一种调控植物可溶性糖含量的lncRNA及其应用

一种调控植物可溶性糖含量的lncrna及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种调控植物可溶性糖含量的lncrna及其应用。


背景技术：

2.豆科植物是重要的经济、能源和粮食作物。但是，大多数豆科栽培植物基因组大且结构复杂，缺乏有效的遗传转化体系，难以进行分子生物学分析。一年生蒺藜苜蓿与大多数豆科植物遗传关系近，具有二倍纯合体、基因组小、生长周期短、易于人工繁殖和基因转化、已完成基因组测序等优点，使其成为豆科分子生物学研究的模式植物。
3.基因组和转录组测序研究发现，约75％以上的人类基因组和50％以上的拟南芥基因组都能转录成rna。在这些转录产物中，蛋白质编码序列只占了约2％，而98％以上是功能未知的非蛋白质编码序列，其中蕴藏着数目巨大的非编码rna基因。非编码rna是由基因组转录产生的一类不同于mrna的遗传信息分子。根据成熟产物的大小,非编码rna(noncoding rna，ncrna)分为非编码小rna(small noncoding rna，srna)和长链非编码rna(long noncoding rna，lncrna)。lncrna的长度大于200nt，不具备编码蛋白质的功能。lncrna约占细胞内总rna的0.2％。真核生物启动子、增强子和基因间等区域转录可以产生lncrna。真核细胞长链非编码rna的发掘和功能研究，有利于揭示非编码rna介导的遗传信息传递方式和表达调控网络，从不同于蛋白质编码基因的角度注释基因组的结构与功能，深入阐明生命活动的本质和规律。
4.lncrna的作用机制和生物学功能极其复杂，通过影响dna、rna或蛋白质的稳定性，参与生长发育、环境胁迫应答等生物过程。自从发现lncrna xist在x染色体失活中发挥核心作用以来，不断有研究证明大量lncrna在基因印记、细胞分化和发育、抗病反应以及植物春化等细胞生物学过程中发挥作用。基于高通量测序技术和生物信息学分析,已发掘到大量的植物lncrna,但功能及其调控机制得以解析的lncrna较少。植物lncrna的研究主要在以下几个方面取得了一定的研究进展。(1)lncrna参与调控植物生长发育过程。(2)lncrna参与植物生物与非生物逆境应答。(3)植物lncrna参与调控氮和磷等营养元素的平衡。
5.lncrna的结构特征和作用机制具有多样性和复杂性。植物lncrna的研究处于起步阶段，许多关键的问题还没有解决。大量lncrna，特别是与植物代谢相关lncrna的功能有待研究。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的可溶性糖含量。
7.为了解决以上技术问题，本发明提供了一种来源于苜蓿的长链非编码rna，名称为mtcir2，是如下a1)或a2)的长链非编码rna：
8.a1)核苷酸序列是序列表中序列2的长链非编码rna；
9.a2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失
和/或添加得到的与a1)所示的长链非编码rna具有90％以上的同一性且与植物可溶性糖含量相关的长链非编码rna。
10.上述长链非编码rna中，序列表中的序列2由582个核苷酸组成。
11.上述长链非编码rna可人工合成，也可先合成其基因，再进行生物表达得到。
12.上述长链非编码rna中，同一性是指核苷酸的同一性。可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
13.与mtcir2相关的生物材料也属于本发明的保护范围。
14.本发明所提供的与mtcir2相关的生物材料，为下述b1)至b5)中的任一种：
15.b1)所述长链非编码rna mtcir2的基因；
16.b2)含有b1)所述基因的表达盒；
17.b3)含有b1)所述基因的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；
18.b4)含有b1)所述基因的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；
19.b5)含有b1)所述基因的转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。
