出料口(7)排出的反应液经检测s低于95％，r为60％以下；如果温度高于55℃，则会严重影响酶的使用寿命。在转速60～100rpm与温度40～55℃的情况下，如果流速低于5升/小时，则生产效率低下，如果流速高于20升/小时，则由出料口(7)排出的反应液经检测s低于95％，r小于60％，无法满足生产需要。
[0079]
橄榄苦苷的转化率s与羟基酪醇收率r的计算公式如下：
[0080][0081][0082]
式中：
[0083]c出口橄榄苦苷
为由出料口(7)排出反应液的橄榄苦苷浓度(g/ml)；
[0084]c进口橄榄苦苷
为由进料口(5)输入料液的橄榄苦苷浓度(g/ml)；
[0085]c出口羟基酪醇
为由出料口(7)排出反应液的羟基酪醇浓度(g/ml)；
[0086]
0.285为橄榄苦苷全部转化为羟基酪醇的质量系数。
[0087]
优选地，步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速70～90rpm、温度45～50℃与流速为10～15升/小时的条件下进行纯化。
[0088]
在本发明中，回流量应该理解是由出料口(7)排出的反应液通过回流管道(9)经出料泵(8)与回流液阀门(11)送到回流口(10)的反应液的量。回流量与送到分子蒸馏处理量之比(回流比)为4～20：1。如果回流比低于4：1，则酶催化反应不够充分，由出料口(7)排出的反应液检测s低于95％，r小于60％；如果回流比高于20：1，则生产效率比较低。因此，回流量与送到分子蒸馏处理量之比为4～20：1是恰当的；
[0089]
优选地，回流量与送到分子蒸馏处理量之比为8～16：1。
[0090]
根据本发明，在步骤d中，从生物反应器流出的反应液首先采用常规液相色谱分析方法进行分析，确定橄榄苦苷降解率为95％以上时才进行后续的两级分子蒸馏处理。橄榄苦苷标准品液相色谱图参见附图1；羟基酪醇标准品液相色谱图参见附图2；
[0091]
所述的两级分子蒸馏是一级分子蒸馏与二级分子蒸馏相继进行的；其中，一级分子蒸馏是在温度40～60℃、刮膜转速60～100rpm、压力50～100pa与进料流速4l/h的条件下进行的，一级分子蒸馏主要除去反应液中的溶剂；
[0092]
二级分子蒸馏是在温度120～160℃、刮膜转速80～120rpm、压力0.5～10pa与进料流速2l/h的条件下进行的，二级分子蒸馏所得到的轻相即为羟基酪醇产品。
[0093]
采用红外光谱分析方法对二级分子蒸馏时所得到的蒸馏物进行分析，红外光谱分析结果列于附图3，由该红外光谱图确定该产物为羟基酪醇，通过液相检测确定该蒸馏物是纯度为以重量计93％以上的羟基酪醇。
[0094]
[有益效果]
[0095]
本发明的有益技术效果是：本发明采用多种酶联合水解橄榄苦苷制备羟基酪醇，实现了真正橄榄苦苷高效转化为羟基酪醇的酶法工艺，解决了现有单一酶水解橄榄苦苷高降解率低转化率的技术问题，本发明制备方法的橄榄苦苷转化率达80％以上，羟基酪醇收率达80％以上，能够制备得到纯度为以重量计93％以上的羟基酪醇，是一种绿色环保无污染、高效连续实施方法，具有非常良好的应用前景。
【附图说明】
[0096]
图1是橄榄苦苷标准品液相色谱图；
[0097]
图2是羟基酪醇标准品液相色谱图；
[0098]
图3是本发明制备方法制备得到产物的红外光谱图；
[0099]
图4是本发明生物反应器结构示意图；
[0100]
图中：
[0101]
1-不锈钢圆柱形筒体；2-不锈钢金属夹层；3-不锈钢金属栅网；4-搅拌桨电机；41-搅拌桨轴；42-搅拌桨叶；5-进料口；6-进料泵；7-出料口；8-出料泵；9-回流管道；10-回流口；11-回流液阀门；12-回流液流量计；13-蒸汽进口；14-冷凝水出口；15-左半球形盖；16-右半球形盖；17-生物反应器支架。
【具体实施方式】
[0102]
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
[0103]
实施例1：高纯度羟基酪醇的制备
[0104]
该实施例的实施步骤如下：
[0105]
a、制备橄榄苦苷溶液
[0106]
按照以克计橄榄苦苷与以毫升计乙醇水溶液的比100：1000，加热搅拌将橄榄苦苷溶于浓度为以体积计30％的乙醇水溶液中，得到浓度为100g/l的橄榄苦苷乙醇溶液；
[0107]
b、多孔陶瓷球负载酶
[0108]
按照以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比2：40，酶活均为7200iu/mg的纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶，按照其质量比1：1.0：1.0：1.0分别溶于浓度10毫摩尔ph4.8、浓度10毫摩尔ph 5.2、浓度10毫摩尔ph5.6、浓度10毫摩尔ph6.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，接着按照以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比41：4，添加浓度为以体积计1.0％戊二醛水溶液，加入清洗干净的多孔陶瓷球，在摇床中在温度30℃与转速140rpm的条件下处理3h，分离得到的多孔陶瓷球在温度-20℃的条件下预冷冻4h，接着在冷冻干燥机中冷冻干燥至水含量为以重量计0.5％以下，得到一种负载酶的多孔陶瓷球；
