一种解淀粉芽孢杆菌及其在酱油发酵中的应用的制作方法

1.本发明涉及食品酿造工艺领域，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌及其在酱油发酵中的应用。


背景技术：

2.氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素含量，氨基酸态氮含量直接反应酱油鲜味程度，氨基酸态氮含量越高酱油越鲜。目前，市场上非零添加酱油氨基酸生成率普遍在50-60％，这就造成了非零添加酱油产品鲜味不足。为了解决酱油鲜味问题，很多厂家都采取外加谷氨酸钠或者酵母抽提物等方式进行提鲜。但是，外加方式改边了酱油原有风味特点，通过发酵手段提升酱油氨基酸转化率更为可行。酱油氨基酸转化率的高低跟酱油曲料中的氨肽酶活力有直接关系，氨肽酶具有强力的将多肽分解为氨基酸的能力，能够从多肽链n端依次将氨基酸水解，使氨基酸逐个游离出来。
3.国内酱油目前主要采用高盐稀态发酵和低盐固态发酵两种方式，但是这两种方式均未见氨基酸生成率超过65％的报道。


技术实现要素：

4.为了解决以上问题，本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌及其在酱油发酵中的应用，筛选出氨肽酶活性较高的菌株，并用这样的菌株进行发酵用于酱油制备，显著提升了酱油的氨基酸生成率，提高了酱油品质，改善了酱油口感。
5.本发明通过下述技术方案实现：
6.本发明的第一个目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)为yb-18，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22582。
7.优选地，所述解淀粉芽孢杆菌yb-18在高盐度下的氨肽酶活力为403u/ml～487u/ml。
8.优选地，所述高盐度为盐度值为14％-18％。
9.本发明的第二个目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌的应用，用于酱油发酵，酱油中氨基酸的生成率为67.5％～73.0％。
10.优选地，在酱油发酵过程中按照10
2-104个/g曲料的比例接种解淀粉芽孢杆菌yb-18进行发酵。
11.优选地，包括如下步骤：
12.(1)种子液的制备：解淀粉芽孢杆菌yb-18在种子培养基中培养获得种子液；
13.(2)扩大培养：将解淀粉芽孢杆菌yb-18种子液按照10
2-104个/g曲的接种量接种到酱油曲中，恒温制曲，获得酱油成曲；
14.(3)将步骤(2)中获得的酱油成曲中拌入盐水，恒温发酵。
15.优选地，所述种子培养基包含如下质量分数的各成分：酱油原油10-15％、葡萄糖
3-6％，食用盐1-2％，其余为水。
16.优选地，所述步骤(1)中在种子培养基中培养24-30h获得种子液。
17.优选地，所述步骤(2)中在30℃恒温制曲38-45h。
18.优选地，所述盐水的质量浓度为22-23％，所述酱油成曲与所述盐水的质量/体积比为1:1.8-1:2.0，所述步骤(3)中在30℃下发酵3-6个月。
19.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
20.本发明实施例提供的解淀粉芽孢杆菌yb-18在高盐环境下具有较高的氨肽酶活力，高达487u/ml，将酱油中的多肽物质更多的转化为游离氨基酸，相较于现有的用于制备酱油的菌株在高盐环境下的氨肽酶活力更高(现有酱油成曲中氨肽酶活力不超过20u/g)。将解淀粉芽孢杆菌yb-18用于生产高氨基酸生成率的酱油，酱油中氨基酸生成率达到高达73％，16种氨基酸浓度总和高达91.74g/l，酱油味道醇厚、鲜味突出，为鲜味原酿酱油的生产提供新的途径。
附图说明
21.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
22.图1为本发明实施例提供的一种解淀粉芽孢杆菌yb-18的菌落形态图。
具体实施方式
23.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