20.上述生物材料中，b1)所述核酸分子具体可为核苷酸序列是序列表中序列1的dna分子。
21.其中，序列表中的序列1由582个核苷酸组成，其中编码序列是序列表中序列2所示的长链非编码rna。
22.上述生物材料中，b2)所述的含有编码mtcir2的核酸分子的表达盒(mtcir2基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达mtcir2的dna，该dna不但可包括启动mtcir2基因转录的启动子，还可包括终止mtcir2基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35s；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("lap",chao等人(1999)plant physiology 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(pr1)(由水杨酸和bth(苯并噻二唑-7-硫代羟酸s-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂ii启动子(pin2)或lap启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pf128(cn101063139b(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(beachy等人(1985)embo j.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子、豌豆rbcs e9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：odell等人(i
985
)nature313:810；rosenberg等人(1987)gene,56:125；guerineau等人(1991)mol.gen.genet,262:141；proudfoot(1991)cell,64:671；sanfacon等人genes dev.,5:141；mogen等人(1990)plant cell,2:1261；munroe等人(1990)gene,91:151；ballad等人(1989)nucleic acids res.17:7891；joshi等人(1987)nucleic acid res.,15:9627)。
23.可用现有的植物表达载体构建含有所述mtcir2基因表达盒的重组表达载体。所述
植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pmdc32等。
24.上述生物材料中，所述重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。
25.为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种提高植物可溶性糖含量的方法。
26.本发明所提供的一种提高植物可溶性糖含量的方法，包括提高目的植物中所述长链非编码rna或其基因的表达量，得到高可溶性糖含量植物；所述高可溶性糖含量植物的可溶性糖含量高于所述目的植物的可溶性糖含量。
27.上述方法中，所述提高目的植物中所述长链非编码rna或其基因的表达量可通过将所述长链非编码rna的基因导入所述目的植物实现的。
28.所述长链非编码rna的基因可通过使用ti质粒，植物病毒栽体，直接dna转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(weissbach,1998，method for plantmolecularbiology viii,academy press,new york,pp.411-463；geiserson and corey,1998,plantmolecular biology(2nd edition)。
29.上述方法中，所述高可溶性糖含量植物可为转基因植物，也可为通过杂交等常规育种技术获得的植物。
30.上文中，所述植物和所述目的植物均为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体为豆科植物(如苜蓿，具体可为蒺藜苜蓿、紫花苜蓿、黄花苜蓿)或十字花科植物(如拟南芥)。
