一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法及应用

1.本发明属于生化分子递送技术领域，具体涉及一种基于植物表面微纳结构的生化分子细胞递送方法及应用。


背景技术：

2.生化分子（如蛋白质，质粒等）在细胞内行使着重要功能。细胞内环境非常复杂，包括大分子拥挤、限域、弱相互作用等，且不同种类细胞中这些因素存在较大差别，它们都会直接影响到蛋白质的折叠、稳定性、结构以及功能。因此，体外实验中对蛋白质结构和动态的研究结果难以真实反映细胞内蛋白质的结构和动态信息，为在接近天然的环境中研究蛋白质，还需将蛋白质的相关研究回归到细胞内，而蛋白质结构与功能的原位研究也已成为目前蛋白质科学中的前沿领域。
3.虽然已有很多物理与生物化学的方法报道可用于将质粒或蛋白转入到细胞内进行各种相关研究，但目前可导入外源蛋白的方式主要还是采用微注射和电转等。微注射一般只适合于将蛋白导入到尺寸较大的细胞（如直径约为2 mm的非洲爪蟾卵母细胞），而不适合于尺寸较小的细胞（如直径10-20
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m的细胞），且微注射方法需要繁琐的人工操作，费时费力。虽然电转的方式可以让蛋白进入到细胞内，但目前公开的研究结果表明，该方式能高效导入的蛋白种类非常受局限；此外，当前电穿孔技术中使用的强电场会导致细胞受损甚至死亡。目前也有一些基于机械力将外源生化分子导入到细胞内的方法，如基于微流控芯片的微结构对细胞进行挤压变形使得细胞膜受到一定程度的破坏，从而将物质导入到细胞；或者利用一些微纳加工的方式获得微针的模具，从而制作出微针结构用于进行生化物质递送至细胞。然而，这些机械式的方法均需要利用昂贵的仪器和复杂的工艺以获取这些装置或器件，技术门槛和成本都非常高，时间周期长。
4.此外，基于微针的透皮药物或美容成分递送在近年已被越来越多的应用于实际生活中。药物递送时将活性成分装载于微针中，微针与皮下组织作用后，由于存在药物的浓度梯度，可促使药物进入体内。目前，微针主要有三大类：实心微针，它本身不载药，通常由金属材料和非降解聚合物等制备而成，其作用是穿刺表皮，形成微通道，从而让药物渗透；空心微针，包括硅空心微针、金属空心微针、聚合物空心微针等，药物被预先装载于微针中，刺入皮肤后，实现药物递送；可溶微针，即将生物可降解的聚合物材料和药物制备成微针，在刺入皮肤后微针可逐步降解并释放药物，再经皮下组织吸收进入人体。目前微针的加工方法主有化学蚀刻技术、微机电系统加工、激光镭射技术，以及模具注塑技术等，其中模具注塑是比较常用的，但前提也需要利用相关技术（如通过微机电加工）制备出模具，然后进行注塑。上述这些制作微针的方法对设备要求高、成本高，在实际使用时有比较大的局限。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术存在的上述问题，提供一种快速、高效、低成本的基于植物表面微纳结构的生化分子细胞递送方法及微纳结构在制备微针中的应用。
6.为实现以上目的，本发明的技术方案如下：一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，具体为：先将植物上含有微纳结构的部分置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，然后在植物微纳结构上加入含有生化分子的细胞悬液，最后将整个体系置于离心机中离心。
7.所述离心是指：先以3000-4000 rpm的转速离心1-3分钟，然后将整个体系于35-38 ℃下孵育1-3分钟，且重复上述操作至少3次。
8.所述方法中，离心后将整个体系于35-38 ℃下孵育25-35分钟。
9.所述植物为长叶瓶子草。
10.所述微纳结构直径和长度均为50 nm-3
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m。
11.所述含有生化分子的细胞悬液为悬浮有细胞、生化分子且含钙和镁的pbs缓冲液。
