一种分子马达的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于生物和高分子材料领域，涉及一种分子马达的制备方法及其应用，能量转化效率高，纯化高。并涉及制备的分子马达在化妆品领域的应用。


背景技术：

2.细胞衰老是一种主要的衰老过程，其特征是不可逆的生长停滞、细胞凋亡抵抗、衰老相关分泌表型(sasp)的产生、线粒体功能障碍以及dna和染色质的改变。细胞衰老可以分为急性衰老，比如防止创伤部位过渡纤维化；慢性衰老，比如机体应激反应造成的持久性的大分子损伤(蛋白错误折叠、dna损伤、观遗传改变、端粒缩短等等)；治疗性衰老，比如放疗、化疗引起的正常细胞损伤导致的机体应激反应。
3.细胞衰老的多个诱导方式，包括dna损伤，活性代谢物，炎症，癌基因，促细胞分裂原，蛋白毒性应激和损伤相关的分子模式。其中：
4.1)dna损伤反应(ddr)是诱导细胞衰老的核心。ddr可由端粒缩短或功能障碍、突变、辐射和烷化剂引起。
5.2)活性代谢物升高，包括活性氧、脂肪酸、葡萄糖和神经酰胺。
6.3)蛋白质聚集、未折叠蛋白质反应和mtor激活与蛋白质毒性应激和蛋白质稳态丧失有关。
7.这些诱导剂最终通过会聚于激活p16ink4a/rb和/或p53/p21的途径的机制介导细胞衰老表型，具体取决于诱导剂和细胞类型。
8.生长因子通常被认为是细胞因子的一个子集，是刺激细胞生长、分化、存活、炎症和组织修复的信号蛋白。它们可以由邻近的细胞、组织、腺体，甚至癌细胞分泌。所有的细胞都需要一系列的生长因子来维持增殖和生存能力，刺激表皮、上皮细胞和胚胎细胞的增殖，促进创面愈合、骨重建，可以减少皮肤松弛，改善皮肤弹性和紧张，并在应用于老年参与者的面部皮肤时表现出保湿和抗氧化性能。
9.分子马达，即atp合成酶，是利用跨膜电化学梯度催化合成atp的膜蛋白复合物家族，在细胞内催化能源物质atp的合成，是支持光合作用与呼吸作用的关键结构，在呼吸或光合作用过程中通过电子传递链释放的能量先转换为跨膜质子(h+)梯差，之后质子流顺质子梯差通过atp合成酶可以使adp+pi合成atp。
10.f1f
0-atpase的能量转换效率非常高，作为天然存在的纳米尺度能量转换装置，atp合成酶的催化过程是可逆的，既可水解atp，也能合成atp。atp合成酶分子在生理条件下的主要功能是合成atp。由于其工作效率远高于目前人工设计的分子马达，近年来也得到纳米科学，力学及微机电系统等研究领域的关注。在生物医药领域中，鉴于分子马达具有较高的生物学潜力，目前主要在病理学诊断和生物医药检测中用作于研究和探测有害化学物质的纳米传感器。


技术实现要素：

11.分子马达是天然来源，并且无毒，发明人通过高温菌发酵制备，首次用于对非受损皮肤的细胞衰老的影响来评价，发现其对自然老化(内源性老化)有干扰和逆转作用，具有抗衰老效应。
12.本发明的第一个目的是提供一种分子马达的制备方法，该制备方法高效，制得的分子马达更耐热，更具有高效能量转化能力，并且通过改进分子马达的制备方法，以获得更高度纯化和功能的分子马达。
13.本发明第二个目的是为了提供通过该制备方法制得的分子马达的应用，用于化妆品的紧致抗衰老，修复以及抗炎的用途。
14.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
15.一种分子马达的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
16.1)取培养后的细菌接种至培养基中再次培养；
17.2)将步骤1)再次培养得到的细菌离心收集菌体，用缓冲液a重悬菌体，多次破碎后得到细胞破碎液；
18.3)将步骤2)得到的细胞破碎液通过差速离心法和密度梯度离心法进行提取纯化，得到分子马达；
19.或者，所述制备方法包括以下步骤：
20.a)取培养后的细菌，离心收集菌体细胞；
21.b)用缓冲液b悬浮步骤a)得到的菌体细胞；
22.c)加入pmsf，冰浴超声破碎，第一次离心得到上清液，将上清液进行第二次离心，去除离心后的上清液，得到含有f1f
0-atp酶的复合体；
23.其中，步骤1)与步骤a)中所述的细菌为嗜热菌。