31.为了解决上述技术问题，本发明还提供了植物试剂。
32.本发明所提供的植物试剂含有所述长链非编码rna或/和所述长链非编码rna相关的生物材料。所示植物试剂用于提高植物可溶性糖含量。
33.上述植物试剂的活性成分可为所述长链非编码rna或所述长链非编码rna相关的生物材料，上述植物试剂的活性成分还可含有其他生物成分或/和非生物成分，上述药剂的其他活性成分本领域技术人员可根据植物可溶性糖含量调节效果确定。
34.上述长链非编码rna、或上述生物材料、或上述方法在调控植物可溶性糖含量或在制备调控植物可溶性糖含量的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
35.将mtcir2基因导入蒺藜苜蓿r108，紫花苜蓿和黄花苜蓿以及拟南芥col-0的转基因实验证明，表达mtcir2基因的转基因植物与受体植物相比，可溶性糖含量显著提高，说明mtcir2基因是与植物可溶性糖含量相关的基因，长链非编码rna mtcir2及其编码基因可用于提高植物可溶性糖含量。
附图说明
36.图1为本发明实施例1中对mtcir2基因转基因材料基因表达鉴定结果。a.蒺藜苜蓿野生型和转基因材料中mtcir2基因表达。b.紫花苜蓿野生型和转基因材料中mtcir2表达。c.黄花苜蓿野生型和转基因材料中mtcir2基因表达。d.拟南芥野生型和转基因材料中mtcir2基因表达。
37.图2为本发明实施例2中mtcir2基因对蒺藜苜蓿可溶性糖含量的调节结果图。图中所示数据为平均值
±
标准差，重复数为3，以one-way anova分析各组显著性差异，***代表显著性分析结果为p《0.001。其中，r108为野生型蒺藜苜蓿r108，mtcir2-1-3和mtcir2-8为超表达mtcir2基因的转基因蒺藜苜蓿。
38.图3为本发明实施例2中mtcir2基因对紫花苜蓿可溶性糖含量的调节结果图。图中所示数据为平均值
±
标准差，重复数为3，以one-way anova分析各组显著性差异，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。其中，wt为野生型紫花苜蓿，mtcir2-6和mtcir2-11为超表达mtcir2基因的转基因紫花苜蓿。
39.图4为本发明实施例2中mtcir2基因对黄花苜蓿可溶性糖含量的调节结果图。图中所示数据为平均值
±
标准差，重复数为3，以one-way anova分析各组显著性差异，**代表显著性分析结果为p《0.01，***代表显著性分析结果为p《0.001。其中，wt为野生型黄花苜蓿，mtcir2-1和mtcir2-3为超表达mtcir2基因的转基因黄花苜蓿。
40.图5为本发明实施例2中mtcir2基因对拟南芥可溶性糖含量的调节结果图。图中所示数据为平均值
±
标准差，重复数为3，以one-way anova分析各组显著性差异，*代表显著性分析结果为p＜0.05。其中，col-0为野生型拟南芥，mtcir2-5和mtcir2-12为超表达mtcir2基因的转基因拟南芥。
具体实施方式
41.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
42.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
43.下述实施例中的液体yeb培养基的配制方法为(以1l为例)：将5g牛肉粉、1g酵母膏(yeast extract)、5g胰蛋白胨(tryptone)、5g蔗糖和0.5g mgso4
·
7h2o溶解于水，定容至1l，调ph7.0，高压蒸汽灭菌(121℃，15分钟)后，即得到液体yeb培养基。
44.下述实施例中的固体yeb培养基的配制方法为：在液体yeb培养基中加入0.8％(m/v)的琼脂粉，高压蒸汽灭菌(121℃，15分钟)后，即得到固体yeb培养基。
45.下述实施例中的含有50μg/ml羧苄青霉素的固体yeb培养基的配制方法为：以液体yeb培养基为基础培养基，在该基础培养基中添加琼脂粉，琼脂粉浓度为0.8％(m/v)，高压蒸汽灭菌(121℃，15分钟)后，冷却至60℃以下，在该基础培养基中添加羧苄青霉素(carbenicillin,cb)，使得羧苄青霉素在培养基中的浓度为50μg/ml，即得到含有50μg/ml羧苄青霉素的固体yeb培养基。