12.所述植物上含有微纳结构的部分经脱水处理后置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，所述脱水处理的流程为：先将植物样品于2-5 ℃放置一晚后固定在含4%甲醛的pbs缓冲液中，再除去固定剂，并用pbs缓冲液洗涤样品至少两次，然后依次用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇至少洗涤一次，接着除去100%的乙醇并利用六甲基二硅氮烷干燥处理至少两次，最后将干燥后的样品储存备用。
13.一种植物微纳结构在制备微针中的应用，具体为：先将聚二甲氧基硅氧烷与固化剂按所需比例混合均匀后涂覆在植物微纳结构表面，固化后形成含有阵列微孔结构的pdms薄片，再揭起pdms薄片，随后向pdms薄片的微孔中注入生物可降解的聚合物材料或药物，固化后揭起即可得到阵列微针结构。
14.与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、本发明一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法先将植物上含有微纳结构的部分置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，然后在植物微纳结构上加入含有生化分子的细胞悬液，最后将整个体系置于离心机中离心，该方法基于植物表面的微纳结构，并借助离心力使其刺激细胞，使细胞膜磷脂双分子层在短时间内形成纳米级孔洞，进而保证生化分子的快速、高效、低成本递送，以便于生化分子的细胞内研究，同时能够避免对细胞造成强烈的外侧刺激，有利于细胞保持较高的活力。因此，本发明不仅实现了生化分子的快速、高效、低成本递送，而且有利于细胞保持较高的活力。
15.2、本发明一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法中离心采用先以3000-4000 rpm的转速离心1-3分钟，然后将整个体系于35-38 ℃下孵育1-3分钟的方式，且重复至少3次，孵育步骤的引入可有效促进细胞膜的流动和变形，不仅能够进一步提高生化分子的递送效果，而且也利于提高细胞的存活率。因此，本发明在进一步提高生化分子的递送效果的同时也利于提高细胞的存活率。
16.3、本发明一种植物微纳结构的应用以植物微纳结构作为模具，利用pdms对其结构进行复制，得到微纳孔洞，再将所需材料填充至微纳孔洞中获得对应的微针结构，从而实现生化分子递送的目的，与现有的微针加工方法相比，该方法不仅流程简单、成本低，而且应用范围比较广泛。因此，本发明实现了植物微纳结构在制备微针中的应用。
附图说明
17.图1为本发明的流程示意图。
18.图2为植物微纳结构作用于细胞的sem图。
19.图3为本发明实施例8得到的pdms薄片结构图。
20.图4为本发明实施例1-3以及对比例的荧光显微成像检测结果图。
21.图5为本发明实施例2、4的荧光显微成像检测结果图。
具体实施方式
22.下面结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
23.参见图1，一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，具体为：先将植物上含有微纳结构的部分置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，然后在植物微纳结构上加入含有生化分子的细胞悬液，最后将整个体系置于离心机中离心。
24.所述离心是指：先以3000-4000 rpm的转速离心1-3分钟，然后将整个体系于35-38 ℃下孵育1-3分钟，且重复上述操作至少3次。
25.所述方法中，离心后将整个体系于35-38 ℃下孵育25-35分钟。
26.所述植物为长叶瓶子草。
27.所述微纳结构直径和长度均为50 nm-3
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28.所述含有生化分子的细胞悬液为悬浮有细胞、生化分子且含钙和镁的pbs缓冲液。
29.所述植物上含有微纳结构的部分经脱水处理后置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，所述脱水处理的流程为：先将植物样品于2-5 ℃放置一晚后固定在含4%甲醛的pbs缓冲液中，再除去固定剂，并用pbs缓冲液洗涤样品至少两次，然后依次用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇至少洗涤一次，接着除去100%的乙醇并利用六甲基二硅氮烷干燥处理至少两次，最后将干燥后的样品储存备用。
