利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法

1.本发明涉及一种利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，属于生物化工领域。


背景技术：

2.吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，pqq)能够可逆传递电子，在生命系统当中作为氧化还原酶辅因子，是继核黄素和烟酰胺之后第三类辅酶，对生命体有重要的生理活性。
3.目前，pqq的制备方法主要有微生物发酵和化学合成方法。pqq的现有合成方法包括化学合成法和微生物发酵法。化学全合成法需要经过十步以上的反应才能获得，产率很低；并且需要使用大量有毒试剂和重金属催化剂，对环境破坏比较大。因此，该方法工业上不可长久应用。目前全世界仅有日本三菱瓦斯公司掌握工业化发酵生产pqq的技术，我国在这方面尚属空白。但是，日本三菱瓦斯公司发酵法生产pqq的产量仅10克每升，与其他发酵精细化工产品相比，pqq发酵产物浓度较低。另外，由于pqq强极性、水溶性、发酵液成分复杂的特点，常规天然产物分离纯化手段只适用于中等极性脂溶性化合物分离，因此，从发酵液中分离纯化pqq难度加大，产业化开发pqq必须解决分离纯化技术难题。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，该方法具有分离效率高、能耗低、生产能力大、便于快速连续操作等优点，可应用于pqq的工业化生产。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
7.(1)发酵液制备：利用吡咯喹啉醌生产菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液；
8.(2)磁性纳米固相萃取材料的制备：
9.1)硅包埋制备fe3o4@sio2；
10.2)fe3o4@sio2的硅烷化；
11.3)超分子溶剂在磁性纳米固相萃取材料表面的自组装修饰：
12.向异辛烷中加入硅烷化fe3o4@sio2，于室温下搅拌20-50min，随后边搅拌边加入十二烷基苯磺酸，在20-30℃、150-300rpm的条件下再搅拌20-50min；随后边搅拌边加入乙二胺，在30-40℃、150-300rpm的条件下搅拌20-50min；随后边搅拌边加入正戊醇，然后在50-65℃、150-300rpm的条件下搅拌20-50min，过滤，得反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，备用；
13.(3)吸附：将磁性纳米固相萃取材料加入发酵液中，于常温下搅拌10-20min，结束
后在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
14.(4)洗脱：向吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料中加入质量分数为10-16％的氯化钠溶液，于常温下搅拌10-20min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
15.(5)结晶纯化：将洗脱液在1-3℃条件下静置12-18h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
16.所述吡咯喹啉醌生产菌为：扭脱甲基杆菌、鲍曼不动杆菌或氧化葡萄糖酸杆菌。
17.硅包埋制备fe3o4@sio2的方法为：将fe3o4溶于体积分数为75％的乙醇溶液中，超声分散30min；随后边搅拌边滴加5-10％(v/v)的氨水，搅拌30min后，分10-20次添加正硅酸四乙酯，于室温下搅拌24h；反应结束后，用乙醇洗涤3～5次，再用去离子水洗涤3～5次，将样品在60℃的温度下真空干燥12h，备用。
18.所述fe3o4：乙醇溶液：氨水：正硅酸四乙酯的添加比例为10-20g：800ml：10ml：60ml。
19.fe3o4@sio2硅烷化的方法为：取5-10ml正十二烷基三甲氧基硅烷或正十八烷基三甲氧基硅烷于室温下搅拌，然后边搅拌边加入5-15g fe3o4@sio2，再在室温下搅拌12h，即得。
20.所述硅烷化fe3o4@sio2：异辛烷：十二烷基苯磺酸：乙二胺：正戊醇的添加比例为5-15g：10-30ml：0.5-1.0g：5-15ml：10-20ml。
21.发酵液与磁性纳米固相萃取材料的质量比为80-100：1。
22.吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料与氯化钠溶液的比例为1g：8-20ml。
23.本发明有益效果：
24.1、本发明提出的反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取法，有效克服了传统有机溶剂物理萃取法对水溶性成分pqq萃取率低不足的问题。该方法利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，从发酵液中萃取富集pqq而制备高纯度的pqq产品。与液液萃取相比，无需利用萃取塔或离心萃取机等设备进行液液两相分离，设备简单，操作便捷。
25.2、本发明制备磁性纳米固相萃取材料时，乙二胺、十二烷基苯磺酸、正戊醇、异辛烷在硅烷化磁性纳米颗粒表面通过超分子自组装而形成反胶束体系(图1)。在该体系中，乙二胺与十二烷基苯磺酸以离子键相连形成一个络合萃取活性位点，基于pqq羧酸基团与乙二胺铵根离子基团之间的离子对络合作用，以及十二烷基苯磺酸苯基与pqq吡咯环的π-π络合作用，从发酵液中高效、高选择性地萃取pqq(图2)。
26.3、本发明将有机萃取剂通过反胶束自组织修饰到硅烷化磁性纳米粒子表面进行固定化(图1)，从而有效防止有机萃取剂的流失。本发明所涉及超分子溶剂修饰的磁性纳米固相萃取材料为纳米状态(图3)，与待萃取液接触面积大、传质效率高，因此萃取效率高。使用磁性纳米颗粒进行萃取，可使用外加磁场进行固液分离，分离速度快，生产效率高。同时用氯化钠溶液进行洗脱，实现目标物洗脱与萃取材料再生的过程。操作相对简单，且成本低、污染少。
附图说明
27.图1为反胶束体系在硅烷化磁性纳米材料表面的自组装示意图。
28.图2为乙二胺铵根离子基团、十二烷基苯磺酸苯基与pqq的络合作用示意图。
29.图3为磁性纳米固相萃取材料的扫描电镜图。
30.图4为pqq标准品和实施例2最终产物的紫外光谱图。
31.其中，a为pqq标准品的紫外光谱图；b为实施例2最终产物的紫外光谱图。
32.图5为本发明实施例2最终产物的质谱图。
33.图6为pqq标准品的hplc分析结果。
34.图7为本发明实施例2最终产物的hplc分析结果。
具体实施方式
35.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
36.实施例1反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料的制备
37.一种磁性纳米固相萃取材料的制备方法，包括以下步骤：