24.在本发明中，本发明利用差速离心法和密度梯度离心法结合，目的是为了去掉细胞碎片和细胞器，以及球蛋白等大分子杂质，以获得更高度纯化和功能的分子马达。
25.f1f
0-atp酶是当前atp酶的研究模型中抗逆性较为优秀的模型，但保持活性所需的溶液体系仍必须是含有水、多种离子、生物膜脂及膜蛋白等物质的悬浊液，其性质与制作水溶性蛋白质芯片所采用的蛋白质溶液完全不同。
26.一般的分子马达的能量转化效率60％左右，本发明制备得到的分子马达能达到100％。
27.作为本发明的一种优选方案，所述的嗜热菌包括嗜热栖热菌，嗜热玫瑰球菌，嗜热芽胞杆菌，嗜热链球菌，硫矿硫化叶菌，海栖热袍菌，火球菌中的一种，嗜热菌的接种比例为1:98-105。
28.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，所述的缓冲液a包括以下原料：0.1-0.8mol/l pbs ph8.0，0.1-20mmol/l mgcl2，0.1-5mmol/l dtt。
29.作为本发明的一种优选方案，步骤b)中，所述的缓冲液b包括以下原料：45-55mm的tricine-naoh，ph7.8-8.2，0.2-0.3m的蔗糖溶液，3-5mm的mgcl2溶液。
30.作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，差速离心法为1-6℃、600-3000
×
g下离心40分钟，取上清液以100，000-200，000
×
g，离心30-90min；密度梯度离心法为：取差速离心法得到的沉淀加入到质量百分比浓度分别为20％，30％，40％，50％，60％的蔗糖溶液，以
150，000-300，000
×
g，60-90min，1-6℃条件下超速离心，收集蔗糖溶液的质量百分比浓度为40％-50％区域的液体。
31.作为本发明的一种优选方案，步骤c)中，pmsf的终浓度为1mmol/l，超声破碎的条件为：振幅为40-60％，超声5-10s，停6-10s，时间25-35min。
32.作为本发明的一种优选方案，步骤c)中，第一次离心是在20，000
×
g下离心25-35min，第二次离心是在180，000
×
g下离心85-95min。
33.本发明第二方面提供了通过上述制备方法制得的分子马达在化妆品领域的应用。
34.作为本发明的一种优选方案，所述分子马达在制备用于紧致抗衰老的化妆品中的用途。
35.作为本发明的一种优选方案，所述分子马达可抑制mmp-1、mmp-9活性。
36.作为本发明的一种优选方案，所述分子马达可促进生长因子gdf11和tgf-β1的表达作用。
37.作为本发明的一种优选方案，所述分子马达可减少rdna拷贝数丢失，呈现对表皮和真皮组织一定的抗紫外损伤、促增殖、抗凋亡、抗衰老以及使皮肤紧致相关的作用。
38.在本发明中，通过本发明制备的分子马达具有多种作用通路，来实现紧致抗衰老的作用。
39.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
40.1)本发明的制备方法高效，制得的分子马达更耐热，更具有高效能量转化能力，并且通过改进分子马达的制备方法，以获得更高度纯化和功能的分子马达；
41.2)本发明制得的分子马达具有多种作用通路，来实现紧致抗衰老的作用，本发明的分子马达没有氧化相关的不良影响，可以抑制mmp-1、mmp-9活性，可以促进生长因子gdf11和tgf-β1的表达作用，可以抑制bax基因的表达作用以及促进bcl-2的表达作用，减少rdna拷贝数丢失，呈现对表皮和真皮组织一定的抗紫外损伤、促增殖、抗凋亡、抗衰老以及使皮肤紧致相关的作用。
附图说明
42.图1是本发明表皮组织mrna相对表达水平。
43.图2是本发明真皮组织mrna相对表达水平。
44.图3是核糖体dna和线粒体dna标准化拷贝数。
45.图4是氧化应激相关指标检测。
具体实施方式
46.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
47.实施例1
48.本实施例提供了一种分子马达的制备方法，包括：
49.1)取培养后细菌(主要是嗜热型细菌，以嗜热栖热菌为主)，菌株培养：将嗜热栖热