30.一种植物微纳结构在制备微针中的应用，具体为：先将聚二甲氧基硅氧烷与固化剂按所需比例混合均匀后涂覆在植物微纳结构表面，固化后形成含有阵列微孔结构的pdms薄片，再揭起pdms薄片，随后向pdms薄片的微孔中注入生物可降解的聚合物材料或药物，固化后揭起即可得到阵列微针结构。
31.本发明提供了一种基于植物表面微纳结构快速递送生化分子到细胞的方法，该方法直接将植物微纳结构用作导入生化分子进细胞的微型器件（植物微纳结构作用于细胞的sem图参见图2），可以实现生化分子高效导入到细胞，以便于进行细胞内蛋白研究；同时提出了一种微纳结构在制备材料或药物递送微针方面的应用，这种方法将植物微纳结构用作制作微针的模具，来源广、易获得、成本低，有望广泛用于相关领域的研究和应用。
32.本发明中，填充至微纳孔洞中的材料可采用如聚乙烯醇（pva）、聚乙烯吡咯烷酮（pvp）、透明质酸（ha）、右旋糖酐（dextran）、壳聚糖（chitosan）、海藻酸钠（sodiumalginate）、聚乳酸（pla）、聚乳酸-羟基乙酸共聚物（plga）等聚合物材料，或药物。
33.实施例1：参见图1，一种生化分子的细胞递送方法，依次按照以下步骤进行：1、基底制备：将聚二甲氧基硅氧烷pdms 与其固化剂按10:1的比例混合均匀后倒入离心管中，于65 ℃固化2 h以得到基底；2、在翠卢莉上剪取含有微纳结构的部分，平放在基底上；3、将悬浮有mda-mb-231细胞、gfp蛋白且含钙和镁的pbs缓冲液作为细胞悬液，先
用移液枪对细胞悬液充分吹打，再吸取细胞悬液滴在微纳结构表面，然后将整个体系置于离心机中，以3500 rpm的转速离心2 min，随后将整个体系于37 ℃下孵育2分钟；4、重复步骤3三次；5、先将整个体系于37 ℃下孵育30分钟，再收集导入gfp蛋白的细胞即可。
34.实施例2：与实施例1的不同之处在于：本实施例剪取长叶瓶子草上含有微纳结构的部分。
35.实施例3：与实施例1的不同之处在于：本实施例剪取土瓶草上含有微纳结构的部分。
36.实施例4：与实施例2的不同之处在于：步骤3中，将整个体系置于离心机中，仅以3500 rpm的转速离心2 min，不进行孵育操作。
37.实施例5：与实施例2的不同之处在于：步骤2中，所述长叶瓶子草经脱水处理后平放在基底上，所述脱水处理的流程为：先将样品于4 ℃放置一晚后固定在含4%甲醛的pbs缓冲液中，再除去固定剂，并用pbs缓冲液洗涤样品两次，每次10分钟，然后依次用30%、50%、70%、90%的乙醇洗涤一次，每次15分钟，接着用100%的乙醇洗涤两次，每次15分钟，随后除去100%的乙醇，并在化学通风橱内利用六甲基二硅氮烷干燥处理两次，每次10分钟，最后将样品在化学通风橱中干燥10分钟即可；步骤3中，所述细胞悬液为悬浮有mda-mb-231细胞、荧光素标记的多糖分子（fluorescein dextran，分子量为30000 da）且含钙和镁的pbs缓冲液。
38.实施例6：与实施例5的不同之处在于：步骤3中，所述细胞悬液为悬浮有mda-mb-231细胞、gfp的质粒且含钙和镁的pbs缓冲液。
39.实施例7：与实施例2的不同之处在于：步骤3中，所述细胞悬液为悬浮有鼠源巨噬细胞（raw 264.7）、荧光素标记的多糖分子（fluorescein dextran，分子量为30000 da）且含钙和镁的pbs缓冲液。
40.实施例8：一种植物微纳结构在制备微针中的应用，依次按照以下步骤进行：1、将pdms与其固化剂按按10:1的比例混合均匀后涂覆在植物微纳结构表面；2、先静置过夜，再于65 ℃固化2 h以得到含有阵列微孔结构的pdms薄片，如图3所示，其中，图a为4
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显微镜下的结构图，图b为10
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显微镜下的结构图；3、先揭起pdms薄片，随后向pdms薄片的微孔中注入透明质酸，固化后揭起即可得到阵列微针结构。
41.对比例：
与实施例1的不同之处在于：不采用植物表面的微纳结构，对细胞悬液充分吹打后滴在基底上。