38.1)硅包埋制备fe3o4@sio2；将10g fe3o4溶于800ml乙醇溶液(由200ml去离子水和600ml无水乙醇组成)中，超声分散30min；随后边搅拌边滴加10ml 10％(v/v)的氨水，搅拌30min后，分10次添加正硅酸四乙酯(teos)60ml，于室温下搅拌24h；反应结束后，用乙醇洗涤3～5次，除去剩余反应物，再用去离子水洗涤3～5次，将样品在60℃的温度下真空干燥12h，备用。
39.2)fe3o4@sio2的硅烷化；取5ml正十二烷基三甲氧基硅烷或正十八烷基三甲氧基硅烷于室温下搅拌，然后边搅拌边加入10g fe3o4@sio2，再在室温下搅拌12h，即得。
40.3)超分子溶剂在磁性纳米固相萃取材料表面的自组装修饰
41.向20ml异辛烷中加入10g硅烷化fe3o4@sio2，于室温下搅拌20min，随后边搅拌边加入0.8g十二烷基苯磺酸，在25℃、200rpm的条件下再搅拌20min；随后边搅拌边加入10ml乙二胺，在35℃、200rpm的条件下搅拌20min；随后边搅拌边加入15ml正戊醇，然后在60℃、200rpm的条件下搅拌20min，过滤，得反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，备用。
42.实施例2吡咯喹啉醌的分离纯化
43.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
44.(1)发酵液制备：利用氧化葡萄糖酸杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
45.每升培养基中含有40g山梨醇、20g酵母提取物、10g(nh4)2so4、4g kh2po4、10gmgso4·
h2o。
46.将氧化葡萄糖酸杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
47.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入100g发酵液中，于常温下搅拌10min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
48.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为15％的20ml氯化钠溶液，于常温下搅拌15min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
49.(4)结晶纯化：将洗脱液在2℃条件下静置16h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
50.实施例3吡咯喹啉醌的分离纯化
51.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
52.(1)发酵液制备：利用氧化葡萄糖酸杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
53.每升培养基中含有40g山梨醇、20g酵母提取物、10g(nh4)2so4、4g kh2po4、10gmgso4·
h2o。
54.将氧化葡萄糖酸杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
55.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入90g发酵液中，于常温下搅拌15min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
56.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为10％的10ml氯化钠溶液，于常温下搅拌10min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
57.(4)结晶纯化：将洗脱液在3℃条件下静置18h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
58.实施例4吡咯喹啉醌的分离纯化
59.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
60.(1)发酵液制备：利用氧化葡萄糖酸杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
61.每升培养基中含有40g山梨醇、20g酵母提取物、10g(nh4)2so4、4g kh2po4、10gmgso4·
h2o。
62.将氧化葡萄糖酸杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在28℃条件下震荡培养3d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在28℃条件下震荡培养5d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
63.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入90g发酵液中，于常温下搅拌15min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
64.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为13％的15ml氯化钠溶液，于常温下搅拌15min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
65.(4)结晶纯化：将洗脱液在1℃条件下静置12h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
66.实施例5吡咯喹啉醌的分离纯化
67.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
68.(1)发酵液制备：利用扭脱甲基杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
69.每升培养基中含有10ml甲醇、3g(nh4)2so4、1.5g kh2po4、0.2g mgso4·
7h2o、0.03gcacl2·
7h2o、0.005gznso4·
7h2o、0.005gcuso4·
5h2o、10g甲硫氨酸
70.将扭脱甲基杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在30℃条件下震荡培养4d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在30℃条件下震荡培养4d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
71.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入90g发酵液中，于常温下搅拌15min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