菌按1:100的比例接种到培养基中，继续培养48h。
50.2)破壁：发酵后在4，000rpm，30min，4℃条件下离心收集菌体；用匀浆缓冲液(0.1-0.8mol/l pbs ph8.0，0.1-20mmol/l mgcl2，0.1-5mmol/l dtt)重悬菌体，在0-6℃条件下500-1000m超高压下破碎3次，得到细胞破碎液。
51.3)采用差速离心法和密度梯度离心法进行提取纯化操作。
52.具体地，密度梯度离心法包括以下的步骤：将获得的细胞破碎液，在1-6℃、600-3000
×
g下离心40分钟，取上清液以100，000-200，000
×
g，离心30-90min，取沉淀加入到质量百分比浓度分别以20％、30％、40％、50％、60％的蔗糖溶液，以150，000-300，000
×
g，60-90min，1-6℃条件下超速离心，收集蔗糖溶液的质量百分比浓度为40％-50％区域的液体c。收集液体c，去除蔗糖，即为分子马达。
53.分子马达活性测试方法(偶联法)：核苷二磷酸(ndp)是核苷三磷酸的高能磷酸水解产物之一，丙酮酸脱氢酶(pk)和乳酸脱氢酶(ldh)是用来来测定ndp生成的常用偶联酶，反应底物是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)，并需要通过三磷酸腺苷(atp)水解来完成，通过测定nadh在340nm处光密度的减少，求出atp的水解量(酶活：atpase水解活性定义为1μl酶每分钟在37℃水解atp的量)。
54.不同糖密度下的颗粒大小对比，分子马达活性对比见表1。
55.表1不同密度梯度离心(二次)的所得分子马达的活性(atp水解)对比：
[0056][0057]
实施例2
[0058]
本实施例提供了另一种分子马达的制备方法，包括：
[0059]
取培养后细菌(主要是嗜热型细菌，以嗜热栖热菌为主)。低速离心收集菌体细胞，用50mm，tricine-naoh，ph8.0，0.25m蔗糖，4mm mgcl2的溶液悬浮，加入终浓度为1mmol/l的pmsf，冰浴超声破碎30min(振幅为55％，超声5s，停8s)超声破碎细胞，先高速(20，000g)离心30min，得到上清，然后将上清超高速(180，000g)离心90min，去上清，即得含有f1f
0-atp酶的复合体。
[0060]
实施例3
[0061]
本实施例从相关mrna表达水平中的基质金属蛋白酶、细胞衰老的相关生长因子、细胞自噬与凋亡调控相关基因影响等几个角度，分别对样品分子马达体外抗衰老功效进行了实验：
[0062]
实验选用t-skin体外人造全层皮肤模型(3d皮肤模型)，对照和分子马达样品组各半，进行受检样品即实施例1制得的分子马达原液的体外抗衰老效应评价研究。试验设对照组与分子马达组，采用表皮涂抹方式给药，每隔24小时重复涂抹1次，连续5天后，实时荧光
定量pcr检测各组皮肤模型的mmp-1、mmp-9、gdf-11、tgf-β1、bax、bcl-2、beclin-1和caspase-3mrna相对表达量，对照组与分子马达组的检测项目见表2。
[0063]
表2对照组与分子马达组mrna表达测试项目
[0064][0065]
参见图1与图2，图1是表皮组织mrna相对表达水平，*表示与对照组相比，p《0.05；**表示与对照组相比，p《0.01。
[0066]
图2是真皮组织mrna相对表达水平，*表示与对照组相比，p《0.05；**表示与对照组相比，p《0.01。
[0067]
其中：
[0068]
1)mmp-1、mmp-9的mrna表达：
[0069]
基质金属蛋白酶是导致皮肤出现皱缩、细纹等衰老症状最主要的酶。其中mmp-1与人体皮肤衰老密切相关的胶原酶，可降解真皮层中胶原蛋白及弹性蛋白。mmp-9的主要功能是与mmp-1一起降解和重塑细胞外基质。基于基质金属蛋白酶在皮肤衰老过程中的重要作用，抑制mmp-1、mmp-9活性是不少化妆品原料开发方向。
[0070]
