一种集成DNA提取和LAMP可视化核酸检测的方法

一种集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术和微流控芯片技术领域，具体而言，涉及一种集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法。


背景技术：

2.目前，主流技术还是基于pcr方法进行分子检测，而pcr技术又难以在现场进行快速检测，限制了pcr方法在poct领域的发展，进而影响新技术的发展。另外，在疫情等因素刺激下，分子诊断、核酸检测技术日新月异。如果分子检测能走出实验室，那将极大程度上促进分子诊断的应用落地，可以应用于门急诊的随到随检。而分子诊断的下一个突破方向之一，是开发具有一定高通量的分子检测试剂和核酸提取技术。
3.微流控芯片技术是一种通过微通道、反应室和其他功能部件，对流体进行精准操控，对生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元进行集成分析的技术。该技术具有液体流动可控、集成化、消耗低、通量高、分析快等优点，已经被广泛应用于生物医学和环境科学等研究领域。
4.钨针是一种结构细长由纯钨或者钨合金制得的钨制品。钨针通常可用于氩弧焊技术中的电极材料，也可用做仪器探针使用。钨针有耐高温，导电性好等优点。微创钨针可作为工具用于某些临床手术中，在临床上具有切割速度快、热损伤范围小等优势。现有技术中，未见有利用钨针或其他金属针进行生物组织样品核酸提取方面的相关报道，也未见有利用钨针提取技术结合微流控芯片进行dna提取，扩增结合。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法以同步实现核酸提取和lamp可视化快速检测。
7.本发明是这样实现的：
8.本发明提供了一种集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，方法为非疾病的诊断用途，其包括：dna提取和lamp扩增检测；
9.dna提取包括：采用dna提取装置对待测样本进行dna提取，然后将携带有待测样本的dna提取装置转移至微流控芯片主体上的液体通路；
10.lamp扩增检测包括：控制微流控芯片使得反应缓冲液储液单元中的反应缓冲液流出至液体通路中，使得dna提取装置上的待测样本随反应缓冲液进入反应单元进行lamp反应。
11.本发明提供的微流控芯片通过反应单元进行lamp反应，使用时，反应缓冲液从反应缓冲液储液单元流出，经液体通路流入反应单元，当将携带样本的dna提取装置置于液体通路中后，在反应缓冲液的洗脱作用下，待测样本随反应缓冲液进入反应单元进行lamp扩增反应。
12.本发明提供的微流控芯片的集成dna提取和lamp可视化检测的方法可以快速实现现场核酸的检测，而借助核酸提取装置可以同步快速地进行核酸的提取。具有核酸提取方便，成本低，不依赖复杂仪器设备的技术优势。
13.上述lamp反应缓冲液中带有荧光染料，可以选择市售的lamp反应用的te缓冲液和lamp mix试剂的混合液。
14.为了便于lamp扩增，在反应池内预先包埋或固定有lamp扩增的引物，从而对待测样本进行lamp扩增反应。
15.在本发明应用较佳的实施方式中，上述dna提取是将金属针状物刺穿于待测样本上，然后将金属针状物转移至微流控芯片主体上的液体通路。
16.在一种可选的实施方式中，上述金属针状物是以可拆卸的方式固定在固定件上，使用时，根据液体通路的数目需求，安装合适数目和合适间距的金属针状物至固定件上。例如排针的方式，架设在微流控芯片主体上的液体通路内。在反应缓冲液的流体洗脱下，待测样本可以从金属针状物的末端进入反应缓冲液，并在反应池中进行反应。
17.上述方法无需单独的进行核酸提取分离步骤，直接采用金属针状物采样的方式即可用于lamp扩增，极大程度上缩短了检测方法的步骤。
18.在本发明应用较佳的实施方式中，上述lamp扩增检测包括：按压反应缓冲液储液单元上的指压膜，使得反应缓冲液流出至液体通路中，在反应缓冲液的洗脱作用下，待测样本随反应缓冲液进入反应单元，待测样本中的dna与反应单元上固定的扩增引物进行lamp反应。
19.在本发明应用较佳的实施方式中，按压指压膜后，通过甩动微流控芯片使得混合反应液从微通道结构进入反应池中。在其他实施方式中，也可通过机械臂的方式实现甩液。