[0109]
c、负载酶多孔陶瓷球后处理
[0110]
按照以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为2.0：82，将分子量为10000～20000聚丙烯酸甲酯溶解在丙酮中，然后加入步骤b得到的负载酶多孔陶瓷球，搅拌25min，过滤分离，其多孔陶瓷球置于通风橱中自然风干，然后使用上述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，洗涤直至清洗液中没有酶，得到一种固定化酶；
[0111]
d、纯化
[0112]
将步骤c得到的固定化酶装载在生物反应器中，让步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速86rpm、温度48℃与流速15升/小时的条件下进行纯化，并且按照回流量与送到分子蒸馏处理量之比14：1，把从生物反应器出料口(7)排出的反应液返回到回流口(10)，余下的反应液送到两级分子蒸馏器中进行分子蒸馏，其中，一级分子蒸馏是在温度40℃、刮膜转速60rpm、压力82pa与进料流速4l/h的条件下进行的；二级分子蒸馏是在温度132℃、刮膜转速92rpm、压力3.2pa与进料流速2l/h的条件下进行蒸馏得到所述的羟基酪醇，采用本技术说明书描述的方法检测，该羟基酪醇纯度为以重量计94％，羟基酪醇的收率为85％。
[0113]
实施例2：高纯度羟基酪醇的制备
[0114]
该实施例的实施步骤如下：
[0115]
a、制备橄榄苦苷溶液
[0116]
按照以克计橄榄苦苷与以毫升计乙醇水溶液的比20：1000，加热搅拌将橄榄苦苷溶于浓度为以体积计20％的乙醇水溶液中，得到浓度为20g/l的橄榄苦苷乙醇溶液；
[0117]
b、多孔陶瓷球负载酶
[0118]
按照以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比1：20，酶活均为3500iu/mg的纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶，按照其质量比1：1.0：1.0：1.0分别溶于浓度10毫摩尔ph5.4、浓度10毫摩尔ph 6.0、浓度10毫摩尔ph4.8、浓度10毫摩尔ph5.2的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，接着按照以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比20：1，添加
浓度为以体积计0.8％戊二醛水溶液，加入清洗干净的多孔陶瓷球，在摇床中在温度10℃与转速100rpm的条件下处理4h，分离得到的多孔陶瓷球在温度-29℃的条件下预冷冻3h，接着在冷冻干燥机中冷冻干燥至水含量为以重量计0.5％以下，得到一种负载酶的多孔陶瓷球；
[0119]
c、负载酶多孔陶瓷球后处理
[0120]
按照以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为1.4：50，将分子量为10000～20000聚丙烯酸正丁酯溶解在丙酮中，然后加入步骤b得到的负载酶多孔陶瓷球，搅拌28min，过滤分离，其多孔陶瓷球置于通风橱中自然风干，然后使用上述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，洗涤直至清洗液中没有酶，得到一种固定化酶；
[0121]
d、纯化
[0122]
将步骤c得到的固定化酶装载在生物反应器中，让步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速100rpm、温度52℃与流速20升/小时的条件下进行纯化，并且按照回流量与送到分子蒸馏处理量之比4：1，把从生物反应器出料口(7)排出的反应液返回到回流口(10)，余下的反应液送到两级分子蒸馏器中进行分子蒸馏，其中，一级分子蒸馏是在温度60℃、刮膜转速100rpm、压力100pa与进料流速4l/h的条件下进行的；二级分子蒸馏是在温度120℃、刮膜转速102rpm、压力0.5pa与进料流速2l/h的条件下进行蒸馏得到所述的羟基酪醇，采用本技术说明书描述的方法检测，该羟基酪醇纯度为以重量计96％，羟基酪醇的收率为88％。
[0123]
实施例3：高纯度羟基酪醇的制备
[0124]
该实施例的实施步骤如下：
[0125]
a、制备橄榄苦苷溶液
[0126]
按照以克计橄榄苦苷与以毫升计乙醇水溶液的比45：1000，加热搅拌将橄榄苦苷溶于浓度为以体积计40％的乙醇水溶液中，得到浓度为46g/l的橄榄苦苷乙醇溶液；
[0127]
b、多孔陶瓷球负载酶
[0128]
按照以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比4：30，酶活均为10000iu/mg的纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶，按照其质量比1：1.0：1.0：1.0分别溶于浓度10毫摩尔ph5.6、浓度10毫摩尔ph 4.8、浓度10毫摩尔ph5.3、浓度10毫摩尔ph5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，接着按照以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比32：3，添加浓度为以体积计1.0％戊二醛水溶液，加入清洗干净的多孔陶瓷球，在摇床中在温度16℃与转速150rpm的条件下处理2h，分离得到的多孔陶瓷球在温度-40℃的条件下预冷冻3h，接着在冷冻干燥机中冷冻干燥至水含量为以重量计0.5％以下，得到一种负载酶的多孔陶瓷球；