46.下述实施例中的含有50μg/ml羧苄青霉素的液体yeb培养基的配制方法为：以液体yeb培养基为基础培养基，高压蒸汽灭菌(121℃，15分钟)后，冷却至60℃以下，在该基础培养基中添加羧苄青霉素(carbenicillin,cb)，使得羧苄青霉素在培养基中的浓度为50μg/ml，即得到含有50μg/ml羧苄青霉素的液体yeb培养基。
47.下述实施例中的含有50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml硫酸卡纳霉素的液体yeb培养基的配制方法为：以液体yeb培养基为基础培养基，高压蒸汽灭菌(121℃，15分钟)后，冷却至60℃以下，在该基础培养基中添加羧苄青霉素(carbenicillin,cb)和硫酸卡纳霉素(kanamycin monosulfate,kan)，使得在培养基中羧苄青霉素的浓度为50μg/ml，硫酸卡纳霉素的浓度为50μg/ml，即得到含有50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml硫酸卡纳霉素的液体yeb
medicagotruncatulaand medicagofalcatato freezing.planta 2011,234:445-457”，公众可以从中国科学院植物研究所(即申请人)处获得，以重复本技术实验，不可作为其它用途使用。
56.下述实施例中涉及定量检测的，实验重复三次，结果取平均值。
57.实施例1、mtcir2基因的研究
58.为了能从非编码rna的水平揭示苜蓿代谢的分子基础，发明人利用高通量测序技术和生物信息学分析手段，对蒺藜苜蓿lncrna进行鉴定。发现苜蓿的lncrna mtcir2基因具有促进植物可溶性糖合成的功能。
59.1、mtcir2表达载体的构建
60.1.1 mtcir2基因的克隆
61.采用ctab法，提取蒺藜苜蓿野生型的基因组dna。
62.以蒺藜苜蓿野生型的dna为模板，用takara公司primehsdna聚合酶进行mtcir2基因扩增。mtcir2基因(核苷酸序列如序列表中序列1所示，编码序列如序列表中序列2所示的长链非编码rna)扩增引物如下：
63.正向引物(forward primer)：5
′‑
tcggcgcgccaggcataattgtccctctc-3
′
(下划线指示的序列为asci酶识别位点序列)；
64.反向引物(reverse primer)：5
′‑
gttaattaatctgtcacttggtttcaaaattt-3
′
(下划线指示的序列为paci酶识别位点序列)。
65.反应体系见表1：
66.表1
[0067][0068][0069]
反应条件为：95℃10分钟；[95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒]
×
30个循环；72℃延伸，10分钟；4℃停止。
[0070]
得到的pcr产物即扩增得到的mtcir2基因，用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收。
[0071]
1.2产物末端加a
[0072]
步骤1.1回收的pcr产物，取适量产物加a。反应体系见表2：
[0073]
表2
[0074][0075]
得到加a产物(即末端加a的mtcir2基因)。
[0076]
1.3载体连接
[0077]
用天根生化公司的试剂盒(货号ct301-01)中的载体和t4dna链接酶，按照内置说明书中的操作步骤进行质粒酶切回收，产物洗脱时，用65℃温育的ddh2o，取2μl产物，琼脂糖凝胶电泳鉴定质量，得到线性化的载体。
[0078]
按照表3的体系，将步骤1.2所的加a产物和上述线性化的载体进行连接。
[0079]
表3
[0080][0081]
体系中线性化的载体与加a产物的摩尔比一般要求1:7，具体可根据说明书中所述优化条件，提高连接效率。
[0082]
以上述体系连接得到连接产物。
[0083]
1.4连接产物转化大肠杆菌并鉴定
[0084]
1)取50μl冰上融化的大肠杆菌trans1-t1感受态细胞(天根生化公司,货号lot#o2461012)，加入步骤1.3中的连接产物，轻轻混匀，在冰浴中放置30分钟。
[0085]
2)42℃水浴热激30s，然后迅速将离心管转移到冰上，冰浴2分钟。
[0086]