与对照组比较，分子马达组的表皮组织中两个基质金属蛋白酶mrna相对表达量，真皮组的mmp-9mrna相对表达量，分别降低，并且差异有统计学意义，参见图1与图2，实验结果充分证明了，分子马达能在表皮层还有真皮层有效降低mmp-1和mmp-9的表达。这两种基质金属蛋白酶在光老化领域，是导致皮肤出现皱缩、细纹等衰老症状最主要的酶，与真皮层中胶原蛋白及弹性蛋白等细胞外基质的降解密切相关，抑制该种酶的活性是延缓衰老的途径。实验表明，分子马达可有效降低mmp-1和mmp-9的表达，具有较好的在化妆品上作为延缓衰老的功效。
[0071]
2)生长因子tgf-β调节：
[0072]
gdf11和tgf-β1都属于转化生长因子-β(tgf-β)家族的成员，tgf-β家族属于一组调节细胞生长和分化的因子，一般在细胞分化活跃的组织中含量较高。其中gdf11是衰老细胞的关键再生因子。gdf11可改善神经退行性疾病和神经血管疾病，增加骨骼肌体积并增强肌肉力量，临床应用中的逆转衰老功效也是其广泛的生物学效应之一。tgf-β1是有效的组织再生刺激剂，在伤口愈合相关研究中tgf-β1能激活成纤维细胞以产生胶原蛋白。gdf11的表达在小鼠和人类伴随着年龄的增加，呈现降低的趋势。在体内动物实验中，tgf-β1在青年组大鼠皮肤组织中呈强阳性表达，而在老年组中呈阴性表达，因此，gdf11和tgf-β1被认为皮肤修复与再生的重要内源性调控因子。
[0073]
在本发明的实验中，与对照组比较，参见图1与图2，分子马达组的表皮组织中gdf11 mrna相对表达量，真皮组织中的gdf11和tgf-β1的mrna相对表达量，分别增高，并且
差异有统计学意义。
[0074]
分子马达对生长因子gdf11和tgf-β1具有促进表达的作用，gdf11和tgf-β1的高表达预示着分子马达在促增殖、促修复的功能中的潜力。
[0075]
3)凋亡和自噬元件调控
[0076]
由于凋亡和自噬在信号调控中存在交互调控，具有很多共同的调控元件。本发明选取了最具有代表性的元件bax、bcl-2、beclin-1和caspase-3进行了初步的探索。beclin-1对细胞凋亡和自噬起着重要的调控作用，同时bcl-2通过与beclin-1形成复合体影响其活性。凋亡和自噬在信号调控中存在交互调控，具有很多共同的调控元件。在这些调控元件中bax、bcl-2、beclin-1和caspase-3相互独立又紧密联系，在凋亡和自噬中扮演重要角色。
[0077]
3.1)抑制凋亡：
[0078]
bax和bcl-2都是bcl蛋白家族的成员，bcl-2是抑制凋亡的蛋白，而bax的生物学效应是拮抗bcl-2，从而促进细胞凋亡，缩短细胞生存周期。因此两者的比例决定了细胞是否走向凋亡。
[0079]
在本发明中无论真皮层还是表皮层，与对照组相比，分子马达组的bax的mrna表达量明显降低，而bcl-2明显增高且都有统计学意义。意味着bax/bcl-2比例显著下降，且caspase-3与对照组比较没有差异，充分说明分子马达产品有抑制表皮层和真皮层细胞凋亡的趋势。
[0080]
3.2)调节自噬：
[0081]
bcl-2也积极参与细胞自噬的调节，bcl-2和beclin-1在细胞内相互结合的相对数量在一定程度上决定了细胞的自噬水平。由于磷酸化的beclin-1，能激活脂酶vps34，诱导细胞自噬发生。因此当bcl-2与beclin-1结合增加时，会抑制细胞自噬。自噬是延长寿命的关键机制，自噬在皮肤组织抵抗早衰。
[0082]
在本发明的实验中，mrna表达水平在表皮中beclin-1表达水平显著减少，与对照组比较有统计学意义，真皮组织中的beclin-1表达水平低于检测限值。增加的bcl-2和减少的beclin-1表达水平预示着细胞自噬的抑制。
[0083]
以上实验结果发现，经受检样品分子马达原液表皮涂抹，与对照组相比，分子马达组的表皮组织中两个基质金属蛋白酶mrna相对表达量分别显著降低，差异有统计学意义；真皮组织mmp-1、mmp-9的表达量的降低。无论真皮层还是表皮层的bax基因的mrna表达量，与对照组相比明显降低；而bcl-2的表达量与对照组相比明显增高，且有统计学意义。与对照组相比beclin-1在表皮中表达水平显著减少，有统计学意义；
[0084]
因此，本发明方法制备的分子马达，从抗衰老功效的角度来说，对mmp-1和mmp-9基因的表达有抑制作用，对生长因子gdf11和tgf-β1具有促进表达的作用，并有抑制细胞凋亡的趋势。呈现对表皮和真皮组织一定的抗紫外损伤、促增殖、抗凋亡与抗衰老相关的趋势。