[0129]
c、负载酶多孔陶瓷球后处理
[0130]
按照以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为1.0：100，将分子量为10000～20000聚甲基丙烯酸甲酯溶解在丙酮中，然后加入步骤b得到的负载酶多孔陶瓷球，搅拌32min，过滤分离，其多孔陶瓷球置于通风橱中自然风干，然后使用上述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，洗涤直至清洗液中没有酶，得到一种固定化酶；
[0131]
d、纯化
[0132]
将步骤c得到的固定化酶装载在生物反应器中，让步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速60rpm、温度40℃与流速5升/小时的条件下进行纯化，并且按照回
流量与送到分子蒸馏处理量之比9：1，把从生物反应器出料口(7)排出的反应液返回到回流口(10)，余下的反应液送到两级分子蒸馏器中进行分子蒸馏，其中，一级分子蒸馏是在温度54℃、刮膜转速84rpm、压力50pa与进料流速4l/h的条件下进行的；二级分子蒸馏是在温度160℃、刮膜转速80rpm、压力10.0pa与进料流速2l/h的条件下进行蒸馏得到所述的羟基酪醇，采用本技术说明书描述的方法检测，该羟基酪醇纯度为以重量计97％，羟基酪醇的收率为92％。
[0133]
实施例4：高纯度羟基酪醇的制备
[0134]
该实施例的实施步骤如下：
[0135]
a、制备橄榄苦苷溶液
[0136]
按照以克计橄榄苦苷与以毫升计乙醇水溶液的比70：1000，加热搅拌将橄榄苦苷溶于浓度为以体积计50％的乙醇水溶液中，得到浓度为72g/l的橄榄苦苷乙醇溶液；
[0137]
b、多孔陶瓷球负载酶
[0138]
按照以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比5：50，酶活均为1000iu/mg的纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶，按照其质量比1：1.0：1.0：1.0分别溶于浓度10毫摩尔ph6.0、浓度10毫摩尔ph 5.5、浓度10毫摩尔ph6.0、浓度10毫摩尔ph4.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，接着按照以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比50：5，添加浓度为以体积计1.2％戊二醛水溶液，加入清洗干净的多孔陶瓷球，在摇床中在温度24℃与转速120rpm的条件下处理3h，分离得到的多孔陶瓷球在温度-50℃的条件下预冷冻2h，接着在冷冻干燥机中冷冻干燥至水含量为以重量计0.5％以下，得到一种负载酶的多孔陶瓷球；
[0139]
c、负载酶多孔陶瓷球后处理
[0140]
按照以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为1.8：68，将分子量为10000～20000聚甲基丙烯酸正丁酯溶解在丙酮中，然后加入步骤b得到的负载酶多孔陶瓷球，搅拌35min，过滤分离，其多孔陶瓷球置于通风橱中自然风干，然后使用上述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，洗涤直至清洗液中没有酶，得到一种固定化酶；
[0141]
d、纯化
[0142]
将步骤c得到的固定化酶装载在生物反应器中，让步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速75rpm、温度55℃与流速10升/小时的条件下进行纯化，并且按照回流量与送到分子蒸馏处理量之比20：1，把从生物反应器出料口(7)排出的反应液返回到回流口(10)，余下的反应液送到两级分子蒸馏器中进行分子蒸馏，其中，一级分子蒸馏是在温度49℃、刮膜转速72rpm、压力72pa与进料流速4l/h的条件下进行的；二级分子蒸馏是在温度140℃、刮膜转速120rpm、压力6.6pa与进料流速2l/h的条件下进行蒸馏得到所述的羟基酪醇，采用本技术说明书描述的方法检测，该羟基酪醇纯度为以重量计95％，羟基酪醇的收率为89％。

技术特征：