72.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为12％的15ml氯化钠溶液，于常温下搅拌15min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
73.(4)结晶纯化：将洗脱液在1℃条件下静置12h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
74.实施例6吡咯喹啉醌的分离纯化
75.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
76.(1)发酵液制备：利用扭脱甲基杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
77.每升培养基中含有10ml甲醇、3g(nh4)2so4、1.5g kh2po4、0.2g mgso4·
7h2o、0.03gcacl2·
7h2o、0.005gznso4·
7h2o、0.005gcuso4·
5h2o、10g甲硫氨酸。
78.将扭脱甲基杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在30℃条件下震荡培养4d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在30℃条件下震荡培养4d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
79.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入90g发酵液中，于常温下搅拌15min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
80.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料中加入到质量分数为11％的10ml氯化钠溶液，于常温下搅拌10min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
81.(4)结晶纯化：将洗脱液在3℃条件下静置18h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
82.实施例7吡咯喹啉醌的分离纯化
83.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
84.(1)发酵液制备：利用扭脱甲基杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
85.每升培养基中含有10ml甲醇、3g(nh4)2so4、1.5g kh2po4、0.2g mgso4·
7h2o、0.03gcacl2·
7h2o、0.005gznso4·
7h2o、0.005gcuso4·
5h2o、10g甲硫氨酸
86.将扭脱甲基杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在30℃条件下震荡培养4d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在30℃条件下震荡
培养4d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
87.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入90g发酵液中，于常温下搅拌10min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
88.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为14％的20ml氯化钠溶液，于常温下搅拌15min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
89.(4)结晶纯化：将洗脱液在2℃条件下静置16h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
90.实施例8吡咯喹啉醌的分离纯化
91.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
92.(1)发酵液制备：利用扭脱甲基杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
93.每升培养基中含有10ml甲醇、3g(nh4)2so4、1.5g kh2po4、0.2g mgso4·
7h2o、0.03gcacl2·
7h2o、0.005gznso4·
7h2o、0.005gcuso4·
5h2o、10g甲硫氨酸
94.将扭脱甲基杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在30℃条件下震荡培养4d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在30℃条件下震荡培养4d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
95.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入100g发酵液中，于常温下搅拌10min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
96.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为12％的20ml氯化钠溶液，于常温下搅拌15min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
97.(4)结晶纯化：将洗脱液在2℃条件下静置16h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
98.实施例9吡咯喹啉醌的分离纯化
99.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
100.(1)发酵液制备：利用鲍曼不动杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
101.每升培养基中含有na2hpo4，2g；kh2po4，1.4g；mgso4·
7h2o，1g；甲醇10g；(nh4)2so4，5g；混合氮源(硫酸铵：甲硫氨酸钠＝2：1)，6g/l；cacl
2 0.5g将鲍曼不动杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在30℃条件下震荡培养4d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在30℃条件下震荡培养4d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