20.在本发明应用较佳的实施方式中，上述lamp反应时，将微流控芯片的反应池所在的一端插入微流控芯片反应发生装置，并按下strat按钮启动反应程序。
21.在本发明应用较佳的实施方式中，上述方法还包括结果的判定，结果的判定是根据反应池中反应液的颜色判定待测样本的阴阳性。
22.为便于比色，可以根据比色卡的颜色进行样本阴阳性的判断。
23.在本发明应用较佳的实施方式中，若反应池中反应液的颜色为黄色，则判断待测样本为阳性，若反应池中反应液的颜色为红色，则判断待测样本为阴性。
24.在本发明应用较佳的实施方式中，上述将微流控芯片插入微流控芯片反应发生装置后，在反应单元的反应温度下，石蜡贮藏室的石蜡融化，经流体通道进入反应单元以形成石蜡层；反应单元的反应温度为60-65℃。
25.在本发明应用较佳的实施方式中，上述待测样本选自植物病原微生物、动物病原微生物、非人动物组织等。
26.在本发明应用较佳的实施方式中，上述方法还包括拉动废液池的拉杆，将液体通路中多余的反应液抽入废液池中。
27.用于核酸检测的微流控芯片包括：微流控芯片主体，微流控芯片主体上具有反应缓冲液储液单元和反应单元，在反应缓冲液储液单元和反应单元之间设置有液体通路以连通反应缓冲液储液单元和反应单元，液体通路用于和dna提取装置配合实现dna提取，反应缓冲液储液单元内储存有lamp反应缓冲液。
28.在其他实施方式中，也可根据需要在使用时，现用现加缓冲液和lamp反应液。
29.在一种可选的实施方式中，上述反应缓冲液储液单元包括至少两个反应缓冲液储液池，液体通路包括至少两个流体通道，且流体通道的数目与反应缓冲液储液池的数目相同。
30.上述反应缓冲液储液池的数目可以是2个、3个、4个、5个或多个，可以是奇数或偶数数目。对应地流体通道的数目也可以根据反应缓冲液储液池的数目进行设置。
31.在一种可选的实施方式中，上述流体通道包括不限于：凹槽的形式。
32.在一种可选的实施方式中，上述流体通道的数目与反应缓冲液储液池的数目均为4个。
33.在本发明应用较佳的实施方式中，上述反应缓冲液储液池的上方设置有挤压部以使得反应缓冲液储液池的反应缓冲液挤压入液体通路。通过设置挤压部以方便在反应前将反应缓冲液挤压入液体通路。
34.在一种可选的实施方式中，上述挤压部包括不限于：挤压膜、挤压胶、挤压阀或挤压钮。
35.在本发明应用较佳的实施方式中，上述反应单元为透明可视的反应单元。在可选的实施方式中，在反应单元的观察侧设置透明板/膜。
36.在本发明应用较佳的实施方式中，上述每个流体通道对应一个反应单元，反应单元包括至少一个反应池，且在每个反应池与每个流体通道的连接处设置有微通道结构。
37.在本发明应用较佳的实施方式中，每个反应池预埋有目标引物。目标引物的种类可以根据检测的需要进行自适应选择。一次性加入dna，可实现多重反应。每一个流体通道可对应一个至多个环介导等温扩增反应池，每个反应池可以预埋不同的目标引物，实现一个样品多个目标同时检测。
38.在一种可选的实施方式中，上述微通道结构具有靠近流体通道处较宽的一端以及远离流体通道处较窄的一端。
39.反应液从微通道进入反应池时，利用一端宽另一端窄的梯形微通道结构，使得微流体先在梯形结构的宽处富集后，在手部甩动或机械甩动的作用下，使得反应液经过梯形结构窄处后，进入反应池中进行反应。
40.在本发明应用较佳的实施方式中，上述每个流体通道在靠近反应单元的位置均设置有石蜡贮藏室以使得石蜡在反应单元的反应温度下融化，且石蜡贮藏室与流体通道连通以使得石蜡融化后能经流体通道进入反应单元。
41.上述石蜡贮藏室的位置只要能满足扩增反应温度条件下的融化均可行，例如通过单独设置一条石蜡流出通路延伸至石蜡贮藏室外。
42.石蜡熔点是45℃，lamp的反应温度一般为65℃，因此在反应时，该温度足以使得固体石蜡融化并沿流体通道流向反应池的上方，在lamp反应液上形成一层石蜡层。石蜡层的形成有助于防止反应液蒸发以及气溶胶交叉污染。
43.在本发明应用较佳的实施方式中，上述微流控芯片主体上设置有标准比色卡安装槽或直接印刷于微流控芯片上。比色卡安装槽用于安装比色卡，例如安装粉红色和黄色的比色卡以便于测试人员比对反应池的颜色获知样本的阴性和阳性。
44.在微流控芯片主体上还设置有废液池，废液池与反应池连通。
45.本发明提供了一种集成dna提取和lamp可视化检测的微流控系统，其包括上述的微流控芯片和dna提取装置。