24.国内酱油目前主要采用高盐稀态发酵和低盐固态发酵两种方式，但是这两种方式均未见氨基酸生成率超过65％的报道。而氨基酸的生成率低会影响酱油口感。
25.为了解决以上问题，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)为yb-18，保藏日期为2021年5月24日，保藏编号为cgmcc no.22582，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
26.进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌yb-18在高盐度下的氨肽酶活力为403u/ml～487u/ml。其中高盐度环境的盐度值为14-18％。
27.本发明的解淀粉芽孢杆菌yb-18菌株具有以下特征：
28.(1)菌株的形态特征：解淀粉芽孢杆菌yb-18在平板上呈脏白色，菌落边缘不规整，菌落表面呈褶皱状隆起，在显微镜下杆状，具体见附图1；
29.(2)菌株的部分生理生化特征：解淀粉芽孢杆菌yb-18能够利用葡萄糖、果糖、乳糖、阿拉伯糖以及蔗糖，菌株具备高产氨肽酶能力，菌株最适生长温度为37℃。
30.本发明的解淀粉芽孢杆菌yb-18(cgmcc no.22582)是从酱醪中筛选获得，具体的选育步骤为：
31.1)、取20g酱油曲，研磨，然后按照一定比例稀释；
32.2)、吸取1)步中的稀释液，然后均匀涂布到选择性筛选培养基中；
33.3)、挑取生长良好、水解圈相对较大的菌落，接种到斜面培养基；
34.4)、将3)步中的菌落接种到液体培养基中，然后测定不同菌株的氨肽酶活力，从中选出酶活力最高的菌株。
35.步骤2)中的选择性培养基包含l-亮氨酸-4-硝基苯胺0.01-0.05g/l，葡萄糖20-40g/l，酵母粉2-6g/l，蛋白胨2-6g/l，琼脂粉15-20g/l。
36.步骤4)中液体培养基包含玉米浆10-30g/l，麸皮20-60g/l，mgso4·
7h2o 0.1-0.5g/l，kh2po
4 2-10g/l，cacl
2 0.2-1g/l，液体培养基的ph值为6.3-6.8。
37.将以上选育得到的菌株用于酱油的发酵，酱油中氨基酸的生成率为67.5％～73.0％。
38.进一步地，在酱油发酵过程中按照10
2-104个/g曲料的比例接种解淀粉芽孢杆菌yb-18进行发酵。
39.进一步地，包括如下步骤：
40.(1)种子液的制备：解淀粉芽孢杆菌yb-18在种子培养基中培养获得种子液；
41.(2)扩大培养：将解淀粉芽孢杆菌yb-18种子液按照10
2-104个/g曲的接种量接种到酱油曲中，恒温制曲，获得酱油成曲；
42.(3)将步骤(2)中获得的酱油成曲中拌入盐水，恒温发酵。
43.进一步地，
44.所述种子培养基包含如下质量分数的各成分：酱油原油10-15％、葡萄糖3-6％，食用盐1-2％。优选地，酱油原油为所含氨氮的质量体积浓度为1.0g/100ml的酱油原油。
45.进一步地，
46.所述步骤(1)中在种子培养基中培养24-30h获得种子液；
47.进一步地，所述步骤(2)中在30℃恒温制曲38-45h。
48.进一步地，所述盐水的质量浓度为22-23％，所述酱油成曲与所述盐水的质量/体积比为1:1.8-1:2.0，所述步骤(3)中在30℃下发酵3-6个月。
49.进一步地，将所述步骤(3)中恒温发酵后得到的酱油原油中氨基酸态氮含量为1.16g/100ml，全氮含量为1.60g/100ml。
50.本发明得到的解淀粉芽孢杆菌yb-18在高盐环境下(盐度值为14％-18％)具有较高的氨肽酶活力，能够将酱油中的多肽物质更多的转化为游离氨基酸。将解淀粉芽孢杆菌yb-18用于生产高氨基酸生成率的酱油，酱油中氨基酸生成率达到高达73％，16种氨基酸浓度总和高达91.74g/l，酱油味道醇厚、鲜味突出，为鲜味原酿酱油的生产提供新的途径。
51.实施例1：
52.高氨肽酶菌株的筛选
53.取20g酱油曲，研磨，然后加入一定量的无菌生理盐水按照比例稀释，分别稀释到10-1