42.为考察本发明的效果，将实施例1-4以及对比例收集的细胞先用pbs缓冲液洗涤3次，再重悬在pbs缓冲液中，用智能全自动荧光显微成像系统进行检测（导入细胞内的gfp蛋白量越多，荧光斑点越大、越密集），其中，实施例1-3以及对比例的检测结果如图4所示，与翠卢莉、土瓶草相比，经长叶瓶子草刺激后的细胞导入了更多的gfp蛋白，其递送效果更好。参见图5，通过对比实施例2、4的检测结果可以看出，实施例2的递送效果明显优于实施例4，即离心后的孵育操作可显著提高生化分子的递送效果。

技术特征：
1.一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，其特征在于：所述方法为：先将植物上含有微纳结构的部分置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，然后在植物微纳结构上加入含有生化分子的细胞悬液，最后将整个体系置于离心机中离心。2.根据权利要求1所述的一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，其特征在于：所述离心是指：先以3000-4000 rpm的转速离心1-3分钟，然后将整个体系于35-38 ℃下孵育1-3分钟，且重复上述操作至少3次。3.根据权利要求1或2所述的一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，其特征在于：所述方法中，离心后将整个体系于35-38 ℃下孵育25-35分钟。4.根据权利要求1或2所述的一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，其特征在于：所述植物为长叶瓶子草。5.根据权利要求1或2所述的一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，其特征在于：所述微纳结构直径和长度均为50 nm-3
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m。6.根据权利要求1或2所述的一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，其特征在于：所述含有生化分子的细胞悬液为悬浮有细胞、生化分子且含钙和镁的pbs缓冲液。7.根据权利要求1或2所述的一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法，其特征在于：所述植物上含有微纳结构的部分经脱水处理后置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，所述脱水处理的流程为：先将植物样品于2-5 ℃放置一晚后固定在含4%甲醛的pbs缓冲液中，再除去固定剂，并用pbs洗涤样品至少两次，然后依次用30%、50%、70%、90%、100%的乙醇至少洗涤一次，接着除去100%的乙醇并利用六甲基二硅氮烷干燥处理至少两次，最后将干燥后的样品储存备用。8.一种植物微纳结构的应用，其特征在于：所述植物微纳结构用于制备微针，具体为：先将聚二甲氧基硅氧烷与固化剂按所需比例混合均匀后涂覆在植物微纳结构表面，固化后形成含有阵列微孔结构的pdms薄片，再揭起pdms薄片，随后向pdms薄片的微孔中注入生物可降解的聚合物材料或药物，固化后揭起即可得到阵列微针结构。

技术总结
一种基于植物微纳结构的生化分子细胞递送方法及应用，该方法先将脱水处理后的植物上含有微纳结构的部分置于由聚二甲氧基硅氧烷固化形成的基底上，然后在植物微纳结构上加入含有生化分子的细胞悬液，最后将整个体系置于离心机中离心，且植物微纳结构还用于制备微针，具体为：先将聚二甲氧基硅氧烷与固化剂按所需比例混合均匀后涂覆在植物微纳结构表面，固化后形成含有阵列微孔结构的PDMS薄片，再揭起PDMS薄片，随后向PDMS薄片的微孔中注入生物可降解的聚合物材料或药物，固化后揭起即可。本设计基于植物微纳结构实现了生化分子的快速、高效、低成本递送以及在制备微针中的应用。低成本递送以及在制备微针中的应用。低成本递送以及在制备微针中的应用。


技术研发人员：李颖 赵淑红 杨运煌 胡锐 朱江 刘买利
受保护的技术使用者：中国科学院精密测量科学与技术创新研究院
技术研发日：2021.12.06
技术公布日：2022/3/8