46.在本发明应用较佳的实施方式中，上述dna提取装置包括金属针状物和固定件，金属针状物固定于固定件上。
47.在本发明应用较佳的实施方式中，上述金属针状物为钨针，且钨针的数目至少为两个。例如2个、3个、4个、5个或多个，可以是任意的奇数或偶数数目。
48.固定件包括不限于固定板、固定条。金属针状物可从固定件上拆卸，可以根据需要在固定板上安装金属针状物。
49.发明人创新性的利用钨针提取样品dna，极大程度上将dna提取工作从步骤多时间长的实验室操作中解放，可实现现场快速检测，简化了操作难度。对于操作人员而言，通过简单的培训即可熟练掌握操作流程。
50.在一种可选的实施方式中，上述金属针状物的表面修饰有核酸结合基团，如羟基等。利用表面修饰核酸结合基团的金属针硬质材料针状物刺穿生物组织样品进行核酸的提取。
51.本发明提供的微流控系统可以用于植物或动物病原微生物、动物组织的检测。
52.本发明具有以下有益效果：
53.本发明提供的核酸检测方法可以同步快速地进行核酸的提取和核酸检测。具有核酸提取方便，成本低，不依赖复杂仪器设备的技术优势。该检测方法方便了实验室之外的现场实施快速检测。本发明提供的微流控系统在植物或动物病原微生物、动物组织的检测中具有良好的应用前景。
54.使用时，反应缓冲液从反应缓冲液储液单元流出，经液体通路流入反应单元，当将携带样本的dna提取装置置于液体通路中后，在反应缓冲液的洗脱作用下，待测样本的dna随反应缓冲液进入反应单元进行lamp扩增反应。反应时，将微流控芯片插入微流控芯片反应发生装置，控制反应程序，根据反应液的颜色可以判断样本阴性或阳性。
附图说明
55.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
56.图1为微流控芯片结构主视图；
57.图2为微流控芯片三维示意图；
58.图3为排针三维示意图；
59.图4为钨针dna可视化lamp结果和试剂盒提取dna的可视化lamp结果示意图。
60.附图标记：
61.1-指压膜贮液池；2-液体通道；3-石蜡贮藏腔；4-lamp可视化反应池；5-废液池；6-微流控芯片主体；7-标准比色卡。
具体实施方式
62.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
63.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
64.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。
65.在本发明的描述中，需要说明的是，术语“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，或者是该发明产品使用时惯常摆放的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于区分描述，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
66.此外，术语“水平”、“竖直”、“悬垂”等术语并不表示要求部件绝对水平或悬垂，而是可以稍微倾斜。如“水平”仅仅是指其方向相对“竖直”而言更加水平，并不是表示该结构一定要完全水平，而是可以稍微倾斜。
67.在本发明的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
68.实施例1
69.一种集成dna提取和lamp可视化检测的微流控芯片，其包括：反应缓冲液储液单元和反应单元，在反应缓冲液储液单元和反应单元之间设置有液体通路以连通反应缓冲液储液单元和反应单元。
70.图1-2所示，本实施例中反应缓冲液储液单元包括4个圆形指压膜贮液池1，其内预存有te缓冲液以及lamp mix试剂。lamp mix试剂可选自市售的lamp mix试剂。为了便于挤压，本实施例设置反应缓冲液储液池的上方设置有圆形指压膜作为挤压部以使得反应缓冲液储液池的反应缓冲液挤压入液体通路。通过设置挤压部以方便在反应前将反应缓冲液挤压入液体通路(即dna洗脱通道)。
71.液体通道2共有4路，且分别对应连通4个圆形指压膜贮液池1。