3)向每个离心管中加入500μl无菌的yeb培养基，混匀，置于摇床中，37℃，200转/分钟恢复1小时。
[0087]
4)梯度吸取不同体积的步骤3)得到的已转化菌液，涂布在含有50μg/ml羧苄青霉素的固体yeb培养基上，在超净台中，将培养基表面的菌液吹干后，置于37℃培养箱中，倒置过夜培养。
[0088]
5)次日挑取单克隆，加入含有50μg/ml羧苄青霉素的液体yeb培养基中，37℃，200转/分钟，震荡3小时后，进行菌液pcr鉴定。选取阳性克隆，送去基因公司测序，测序正确(含有序列表序列1的核苷酸序列)的菌液加入15％的甘油后保存于-80℃，即为转化得到的t载体菌液。
[0089]
1.5表达载体构建
[0090]
1)将步骤1.4中保存的转化得到的t载体菌液和pmdc32菌液提取质粒，具体提取质粒的方法均如下：
[0091]
将菌液加入含有50μg/ml羧苄青霉素和50μg/ml硫酸卡纳霉素的液体yeb培养基中，37℃，220转/分钟，过夜震荡，次日用质粒提取试剂盒提取质粒。
[0092]
从转化得到的t载体菌液提取得到的质粒为t载体。
[0093]
从pmdc32菌液提取得到的质粒为pmdc32表达载体。
[0094]
2)酶切连接
[0095]
用限制性内切酶asci和paci，对t载体和pmdc32表达载体分别进行双酶切，酶切体系见表4：
[0096]
表4
[0097][0098]
酶切完成后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳，t载体切取582bp的目标片段(称为mtcir2片段)，pmdc32表达载体切取大片段(称为pmdc32表达载体片段)，将两个片段用试剂盒回收，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳确定提取质量和浓度。用promega公司t4 dna ligase对酶切产物进行连接，连接体系见表5：
[0099]
表5
[0100]
10
×
ligasebuffer2μlt4dnaligase1μlpmdc32表达载体片段1μlmtcir2片段12μlddh2oupto20μl
[0101]
4℃或16℃过夜连接，得到重组表达载体：用mtcir2片段(核苷酸序列如序列表序列1所示)替换pmdc32载体的限制性核酸内切酶asci和paci识别位点间的片段(包括asci的识别位点和paci识别位点在内的小片段)，保持pmdc32载体的其它序列不变，得到mtcir2基因的重组表达载体，命名为pmdc32-mtcir2。
[0102]
表达载体pmdc32-mtcir2按照步骤1.4的方法，转化大肠杆菌，最后涂布在含有50μg/ml硫酸卡纳霉素的固体yeb培养基的平皿上，倒置培养。次日进行菌液pcr鉴定，选择阳性克隆进行测序，并将测序正确(含有序列表序列1的核苷酸序列)的菌液加15％甘油存于-80℃备用，即为含有pmdc32-mtcir2的大肠杆菌。
[0103]
1.6工程载体转化农杆菌eha105
[0104]
将上述1.5得到的含有pmdc32-mtcir2的大肠杆菌，按照常规方式震荡过夜后，提
取质粒，用电击法转化根癌农杆菌eha105。
[0105]
一般两天后会长出菌斑，挑单克隆进行菌液pcr验证，选取阳性克隆菌液加15％甘油后-80℃保存备用，得到含有mtcir2基因重组表达载体pmdc32-mtcir2的农杆菌，命名为eha105-pmdc32-mtcir2。
[0106]
2、农杆菌介导的植物转化
[0107]
用农杆菌介导法，将含有外源基因mtcir2表达载体的农杆菌eha105-pmdc32-mtcir2，转入蒺藜苜蓿r108，紫花苜蓿和黄花苜蓿以及拟南芥col-0。方法参考网站http://www.noble.org/medicago-handbook/中关于农杆菌转化苜蓿的方法手册：agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformation and in vitro plant regeneration ofm.truncatula。拟南芥col-0转化用花浸染法。苜蓿的转化方法具体如下：
[0108]
2.1苜蓿组织培养和转化过程中用到的培养基及其组分
[0109]
培养转化过程中用到的培养基，都是在sh培养基的基础上进行调整。sh培养基基本组分见表6，实际操作中大量元素(50
×
)、微量元素(1000