[0085]
实施例4
[0086]
本实施例分别以样品分子马达对表皮及真皮细胞端粒相对长度，rdna和mtdna拷贝数几个检测指标，对其体外抗衰老功效进行了实验。
[0087]
选用t-skin体外人造全层皮肤模型(3d皮肤模型)，对照和分子马达样品组各半，进行受检样品即实施例1制得的分子马达原液(polarki)的体外抗衰老效应评价研究。试验设对照组与分子马达组，采用表皮涂抹方式给药，每隔24小时重复涂抹1次，连续5天后，实
时荧光定量pcr检测各组皮肤模型的rdna拷贝数和mtdna标准化拷贝数；双色荧光定量pcr法检测端粒相对长度；对照组与分子马达组的检测项目见表3。
[0088]
表3.对照组与分子马达组
[0089][0090]
核糖体dna(rdna)拷贝数：rdna是细胞中最丰富的管家基因，参与核糖体装配和蛋白质合成，由于其重复序列特性，是真核细胞基因组最脆弱的区域之一，核糖体dna拷贝数的减少可以通过影响细胞的功能，与人类衰老有一定相关性。
[0091]
线粒体是细胞能量制造工厂，自由基代谢中心，线粒体产生atp的速率逐渐下降也是细胞衰老的标志。而线粒体的功能与线粒体dna(mtdna)数量和质量紧密相关，因此线粒体dna(mtdna)拷贝数可作为线粒体功能的重要表征。mtdna拷贝数变异会引起线粒体功能紊乱，线粒体产能能力下降，最终造成细胞功能性衰退。
[0092]
参见图3，在表皮和真皮组织中，与对照组比较，分子马达组核糖体dna和线粒体dna样品组全部高于对照组，尤其是核糖体28s、18s、5.8s在对照组两倍以上，具有一定生物学意义。
[0093]
以上实验结果发现，经受检样品分子马达原液表皮涂抹，与对照组相比，分子马达组rdna28s、18s、5.8s在对照组两倍以上，具有生物学意义。
[0094]
因此，本发明方法制备的分子马达，从抗衰老功效的角度来说，减少了rdna拷贝数丢失。呈现对皮肤组织一定的抗紫外损伤、促增殖、抗凋亡与抗衰老相关的趋势。
[0095]
实施例5
[0096]
本实施例从gsh、gsh-px、sod和mda几个氧化应激指标角度来分别检测样品分子马达对体外全皮肤模型的抗衰老功效进行了实验；
[0097]
选用t-skin体外人造全层皮肤模型(3d皮肤模型)，对照和分子马达样品组各半，进行受检样品即实施例1制得的分子马达原液的体外抗衰老效应评价研究。试验设对照组与分子马达组，采用表皮涂抹方式给药，每隔24小时重复涂抹1次，连续5天后，用生化试剂盒检测各组皮肤模型的氧化应激相关指标gsh、gsh-px、sod和mda，对照组与分子马达组的检测项目见表4。
[0098]
表4对照组与分子马达组mrna表达测试项目
[0099][0100]
通过生化水平检测氧化应激的相关指标，评价了样品对自由基防御清除能力。
[0101]
参见图4，在表皮和真皮组织中，分子马达组gsh、gsh-px、sod、mda四个指标与对照组比较，没有显著性差异。结果提示该样品没有对皮肤组织造成氧化损伤。
[0102]
实验结果发现，经受检样品分子马达原液表皮涂抹，与对照组相比，分子马达组通过氧化应激相关指标检测，未观察到氧化损伤。
[0103]
因此，本发明方法制备的分子马达，具有多种作用通路，来实现紧致抗衰老的作用，本发明的分子马达没有氧化相关的不良影响，可以抑制mmp-1、mmp-9活性，可以促进生长因子gdf11和tgf-β1的表达作用，可以抑制bax基因的表达作用以及促进bcl-2的表达作用，减少rdna拷贝数丢失，呈现对表皮和真皮组织一定的抗紫外损伤、促增殖、抗凋亡、抗衰老以及使皮肤紧致相关的作用。
[0104]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种分子马达的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：1)取培养后的细菌接种至培养基中再次培养；2)将步骤1)再次培养得到的细菌离心收集菌体，用缓冲液a重悬菌体，多次破碎后得到细胞破碎液；3)将步骤2)得到的细胞破碎液通过差速离心法和密度梯度离心法进行提取纯化，得到分子马达；或者，所述制备方法包括以下步骤：a)取培养后的细菌，离心收集菌体细胞；b)用缓冲液b悬浮步骤a)得到的菌体细胞；c)加入pmsf，冰浴超声破碎，第一次离心得到上清液，将上清液进行第二次离心，去除离心后的上清液，得到含有f1f