72.本实施例中，包括4个反应单元，每个反应单元包括4个透明可视的4个lamp可视化反应池4，且每个反应池与每个流体通道的连接处设置有呈梯形的微通道结构。微通道结构具有靠近流体通道处较宽的一端以及远离流体通道处较窄的一端。反应液从微通道进入反应池时，利用一端宽另一端窄的梯形微通道结构，使得微流体先在梯形结构的宽处富集后，
在手部甩动或机械甩动的作用下，使得反应液经过梯形结构窄处后，进入反应池中进行反应。
73.此外，每个流体通道在靠近反应单元的位置均设置有石蜡贮藏腔3(即为石蜡贮藏室)，且石蜡贮藏腔3与流体通道连通。通过设置石蜡贮藏腔3有助于形成石蜡层，从而防止反应液蒸发以及气溶胶交叉污染。
74.微流控芯片主体6上设置有标准比色卡7安装槽。比色卡安装槽用于安装比色卡，例如安装粉红色和黄色的比色卡以便于测试人员比对反应池的颜色获知样本的阴性和阳性。
75.在微流控芯片上还设置有废液池5，废液池5与反应池连通。
76.本实施例还提供了dna提取装置，参照图3所示，利用长方体状亚克力板，根据提取样品需要，可安装1-5支dna提取钨针，方便操作人员进行dna提取。
77.集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法如下：
78.(1)dna的提取
79.任意选取一排“排针”，轻轻在待测样品表面按压穿刺，停留2-3秒后，迅速将“排针”转移到微流控芯片上的dna洗脱通道；待“排针”安放好后。
80.(2)dna的扩增
81.按压微流控芯片顶端指压膜，使贮液池中的te洗脱液以及lamp mix混合液流出，等待液体完全流过“排针”到达lamp反应池上方时，在反应缓冲液的洗脱作用下，待测样本随反应缓冲液进入反应单元进行后续的lamp扩增反应。
82.将“排针”取出，并用力甩动微流控芯片使得混合反应液进入反应池中；最后拉动废液池5拉杆，将通道中多余的反应液抽入废液池5。
83.将微流控芯片反应池所在的一端竖直插入微流控芯片反应发生装置，并按下strat按钮启动反应程序，等待30-45分钟，直至反应池中反应池完全变黄后，结束反应。
84.(3)结果判定
85.观察标准反应池中反应液颜色，并于标准比色卡7对比，红色结果判定为阴性；黄色结果判定为阳性。
86.实验例1
87.本实验例采用实施例1提供的微流控芯片进行柑橘叶子黄龙病病毒的检测。
88.反应池添加的反应体系如下：
89.pcrmix(kapa)5混引物2.2dna模板2ddh2o0.8total10(μl)
90.65℃反应90分钟，观察颜色变化，变成黄色的为被感染样品，未变色的为健康样品。
91.图4为本发明dna提取装置提取和试剂盒提取dna的可视化lamp结果(a为钨针dna可视化lamp结果；b为试剂盒提取dna可视化lamp结果)。证明了用钨针提取可以从柑橘叶片中收集到柑橘黄龙病病毒，并且验证了这种方法的准确率为100％。对于发病时间较长的柑
橘，检测结果的ct值更小，同样，可视化lamp的变色时间也越短。
92.实验例2
93.本实验例采用实施例1提供的微流控芯片进行有毒蘑菇大青褶伞的检测。
94.反应池添加的反应体系如下：
95.pcrmix(kapa)5混引物2.2dna模板2ddh2o0.8total10(μl)
96.65℃90分钟，观察颜色变化，变成黄色的为大青褶伞样品，未变色的为其他蘑菇样品。
97.大青褶伞引物序列如下：
98.f3cttactcgatgggttgtcgcfipactacaagtggtgcacaggtggctcctctggagcatgtgcabipttgaggggtctgagagagtggccgtgctttcacactgcagtb3tggccaggtagaagagagclbgggaattctcccggatgtgagg
99.实验例3
100.本实验例采用实施例1提供的微流控芯片进行牛肉掺马肉鉴别。
101.反应体系如下：
102.pcrmix(kapa)5混引物2.2dna模板2ddh2o0.8total10(μl)
103.65℃反应90分钟，观察颜色变化，变成黄色的为掺有马肉的样品，未变色的为真实牛肉样品。
104.肉类引物序列如下：
[0105][0106]
实验例4
[0107]
本实验例采用实施例1提供的微流控芯片进行对虾急性肝胰腺坏死/副溶血弧菌检测。
[0108]
反应体系如下：
[0109]
pcrmix(kapa)5混引物2.2dna模板2ddh2o0.8total10(μl)