×
)、维生素(1000
×
)、铁盐(50
×
)、cacl2(50
×
)配成浓缩的母液储存备用，肌醇和蔗糖以固体的形式现配现加，然后用koh调ph5.8，最后定容。
[0110]
表6
[0111][0112]
培养过程中会用到下面几种配方的培养基：
[0113]
重悬培养基：sh培养基+as+2,4-d+bap
[0114]
共培养培养基：sh培养基+as+2,4-d+bap+0.3％植物凝胶
[0115]
诱导培养基：sh培养基+2,4-d+bap+hyg+cef+特美汀+0.3％植物凝胶
[0116]
分化培养基：sh培养基+hyg+0.8％琼脂
[0117]
生根培养基：1/2sh培养基-维生素-肌醇-蔗糖+1％琼脂
[0118]
上述几种培养基中常用激素和抗生素的工作浓度见表7：
[0119]
表7
[0120]
[0121][0122]
2.2农杆菌的培养
[0123]
蘸取预存的eha105-pmdc32-mtcir2农杆菌菌液，在含有50μg/ml硫酸卡纳霉素和100μg/ml利福平的固体yeb培养基平板上划线，保证划出单克隆。挑取单克隆用含有50μg/ml硫酸卡纳霉素和100μg/ml利福平的液体yeb培养基重悬后，菌液pcr鉴定，吸取阳性菌液，以1:100比例，在含有50μg/ml硫酸卡纳霉素的液体yeb培养基中重悬，摇床220转/分钟，培养至od600nm＝0.5，菌液离心(4000转/分钟，10分钟)后，用重悬培养基重悬至od600nm＝0.3备用，得到eha105-pmdc32-mtcir2农杆菌悬浮液。
[0124]
2.3苜蓿叶片准备
[0125]
剪取4-6周的苜蓿新鲜叶片，用75％酒精和10％naclo依次进行消毒处理，用手术刀切除叶片边缘，置入步骤2.2中准备好的eha105-pmdc32-mtcir2农杆菌悬浮液中。
[0126]
2.4共培养
[0127]
将步骤2.3中的混合液抽真空10分钟后，放入摇床，87转/分钟，浸染1小时，之后将沾有eha105-pmdc32-mtcir2农杆菌悬浮液的叶片正面向上，平铺于共培养培养基上，24℃暗处共培养3天。用无菌水清洗叶片，多次清洗尽量将菌液清洗干净，将叶片平铺于诱导培养基上，继续在24℃避光培养。
[0128]
2.5愈伤组织诱导和分化
[0129]
两周更换一次培养基，更换几次后，可以视生长情况，逐次减半头孢和特美汀的用量，一般两个月左右愈伤组织就可长成蚕豆大小。此时可将愈伤组织块转移入分化培养基，分化培养基放入温度24℃(白天)/20℃(晚上)，光照时间16小时(白天)/8小时(晚上)的无菌条件下培养，继续每两周更换一次培养基。一般在分化培养基上培养2-3周左右，愈伤组织块会出现绿点，此后的分化培养基要去掉hyg，愈伤组织会慢慢分化出叶片和根。
[0130]
2.6转基因植株的获得
[0131]
将分化较好的小苗转入盛有生根培养基的小瓶中，使其更好地分化长大为完整的转基因苗，待小苗生长比较壮硕以后，就可以将其从瓶中移出。一般先移到水培中覆膜培养一周，小苗适应外界环境后再移入蛭石中培养。
[0132]
2.7转基因植株的鉴定
[0133]
在rna水平上对步骤2.6获得的小苗中mtcir2表达水平进行鉴定。
[0134]
trizol法提取植物rna：
[0135]
(1)将新鲜且成熟的植物材料和一粒钢珠放入1.5ml离心管中，盖好盖子，液氮速冻，使用全自动研磨仪研磨2min。
[0136]
(2)加入1ml trizol，涡旋震荡，使植物样品充分溶解，室温放置10min。
[0137]
(3)加入200μl氯仿，剧烈震荡充分混匀，室温下静置2min。
[0138]
(4)4℃，12000rpm离心10min。
[0139]
(5)吸取上清液转移至新的离心管中(此过程要轻柔，避免吸取沉淀)。
[0140]
(6)向离心管中加入500μl异丙醇，迅速混匀，动作要轻柔，室温下静置10min。
[0141]
(7)4℃，12000rpm离心10min，弃上清。
[0142]
(8)加入500μl 75％乙醇清洗沉淀。
[0143]
(9)4℃，7500rpm离心2min。重复操作1次。
[0144]
(10)弃上清，用移液枪吸取残余乙醇(此过程避免吸取到沉淀)，吹干沉淀，加入50μl rnase-free h2o溶解，于-80℃保存。
[0145]