、10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
浓度。
54.取0.1ml的稀释液均匀涂布到选择性培养基中，37℃培养1-2天。在培养过程中观察菌落生长情况，透明圈形成的快慢和大小，并测量圈径比。根据上述方法，共筛选出156株透明圈较为明显的菌落，其中特别显著的有35株菌。
55.将35株较为显著的菌落接种到lb斜面培养基中，37℃培养2-3天，分别编号yb1-yb35。
56.选择性培养基包含l-亮氨酸-4-硝基苯胺0.02g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉3g/l，蛋白胨3g/l，琼脂粉15-20g/l。
57.实施例2
58.高氨肽酶解淀粉芽孢杆菌yb-18的选育
59.将获得的35株特别显著的菌株接种到液体培养基中，37℃培养3天，液体培养基组分为玉米浆10g/l，麸皮30g/l，mgso4·
7h2o 0.2g/l，kh2po
4 4g/l，cacl
2 0.5g/l，液体培养基的ph为6.5。
60.培养结束后测定每个菌株的氨肽酶活力，氨肽酶的测定方法为：将发酵滤液稀释数倍，取稀释液0.4ml加入6ml ph值为8.0的tris-hcl缓冲液中，40℃下水浴预热5min，再加0.4ml 26mm l-亮氨酸-4-硝基苯胺乙醇溶液(对照加蒸馏水)，反应10min后，立即放入冰浴中，5min后于波长为405nm处比色。在40℃、ph值为8.0条件下，每分钟水解生成1μgp-na所需的酶量定义为一个酶活单位。
61.将氨肽酶酶活力相对较高的6个菌株再次进行液体发酵实验复测氨肽酶活力，氨肽酶含量如表1所示，其中yb-18的氨肽酶含量最高，达到487u/ml。将氨肽酶含量最高的菌株yb-18测定其16s序列，经ncbi数据库进行序列比对，确定其为解淀粉芽孢杆菌。
62.表1筛选出的6株菌株氨肽酶酶活
63.菌株编号氨肽酶活力(u/ml)yb-3217yb-8263yb-13308yb-18487yb-23321yb-31189
64.在发酵结束后的液体培养基中加入质量浓度为16％的nacl溶液，静置2天后再次测定上述6株菌的氨肽酶酶活，结果如表2所示。从表2中可知，yb-18菌株产生氨肽酶的耐盐性能较好，在16％的盐度下保持两天，其氨肽酶活力只有轻微下降，依旧达到403u/ml。
65.表2筛选出的6株菌株在高盐条件下氨肽酶酶活
66.菌株编号氨肽酶活力(u/ml)yb-337yb-813yb-1378yb-18403yb-23136yb-3184
67.实施例3
68.本实施例考察解淀粉芽孢杆菌yb-18的不同接种时间对酱油氨基酸生成率的影响
69.(1)种子培养基(含质量分数为10％的酱油原油、4％的葡萄糖、1.5％的食用盐，其余用水补足，其中酱油原油中氨氮含量为1.0g/100ml)在121℃灭菌20min，待冷却后接入解淀粉芽孢杆菌yb-18，通气量1.5v/v
·
min、30℃，培养时间为28h。
70.(2)将大豆和小麦按照7：3混合制曲，接种沪酿3.042米曲霉，然后在制曲0h或8h或16h或24h或30h接种解淀粉芽孢杆菌yb-18菌株，接种量为102个/g曲料，30℃恒温制曲42h；
71.(3)经42h制备好的曲料和22％的盐水按照1：1.8混匀；
72.(4)30℃恒温培养直至总发酵时间达到6个月；
73.(5)将(4)步中的酱醪经压榨、灭菌、过滤、分装等工序获得成品酱油。
74.对不同接种时间准备得到的成品酱油进行品质研究，测定氨氮含量、全氮含量，计算氨基酸生成率。
75.具体地，氨氮含量与全氮含量的测试方法参照gb 18186-2000，16种氨基酸测定方法参照gb 5009.124-2016。
76.结果如下表3。
77.表3解淀粉芽孢杆菌yb-18不同接种时间对酱油品质的影响
[0078][0079]
从表3中可知，接种了解淀粉芽孢杆菌yb-18的酱油较未接种的氨基酸生成率明显提高，氨氮含量也更高，并且在制曲的第8h接种解淀粉芽孢杆菌yb-18时的氨基酸生成率最高，达到72.50％，同时氨氮含量达到1.16g/100ml，较对照提高了28.89％，总氨基酸含量也较对照提高了26.77％。
