一种以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒及其制备方法

1.本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.亨廷顿舞蹈症(huntington’s disease,hd)是一种呈常染色体显性遗传的神经退行性疾病，由致病基因htt外显子1中的cag重复单位在世代间的不稳定传递导致。hd临床表现为不自主运动和认知功能障碍，严重影响患者的生活质量。hd多发生于中年人，发病年龄以40-50岁多见，该病也偶见于儿童和青少年，称为青少年型hd。该病症状复杂，对于有明确阳性家族史和典型临床表现者，本病较容易判断，但对家族史阴性的非典型患者，易出现漏诊和误诊。对于家系中有已患病的患者，根据cag的重复数可将其确诊，然后进行相应的药物治疗以缓解症状。同时也可筛查家系中表现正常的携带者，为家系提供更优质的遗传咨询因此基因检测对hd的诊疗具有极重要的意义。
3.998年，acmg/ashg(全美医学遗传学学会与全美人类遗传学协会亨廷顿舞蹈症病协作研究组)对hd的诊断制定了专门的基因诊断标准：cag重复数≤26，为正常等位基因，不会引起疾病；cag重复数为27-35的个体没有患hd的风险，但由于cag重复的不稳定性，其后代可能会存在cag重复增加的情况，有患病的风险；cag重复次数为36-39时，为不完全外显的等位基因，个体有患病的风险，但也可能没有症状；cag重复数≥40，为完全外显的等位基因，携带者会有相应的临床症状。
4.21个cag三核苷酸重复是htt正常等位基因中最常见的形式，荧光强度较强，其代表的str主等位基因(allele 1)峰型尖锐，横坐标对应的碱基数为 155bp；次等位基因(allele 2)具有更多的cag三核苷酸重复数，因而gc含量高而难以扩增在峰图上表现为簇状低矮小峰。
5.短串联重复序列(short tandem repeat，str)又称微卫星，在复制过程中新生链和模板链之间有时会发生局部解链。在双链重新配对时，由于每个重复单位相同，容易发生错配。如果在延伸过程中新合成链凸出一个重复单位，而dna 聚合酶在这种错配的dna链上继续合成，则会在下一轮复制过程中增加一个重复单位形成插入。反之，如果在模板链凸出一个重复单位，则新合成的链就比全长str等位基因少一个重复单位。这些异常的新生链产物会有一个乃至多个重复单位的插入或缺失，被称为滑移峰(stutterpeaking)。这种错配发生在体内时，会被dna修复系统正确修复，而在体外电泳时因无dna修复系统，这些 stutterpeaking的大量产生会干扰毛细管电泳中等位基因的正确分型。通常形成的 stutter产物比相应的主要等位基因峰减少一个乃至多个重复单位，表现为小峰，与等位基因尖锐的峰型相区别。这些变化会导致检测到的cag重复数比实际重复次数少，从而对基因检测的准确性造成极大影响。
6.acmg/ashg于2012年完善了hd基因的诊断标准，允许cag重复数存在一定的误差范
围。其中，cag重复数《50次的，误差为
±
2次；cag重复数在 50-75范围的，允许
±
3次的误差；cag重复数》75次的，误差为
±
4次。cag重复次数误差范围的制定，一定程度上促进了hd的诊疗。但对处于临界位置的 cag重复数来说，更为准确的检测手段仍十分有必要。例如，当检测者的cag 重复数为41时，允许存在
±
2重复次数的误差，cag检测数有可能落入36-39 范围，将被判定为不完全外显的等位基因，即携带者个体可能会发病也可能不会发病。因此，一种准确的基因检测方法对hd的基因诊断十分重要。
7.str的突变率(5
×
10-4
左右)远远高于其它位置的dna的突变率(dna上的点突变率为5
×
10-7
左右)，这表明dna聚合酶对在str序列进行扩增时，cag 三核苷酸重复单位发生滑脱错配的可能性大大增加，将会产生大量的stutter产物，进而严重影响cag重复数检测的正确性。研究发现，在str基因分型的反向引物的5’端添加非模板链的核苷酸，可以减少滑移峰的产生，而其中添加“gtttctt”，对减少滑移峰最为有效。