1.一种高纯度羟基酪醇的制备方法，其特征在于该制备方法的步骤如下：a、制备溶液按照以克计橄榄苦苷与以毫升计乙醇水溶液的比20～100：1000，加热搅拌将橄榄苦苷溶于乙醇水溶液中，得到橄榄苦苷乙醇溶液；b、多孔陶瓷球负载酶按照以克计酶粉与以毫升计缓冲液的比1～5：20～50，分别将纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，接着按照以毫升计酶液与以毫升计戊二醛水溶液的比20～50：1～5，添加浓度为以体积计0.8～1.2％戊二醛水溶液，加入清洗干净的多孔陶瓷球，在摇床中在温度10～30℃与转速100～150rpm的条件下处理2～4h，分离得到的多孔陶瓷球在-20～-50℃的条件下预冷冻2～4h，接着在冷冻干燥机中冷冻干燥至水含量为以重量计0.5％以下，得到一种负载酶的多孔陶瓷球；c、负载酶多孔陶瓷球后处理按照以克计丙烯酸树脂与以毫升计丙酮之比为1～2：50～100，将热固性丙烯酸树脂溶解在丙酮中，然后加入步骤b得到的负载酶多孔陶瓷球，搅拌25～35min，过滤分离，其多孔陶瓷球置于通风橱中自然风干，然后使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液清洗，洗涤直至清洗液中没有酶，得到一种固定化酶；d、纯化将步骤c得到的固定化酶装载在生物反应器中，让步骤a得到的橄榄苦苷乙醇溶液在该生物反应器中在转速60～100rpm、温度40～55℃与流速5～20升/小时的条件下进行纯化，并且按照回流量与送到分子蒸馏处理量之比4～20：1，把从生物反应器出料口(7)排出的反应液返回到回流口(10)，余下的反应液送到两级分子蒸馏器中进行分子蒸馏，得到纯度为以重量计93％以上的羟基酪醇。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤a中，所述乙醇水溶液的浓度是以体积计20～50％。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤a中，所述橄榄苦苷乙醇溶液的浓度是20～100g/l。4.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在步骤b中，将纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶溶解的缓冲液是浓度10毫摩尔、ph4.8～6.0的柠檬酸-磷酸氢钠缓冲液。5.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在步骤b中，多孔陶瓷球是孔径50～200μm、孔分布数量10～50、球直径3～10mm的多孔陶瓷球。6.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在步骤b中，纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶的酶活都是1000～10000iu/mg。7.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在步骤b中，纤维素酶、半纤维素酶、褶皱假丝酵母脂肪酶与β-葡萄糖苷酶的量是1：0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。8.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在步骤c中，热固性丙烯酸树脂是以丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸正丁酯为单体的聚合物，它们的分子量是10000～20000。9.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在步骤d中，所述生物反应器是由不
锈钢圆柱形筒体(1)与位于该圆柱形筒两端的半球形盖(15、16)构成的，在不锈钢圆柱形筒体(1)与不锈钢金属夹层(2)之间容纳蒸汽或冷却水控温介质；在不锈钢金属夹层(2)与不锈钢金属栅网(3)之间装填负载酶的多孔陶瓷球；在左半球形盖(15)与右半球形盖(16)之间以与不锈钢圆柱形筒体(1)中心轴重叠方式安装搅拌桨轴(41)，它在左半球形盖(15)的一端安装搅拌桨电机(4)，在搅拌桨轴(41)上均匀地安装搅拌桨叶(42)；在不锈钢圆柱形筒体(1)一侧安装进料口(5)、回流口(10)与蒸汽进口(13)，进料口(5)通过管道与进料泵(6)相连；在它的相对一侧安装出料口(7)与冷凝水出口(14)；出料口(7)通过回流管道(9)经出料泵(8)与回流液阀门(11)与回流口(10)相连。10.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于在步骤d中，所述的两级分子蒸馏是一级分子蒸馏与二级分子蒸馏相继进行的；其中，一级分子蒸馏是在温度40～60℃、刮膜转速60～100rpm、压力50～100pa与进料流速4l/h的条件下进行的；二级分子蒸馏是在温度120～160℃、刮膜转速80～120rpm、压力0.5～10pa与进料流速2l/h的条件下进行的。

技术总结
本发明涉及一种高纯度羟基酪醇的制备方法，该制备方法包括制备橄榄苦苷溶液、多孔陶瓷球负载酶、多孔陶瓷球后处理与纯化等步骤。本发明制备方法的橄榄苦苷转化率达80％以上，羟基酪醇收率达80％以上，制备羟基酪醇的纯度为以重量计93％以上，本发明高纯度羟基酪醇制备方法是一种绿色环保无污染、高效连续实施方法，具有非常良好的应用前景。具有非常良好的应用前景。


技术研发人员：孟永宏 胡永员 党银博 郭建琦 牛永洁 杨璐
受保护的技术使用者：西安海斯夫生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2022/3/8