(11)使用反转录试剂盒(accurate biotechnology(hunan)co.ltd公司,货号ag11711)_rna反转录为cdna，操作时使用1.5ml rnase-free离心管以及rnase-free的枪头，在冰上迅速进行。
[0146]
(11-1)对提取的rna进行dna酶消化处理，体系如下：
[0147][0148]
4℃离心5s混匀，42℃水浴2min后，迅速转移到冰上。
[0149]
(11-2)向另外的离心管中加入反转录酶，体系如下：
[0150][0151]
与步骤(11-1)所得反应液混合混匀，37℃水浴30min后，85℃水浴5s，在冰上冷却。将得到的cdna于-20℃保存。
[0152]
cdna水平鉴定，是进行mtcir2全基因的扩增，引物序列如下：
[0153]
正向引物：5
′‑
aggcataattgtccctctc-3
′
；
[0154]
反向引物：5
′‑
tctgtcacttggtttcaaaattt-3
′
。
[0155]
以野生型蒺藜苜蓿为受体植物的一组转基因植物及其受体对照用mtactin11做内参，mtactin11扩增引物：
[0156]
正向引物(forward primer)：5
′‑
acgagcgtttcagatg-3
′
；
[0157]
反向引物(reverse primer)：5
′‑
acctccgatccagaca-3
′
。
[0158]
以紫花苜蓿、黄花苜蓿以及拟南芥col-0作为受体植物的转基因植物及其受体对照不设置内参。
[0159]
反应体系见表8:
[0160]
表8
[0161]5×
prime startm buffer10μldntp mixture(2.5mm)4μlforward primer(10μm)2μlreverse primer(10μm)2μlprime startm hs dna polymerase(2.5u/μl)0.5μl
template cdna1μlddh2oup to 50μl
[0162]
反应条件为：95℃10分钟；[95℃30秒，55℃30秒，72℃60秒]
×
30个循环；72℃延伸，10分钟；4℃停止。
[0163]
电泳结果如图1，筛选mtcir2基因表达量显著提升的小苗为转基因植株。筛选得到的具体转基因植物如下：
[0164]
以野生型蒺藜苜蓿r108为受体植物，转入mtcir2基因得到的t0代转基因植物2株，分别命名为mtcir2-1-3和mtcir2-8。
[0165]
以野生型紫花苜蓿为受体植物，转入mtcir2基因得到的t0代转基因植物2株，分别命名为mtcir2-6和mtcir2-11。
[0166]
以野生型黄花苜蓿为受体植物，转入mtcir2基因得到的t0代转基因植物2株，分别命名为mtcir2-1和mtcir2-3。
[0167]
以野生型拟南芥col-0为受体植物，转入mtcir2基因得到的t0代转基因植物3株，分别命名为mtcir2-5，mtcir2-11和mtcir2-12。
[0168]
实施例2、mtcir2基因在调控植物可溶性糖合成的应用
[0169]
将实施例1中得到的蒺藜苜蓿组和拟南芥组各t0代转基因植物均进行自交，分别得到t3代株系。对得到的t3代株系及相应野生型株系进行可溶性糖含量的测定。将实施例1中得到的紫花苜蓿组和黄花苜蓿组进行扦插繁殖，对得到的扦插繁殖苗及相应野生型株系进行可溶性糖含量的测定。具体分组如下：
[0170]
蒺藜苜蓿组：mtcir2-1-3、mtcir2-8及相应野生型蒺藜苜蓿r108，每个株系各10株。
[0171]
紫花苜蓿组：mtcir2-6、mtcir2-11及相应野生型紫花苜蓿，每个株系各10株。
[0172]
黄花苜蓿组：mtcir2-1、mtcir2-3及相应野生型黄花苜蓿，每个株系各10株。
[0173]
拟南芥组：mtcir2-5、mtcir2-12及相应野生型拟南芥col-0，每个株系各10株。
[0174]
可溶性糖含量的测定方法如下：
[0175]
从30d苗龄的植株上剪下叶片，称取0.5～1g植物鲜样，剪碎，将全部材料置于大试管中，加入15ml的蒸馏水，盖盖。试管在沸水浴中煮沸20min，取出后静置至室温，过滤定容至100ml(待测液)。取待测液1ml于试管中，加入5ml蒽酮试剂，充分振荡混匀，煮沸10min。取出后冷却至室温，在620nm波长下测定光吸收值(od)，使用蒸馏水1ml与5ml蒽酮试剂充分混匀，沸水浴10min后冷却的溶液作为对照组。用葡萄糖制作标准曲线。