技术实现要素：

8.为了解决现有技术的问题，本发明提供了一种添加修饰碱基以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒及其制备方法。
9.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒，包括扩增引物、探针和标准阳性模板，所述上游扩增引物的核苷酸序列为seq id no.1；所述下游扩增引物的核苷酸序列为seq id no.2。
10.本发明所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
11.(1)引物设计：选择hd致病基因htt外显子1中cag三核苷酸微卫星侧翼的系列，设计并人工合成相应的小核苷酸序列作为引物，所述的扩增引物的退火温度为55-70℃；
12.(2)引物修饰：在正向引物5'端连接荧光染料fam，以使扩增片段带有荧光，便于电泳检测；在反向引物5'端加上“gtttctt”碱基序列，以减少dna聚合酶沿着错配链移动时产生的滑移峰；
13.(3)扩增、电泳；
14.(a)多聚酶链式反应的条件；
15.(b)获得pcr产物后，稀释125倍，进行毛细管电泳确定片段大小；
16.(4)鉴定：根据acmg/ashg制定的hd的基因诊断标准，以cag重复数的多少进行诊断。
17.进一步地，在步骤(2)中，引物修饰，所述引物的退火温度为60℃。
18.进一步地，在步骤(3)中，95℃预变性3min，之后进行10个循环(95℃30 s、68℃30s、72℃40s，再以95℃30s、60℃30s、72℃40s为一个循环，进行 30个循环，最后72℃3min，制得pcr产物。
19.本发明所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒在检测亨廷顿舞蹈症中的应用。
20.有益效果：本发明公开了一种以减少滑移峰的产生从而提高亨廷顿舞蹈症基因诊断准确率的方法。滑移峰的产生使得致病基因cag重复数检测的准确性降低，尤其是临界值
附近的cag重复次数最难以判定。例如，当cag重复实际数目介于36～39时，cag重复数减少或增加1-3个，可能会被判定为有患病风险，但也有可能被判断为病人。本发明所述方法在反向引物5’端添加“gtttctt”碱基序列，以减少dna聚合酶沿着错配链移动时极易产生的滑移峰，使得基因诊断的准确率得以提高，有助于疾病的早期识别与诊断。
附图说明
21.图1为本发明pcr产物稀释步骤流程图。
22.图2为本发明微卫星形成机制图，方块代表微卫星的重复单元，箭头代表新 dna链的合成及合成方向：2a为dna复制时dna聚合酶沿模板链的滑动图，正常的无突变dna复制；2b为延伸过程中新合成链凸出一个重复单位，而dna 聚合酶在这种错配的dna链上继续合成，新合成链上多加入了一个重复单位； 2c为模板链凸出一个重复单位，而dna聚合酶在这种错配的dna链上继续合成，新合成链上减少了一个重复单位。
23.图3为本发明使用改进的反向引物(5’端添加“gtttct”)进行扩增的结果图。
24.图4为医院针对同一检测者所出具的hd基因诊断结果图。
具体实施方式
25.为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。其中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
26.实施例1
27.本发明的一种以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒，包括扩增引物、探针和标准阳性模板，所述上游扩增引物的核苷酸序列为 seq id no.1；所述下游扩增引物的核苷酸序列为seq id no.2。
28.本发明所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
29.(1)引物设计 根据htt基因外显子1中str两侧的系列，应用primer 3.0 设计并人工合成相应的小核苷酸序列作为引物，见表1；引物的退火温度为68℃；所述的上游引物为cgaccctggaaaagctgatg；所述的下游引物为gtttcttctgaggaagctgaggaggc。
30.(2)引物修饰
31.在正向引物5'端连接荧光染料fam，以使扩增片段带有荧光，便于电泳检测；在反向引物5'端加上“gtttctt”碱基序列，以减少pcr扩增时滑移峰的产生；
32.(3)扩增、电泳
33.(a)多聚酶链式反应的条件：
34.95℃3min，之后以95℃30s、68℃30s、72℃40s为一个循环进行10个循环，再以95℃30s、60℃30s、72℃40s为一个循环进行30个循环，最后72℃3 min，得到pcr产物；
35.(b)获得pcr产物后，取4μl的pcr产物混合46μlde蒸馏水先稀释12.5 倍；稀释后的产物取1μl加入025μl的荧光内部标记rox 500(lifetech公司) 及8.75μl的hi-di(lifetech公司)，混合后达到最后的稀释倍数——125倍，即可进行毛细管电泳确定片段大小；
36.(4)鉴定allele 1峰型尖锐，横坐标对应的碱基数为155bp，对应的cag 三核苷酸重复数为21。allele 2，横坐标对应的碱基数为265bp，与155bp所代表的21个cag重复相差37次，即(265-155)/3＝37，最后allele 2的cag重复数：(21+37)＝58。检测者htt基因的cag重复数为25/44。依据acmg/ashg 于1998年制定的基因诊断标准，可将其确诊为患者。