0-atp酶的复合体；其中，步骤1)与步骤a)中所述的细菌为嗜热菌。2.根据权利要求1所述的一种分子马达的制备方法，其特征在于，所述的嗜热菌包括嗜热栖热菌，嗜热玫瑰球菌，嗜热芽胞杆菌，嗜热链球菌，硫矿硫化叶菌，海栖热袍菌，火球菌中的一种，嗜热菌的接种比例为1:98-105。3.根据权利要求1或2所述的一种分子马达的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述的缓冲液a包括以下原料：0.1-0.8mol/l pbs ph8.0，0.1-20mmol/l mgcl2，0.1-5mmol/ldtt。4.根据权利要求1或2所述的一种分子马达的制备方法，其特征在于，步骤b)中，所述的缓冲液b包括以下原料：45-55mm的tricine-naoh，ph7.8-8.2，0.2-0.3m的蔗糖溶液，3-5mm的mgcl2溶液。5.根据权利要求1或2所述的一种分子马达的制备方法，其特征在于，步骤3)中，差速离心法为1-6℃、600-3000
×
g下离心40分钟，取上清液以100，000-200，000
×
g，离心30-90min；密度梯度离心法为：取差速离心法得到的沉淀加入到质量百分比浓度分别为20％，30％，40％，50％，60％的蔗糖溶液，以150，000-300，000
×
g，60-90min，1-6℃条件下超速离心，收集蔗糖溶液的质量百分比浓度为40％-50％区域的液体。6.根据权利要求1或2所述的一种分子马达的制备方法，其特征在于，步骤c)中，pmsf的终浓度为1mmol/l，超声破碎的条件为：振幅为40-60％，超声5-10s，停6-10s，时间25-35min。7.根据权利要求1或2所述的一种分子马达的制备方法，其特征在于，步骤c)中，第一次离心是在20，000
×
g下离心25-35min，第二次离心是在180，000
×
g下离心85-95min。8.一种如权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的分子马达的应用，其特征在于，所述分子马达在化妆品领域的应用。9.根据权利要求8所述的分子马达的应用，其特征在于，所述分子马达在制备用于紧致抗衰老的化妆品中的用途。10.根据权利要求9所述的分子马达的应用，其特征在于，所述分子马达可抑制mmp-1、mmp-9活性。11.根据权利要求9所述的分子马达的应用，其特征在于，所述分子马达可促进生长因子gdf11和tgf-β1的表达作用。12.根据权利要求9所述的分子马达的应用，其特征在于，所述分子马达可抑制bax基因
的表达作用以及促进bcl-2的表达作用。13.根据权利要求9所述的分子马达的应用，其特征在于，所述分子马达可减少rdna拷贝数丢失，呈现对表皮和真皮组织一定的抗紫外损伤、促增殖、抗凋亡、抗衰老以及使皮肤紧致相关的作用。

技术总结
本发明公开了一种分子马达的制备方法及其应用，本发明利用嗜热菌来制备分子马达，利用差速离心法和密度梯度离心法结合，目的是为了去掉细胞碎片和细胞器，以及球蛋白等大分子杂质，以获得更高度纯化和功能的分子马达。本发明制得的分子马达具有多种作用通路，来实现紧致抗衰老的作用，本发明的分子马达没有氧化相关的不良影响，可以抑制MMP-1、MMP-9活性，可以促进生长因子GDF11和TGF-β1的表达作用，可以抑制Bax基因的表达作用以及促进Bcl-2的表达作用，减少rDNA拷贝数丢失，呈现对表皮和真皮组织一定的抗紫外损伤、促增殖、抗凋亡、抗衰老以及使皮肤紧致相关的作用。老以及使皮肤紧致相关的作用。老以及使皮肤紧致相关的作用。


技术研发人员：颜贵卉 魏建良 王旻子 姚雨辰 章鹏坤 鲁阳辉
受保护的技术使用者：杭州优玛达生物科技有限公司
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2022/3/8