[0110]
65℃反应90分钟，观察颜色变化，若变成黄色的为含病毒样品，未变色的为健康样品。
[0111]
反应池对虾急性肝胰腺坏死/副溶血弧菌引物序列如下：
[0112]
f3aacatacacctatcatcccgfipccattggtattgaatggtaagctccgaagtcggtcgtagtgtagbipgcggctggaaagtggctaaagcgttgtaaatggtaagtttcab3tgttaattacaacaatacgctgalfccacgtcccgtattctcaatgt
[0113]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述方法为非疾病的诊断用途，其包括：dna提取和lamp扩增检测；所述dna提取包括：采用dna提取装置对待测样本进行dna提取，然后将携带有待测样本的dna提取装置转移至微流控芯片主体上的液体通路；所述lamp扩增检测包括：控制微流控芯片使得反应缓冲液储液单元中的反应缓冲液流出至液体通路中，使得dna提取装置上的待测样本随反应缓冲液进入反应单元进行lamp反应。2.根据权利要求1所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述dna提取是将金属针状物刺穿于待测样本上，然后将金属针状物转移至微流控芯片主体上的液体通路。3.根据权利要求2所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述lamp扩增检测包括：按压反应缓冲液储液单元上的指压膜，使得反应缓冲液流出至液体通路中，在反应缓冲液的洗脱作用下，待测样本随反应缓冲液进入反应单元，待测样本与反应单元上固定的扩增引物进行lamp反应。4.根据权利要求3所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，按压指压膜后，通过甩动微流控芯片使得混合反应液从微通道结构进入反应池中。5.根据权利要求3所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述lamp反应时，将所述微流控芯片的反应池所在的一端插入微流控芯片反应发生装置，并按下strat按钮启动反应程序。6.根据权利要求5所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述方法还包括结果的判定，所述结果的判定是根据反应池中反应液的颜色判定待测样本的阴阳性。7.根据权利要求6所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述若反应池中反应液的颜色为黄色，则判断待测样本为阳性，若反应池中反应液的颜色为红色，则判断待测样本为阴性。8.根据权利要求5所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，将所述微流控芯片插入微流控芯片反应发生装置后，在反应单元的反应温度下，石蜡贮藏室的石蜡融化，经流体通道进入所述反应单元以形成石蜡层；所述反应单元的反应温度为60-65℃。9.根据权利要求1所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述待测样本选自植物病原微生物、动物病原微生物、非人动物组织。10.根据权利要求1所述的集成dna提取和lamp可视化核酸检测的方法，其特征在于，所述方法还包括拉动废液池的拉杆，将液体通路中多余的反应液抽入废液池中。

技术总结
本发明公开了一种集成DNA提取和LAMP可视化核酸检测的方法，涉及分子生物学技术和微流控芯片技术领域。其包括：DNA提取和LAMP扩增检测。该核酸检测方法可以同步快速地进行核酸的提取和核酸检测。具有核酸提取方便，成本低，不依赖复杂仪器设备的技术优势。本发明提供的集成DNA提取和LAMP可视化核酸检测的方法方便了实验室之外的现场实施快速检测。实验室之外的现场实施快速检测。实验室之外的现场实施快速检测。


技术研发人员：陈爱亮 赵睿明 张娟 王楠
受保护的技术使用者：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
技术研发日：2022.01.07
技术公布日：2022/3/8