[0080]
实施例4
[0081]
本实施例考察解淀粉芽孢杆菌yb-18不同接种量对酱油氨基酸生成率的影响
[0082]
制备过程同实施例3，yb-18接种时间为制曲开始后的第8h，接种量为102或103或104或105个/g曲料，得到的酱油氨氮含量及氨基酸生成率结果如表4所示。从表4中可知，接种量为102个/g曲料时所得酱油的氨氮含量和氨基酸生成率最高，增加yb-18的接种量导致氨氮、氨基酸生成率的下降，这可能是芽孢杆菌在曲料中过度繁殖消耗了曲料中的蛋白质，从而降低了酱油的氨基酸生成率和总氨基酸含量。
[0083]
表4解淀粉芽孢杆菌yb-18不同接种量对酱油品质的影响
[0084]
[0085][0086]
本发明中未提及的过程或方法均是采用现有技术，在此不进行详述。
[0087]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)为yb-18，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.22582。2.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌yb-18在高盐度下的氨肽酶活力为403u/ml～487u/ml。3.根据权利要求2所述的一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述高盐度为盐度值为14％-18％。4.解淀粉芽孢杆菌yb-18在酱油发酵中的应用，其特征在于，酱油中氨基酸的生成率为67.5％～73.0％。5.根据权利要求4所述的一种解淀粉芽孢杆菌yb-18在酱油发酵中的应用，其特征在于：在酱油发酵过程中按照10
2-104个/g曲料的比例接种解淀粉芽孢杆菌yb-18进行发酵。6.根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌yb-18在酱油发酵中的应用，其特征在于：包括如下步骤：(1)种子液的制备：解淀粉芽孢杆菌yb-18在种子培养基中培养获得种子液；(2)扩大培养：将解淀粉芽孢杆菌yb-18种子液按照10
2-104个/g曲的接种量接种到酱油曲中，恒温制曲，获得酱油成曲；(3)将步骤(2)中获得的酱油成曲中拌入盐水，恒温发酵。7.根据权利要求6所述的一种解淀粉芽孢杆菌yb-18在酱油发酵中的应用，其特征在于：所述种子培养基包含如下质量分数的各成分：酱油原油10-15％、葡萄糖3-6％，食用盐1-2％，其余为水。8.根据权利要求6所述的一种解淀粉芽孢杆菌yb-18在酱油发酵中的应用，其特征在于：所述步骤(1)中在种子培养基中培养24-30h获得种子液。9.根据权利要求6所述的一种解淀粉芽孢杆菌yb-18在酱油发酵中的应用，其特征在于：所述步骤(2)中在30℃恒温制曲38-45h。10.根据权利要求6所述的一种解淀粉芽孢杆菌yb-18在酱油发酵中的应用，其特征在于：所述盐水的质量浓度为22-23％，所述酱油成曲与所述盐水的质量/体积比为1:1.8-1:2.0，所述步骤(3)中在30℃下发酵3-6个月。

技术总结
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌及其在及酱油发酵中的应用，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为YB-18，保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22582。本发明的解淀粉芽孢杆菌YB-18在高盐环境下具有较高的氨肽酶活力，可将酱油中的多肽物质更多的转化为游离氨基酸。将解淀粉芽孢杆菌YB-18用于生产高氨基酸生成率的酱油，酱油中氨基酸生成率达到高达73％，酱油味道醇厚、鲜味突出，为鲜味原酿酱油的生产提供新的途径。的生产提供新的途径。的生产提供新的途径。


技术研发人员：郭建 齐艳宇 李范宇 杨九 樊君 伍学明
受保护的技术使用者：千禾味业食品股份有限公司
技术研发日：2022.01.10
技术公布日：2022/3/8