37.本发明所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒在检测亨廷顿舞蹈症中的应用。
38.实施例2
39.实施例2与实施例1的区别在于：在步骤(1)中，引物设计：选择hd致病基因htt外显子1中cag三核苷酸微卫星侧翼的系列，设计并人工合成相应的小核苷酸序列作为引物，所述引物的退火温度为55℃；
40.实施例3
41.实施例3与实施例1的区别在于：在步骤(1)中，引物设计：选择hd致病基因htt外显子1中cag三核苷酸微卫星侧翼的系列，设计并人工合成相应的小核苷酸序列作为引物，所述引物的退火温度为70℃。
42.试验例1
43.本发明所述方法需要采集检测者的外周血，所需的dna20ng就足够。商业化合成表1中的引物后，将所有引物稀释到10μm/μl待用。
44.总反应体系25μl，扩增试剂可选择商业化的高保真酶系统，以tsingke公司的试剂为例，其组成包括：19μl的金牌mix、正反向引物各2μl(10um/μl)以及模板dna 2μl(20ng/μl)，混合后，引物终浓度为0.5um/μl。
45.通过对退火温度进行梯度pcr实验，得到以60℃为退火温度的pcr扩增效果最佳。pcr反应在perkin elmer geneamp pcr system 9600(applied biosystems， carlsbad，california，μsa)或其它热循环仪上进行，反应条件见表2。
46.pcr产物按图1所示步骤稀释125倍，参照电泳器说明书进行电泳。毛细管电泳检测结果用genemapper软件读取。
47.参见图3的毛细管电泳检测结果，不同的等位基因在图上显示为不同的峰。其中 allele 1峰型尖锐，横坐标对应的碱基数为155bp，cag三核苷酸重复数为21。而allele 2对应的碱基数为265bp，与155bp所代表的21个cag重复相差37次，即(265-155)/3＝37，最后allele 2的cag重复数：(21+37)＝58。最终检测者 htt基因的cag重复数为21/58，确诊为hd患者。
48.dna聚合酶在对str进行体外扩增时也会错配滑动，并且体外无dna修复系统，导致错配滑动无法被修正。因此，本发明所述方法在反向引物上添加的“gtttctt”减少扩增时滑移峰的产生，使得真正的等位基因峰在电泳中得以显现。图3为本发明使用改进的反向引物(gtttcttctgaggaagctgaggaggc)进行扩增的结果图，可见滑移峰显著减少；图4为医院针对同一检测者所出具的hd基因诊断结果图。两种方法均确诊为hd，但前者与医院现行的诊断方法相较更为准确。
49.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒，包括扩增引物、探针和标准阳性模板，其特征在于：所述上游扩增引物的核苷酸序列为seq id no.1；所述下游扩增引物的核苷酸序列为seq id no.2。2.权利要求1所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)引物设计：选择hd致病基因htt外显子1中cag三核苷酸微卫星侧翼的系列，设计并人工合成相应的小核苷酸序列作为引物，所述扩增引物的退火温度为55-70℃；(2)引物修饰：在正向引物5'端连接荧光染料fam，以使扩增片段带有荧光，便于电泳检测；在反向引物5'端加上“gtttctt”碱基序列，以减少dna聚合酶沿着错配链移动时产生的滑移峰；(3)扩增、电泳；(a)多聚酶链式反应的条件；(b)获得pcr产物后，稀释125倍，进行毛细管电泳确定片段大小；(4)鉴定：根据acmg/ashg制定的hd的基因诊断标准，以cag重复数的多少进行诊断。3.根据权利要求2所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，引物修饰，所述引物的退火温度为60℃。4.权利要求1所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，95℃预变性3min，之后进行10个循环(95℃ 30s、68℃ 30s、72℃ 40s，再以95℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 40s为一个循环，进行30个循环，最后72℃ 3min，制得pcr产物。5.权利要求2-4任一项所述的以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症基因检测准确率的试剂盒在检测亨特氏舞蹈症中的应用。

技术总结
本发明公开了一种以减少滑移峰的产生提高亨廷顿舞蹈症(Huntington’s disease,HD)基因检测准确率的试剂盒及其制备方法，所述方法通过引物设计、引物修饰、PCR扩增、毛细管电泳检测，进而根据毛细管电泳检测结果进行HD致病基因HTT中CAG重复数的换算，从而判断检测者是否患病。本发明所述方法在反向引物5’端添加“GTTTCTT”碱基序列，以减少DNA聚合酶沿着错配链移动时极易产生的滑移峰，使得基因诊断的准确率得以提高；正向扩增引物5’端使用荧光染料FAM进行修饰，便于电泳检测；本发明所述方法可从基因水平上对疑似亨特氏舞蹈症的患者做出有明确诊断，并可对家系中表型正常的携带者进行筛查，为家系提供更优质的遗传咨询，为国内开展HD基因诊断及发病机制开发出更准确的基因检测手段。因检测手段。


技术研发人员：张小超 孙浩 张林 范百通 李文武
受保护的技术使用者：昆明医科大学
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2022/3/8