[0176]
各组的测定结果见图2(蒺藜苜蓿组)、图3(紫花苜蓿组)、图4(黄花苜蓿组)和图5(拟南芥组)。结果发现，各组mtcir2基因的转基因植物的可溶性糖含量均显著高于受体野生植物，具体如下：
[0177]
蒺藜苜蓿组：mtcir2-1-3和mtcir2-1-3中可溶性糖含量分别是野生型蒺藜苜蓿r108的1.567和1.443倍。
[0178]
紫花苜蓿组：mtcir2-6和mtcir2-11中可溶性糖含量分别是野生型紫花苜蓿的1.402和1.396倍。
[0179]
黄花苜蓿组：mtcir2-1和mtcir2-3中可溶性糖含量分别是野生型黄花苜蓿的1.513和1.397倍。
[0180]
拟南芥组：mtcir2-5和mtcir2-12中可溶性糖含量分别是野生型拟南芥的1.475和1.409倍。
[0181]
综上所述，本发明提供了正向调控可溶性糖含量的mtcir2基因，超表达或异源表达mtcir2基因可提高植物的可溶性糖含量。
[0182]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.长链非编码rna，其特征在于：是如下a1)或a2)的长链非编码rna：a1)核苷酸序列是序列表中序列2的长链非编码rna；a2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的长链非编码rna具有90％以上的同一性且与植物可溶性糖含量相关的长链非编码rna。2.与权利要求1所述长链非编码rna相关的生物材料，其特征在于：为下述b1)至b5)中的任一种：b1)权利要求1所述长链非编码rna的基因；b2)含有b1)所述基因的表达盒；b3)含有b1)所述基因的重组载体、或含有b1)所述表达盒的重组载体；b4)含有b1)所述基因的重组微生物、或含有b2)所述表达盒的重组微生物、或含有b3)所述重组载体的重组微生物；b5)含有b1)所述基因的转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：b1)所述基因为核苷酸序列是序列表中序列1的dna分子。4.一种提高植物可溶性糖含量的方法，其特征在于：包括提高目的植物中所述长链非编码rna或其基因的表达量，得到高可溶性糖含量植物；所述高可溶性糖含量植物的可溶性糖含量高于所述目的植物的可溶性糖含量。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述植物和所述目的植物均为双子叶植物。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为豆科植物或十字花科植物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述豆科植物为苜蓿，所述十字花科植物为拟南芥。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述苜蓿为蒺藜苜蓿、紫花苜蓿或黄花苜蓿。9.植物试剂，其特征在于：所述植物试剂含有权利要求1所述的长链非编码rna或/和权利要求2-3任一所述长链非编码rna相关的生物材料。10.权利要求1所述长链非编码rna、或权利要求2-3任一所述生物材料、或权利要求4-8所述方法在调控植物可溶性糖含量或在制备调控植物可溶性糖含量的产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种名为MtCIR2的长链非编码RNA，是如下A1)或A2)的长链非编码RNA：A1)核苷酸序列是序列表中序列2的长链非编码RNA；A2)将序列表中序列2所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的长链非编码RNA具有90％以上的同一性且与植物可溶性糖含量相关的长链非编码RNA。将MtCIR2基因导入蒺藜苜蓿R108，紫花苜蓿和黄花苜蓿以及拟南芥col-0的转基因实验证明，表达MtCIR2基因的转基因植物与受体植物相比，可溶性糖含量显著提高，说明MtCIR2基因是与植物可溶性糖含量相关的基因。是与植物可溶性糖含量相关的基因。是与植物可溶性糖含量相关的基因。


技术研发人员：张文浩 赵敏桂 任立飞 田睿 孙晓涵
受保护的技术使用者：中国科学院植物研究所
技术研发日：2021.11.30
技术公布日：2022/3/8