102.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入90g发酵液中，于常温下搅拌15min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
103.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为13％的15ml氯化钠溶液，于常温下搅拌15min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
104.(4)结晶纯化：将洗脱液在1℃条件下静置12h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
105.实施例10吡咯喹啉醌的分离纯化
106.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：
107.(1)发酵液制备：利用鲍曼不动杆菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液，具体方法为：
108.每升培养基中含有na2hpo4，2g；kh2po4，1.4g；mgso4·
7h2o，1g；甲醇10g；(nh4)2so4，5g；混合氮源(硫酸铵：甲硫氨酸钠＝2：1)，6g/l；cacl
2 0.5g将鲍曼不动杆菌按照5％的接种量，接种于发酵培养基中，在30℃条件下震荡培养4d，得到种子液；然后将种子液按照10％的接种量，接种于富集培养基，在30℃条件下震荡培养4d，培养液5℃、9000r/min离心15min，收集上清液，得到含吡咯喹啉醌的发酵液；
109.(2)吸附：将1g磁性纳米固相萃取材料(实施例1所得)加入100g发酵液中，于常温下搅拌10min，结束后，在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；
110.(3)洗脱：将(2)中吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料加入到质量分数为15％的20ml氯化钠溶液，于常温下搅拌15min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；
111.(4)结晶纯化：将洗脱液在2℃条件下静置16h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。
112.实验例
113.1、产物分析
114.1.1、紫外光谱分析
115.采用紫外光谱仪对本发明(实施例2)的结晶产物与pqq标准品同时进行检测，结果见图4a和4b。结果表明，本发明与pqq样品的紫外光谱结果一致，说明本发明最终产品为pqq。
116.1.2、质谱分析
117.采用质谱仪对本发明(实施例2)的结晶产物进行检测，结果见图5。将本发明的结晶产物质谱数据与已知pqq质谱数据对比，结果表明，本发明的结晶产物分子离子峰[m-h]-＝329.07与已知pqq质谱数据一致，说明本发明最终产品为pqq。
[0118]
1.3、hplc法检测
[0119]
检测方法：产物的hplc检测：采用waters symmetry 300c
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液相色谱柱，以甲醇：水(甲醇和水均含0.1％三氟乙酸)为流动相，流速1ml/min，梯度洗脱(30-90％，30min)，检测波长230nm。
[0120]
检测对象：吡咯喹啉醌标准品、最终产物。
[0121]
结果分析：hplc分析结果见图6(pqq标准品)、图7(本发明实施例2产品)。结果表明，本发明的最终产物与pqq标准品色谱峰一致，说明本发明最终产品为pqq。
[0122]
1.4、吡咯喹啉醌的产率及纯度
[0123]
以本发明实施例2-10的吡咯喹啉醌的发酵液为样品溶液，研究该分子印迹固相萃取对吡咯喹啉醌的分离效果，采用高效液相色谱技术检测氯化钠溶液洗脱后水相中吡咯喹啉醌的含量，产率如下表1。吡咯喹啉醌的产率为氯化钠溶液洗脱后水相中吡咯喹啉醌的质量与原始发酵液中吡咯喹啉醌的质量之比。
[0124]
其中：pqq产率＝(c
1v1
/c
0v0
)
×
100％，
[0125]
c1：氯化钠溶液反萃后水相中吡咯喹啉醌的浓度；v1：氯化钠溶液反萃后水相的体积；
[0126]
c0：发酵液中吡咯喹啉醌的浓度；v0：发酵液体积。
[0127]
表1各实施例的pqq的产率及纯度
[0128]

技术特征：
1.利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)发酵液制备：利用吡咯喹啉醌生产菌制备含有吡咯喹啉醌的发酵液；(2)磁性纳米固相萃取材料的制备：1)硅包埋制备fe3o4@sio2；2)fe3o4@sio2的硅烷化；3)超分子溶剂在磁性纳米固相萃取材料表面的自组装修饰：向异辛烷中加入硅烷化fe3o4@sio2，于室温下搅拌20-50min，随后边搅拌边加入十二烷基苯磺酸，在20-30℃、150-300rpm的条件下再搅拌20-50min；随后边搅拌边加入乙二胺，在30-40℃、150-300rpm的条件下搅拌20-50min；随后边搅拌边加入正戊醇，然后在50-65℃、150-300rpm的条件下搅拌20-50min，过滤，得反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，备用；(3)吸附：将磁性纳米固相萃取材料加入发酵液中，于常温下搅拌10-20min，结束后在反应容器底部加磁铁，此时吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，倒出上层废液；(4)洗脱：向吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料中加入质量分数为10-16％的氯化钠溶液，于常温下搅拌10-20min，在反应容器底部加磁铁，此时磁性纳米固相萃取材料被固定在下层，回收上层洗脱液；(5)结晶纯化：将洗脱液在1-3℃条件下静置12-18h，得到晶体，过滤，即得pqq产品。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吡咯喹啉醌生产菌为：扭脱甲基杆菌、鲍曼不动杆菌或氧化葡萄糖酸杆菌。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，硅包埋制备fe3o4@sio2的方法为：将fe3o4溶于体积分数为75％的乙醇溶液中，超声分散30min；随后边搅拌边滴加5-10％(v/v)的氨水，搅拌30min后，分10-20次添加正硅酸四乙酯，于室温下搅拌24h；反应结束后，用乙醇洗涤3～5次，再用去离子水洗涤3～5次，将样品在60℃的温度下真空干燥12h，备用。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述fe3o4：乙醇溶液：氨水：正硅酸四乙酯的添加比例为10-20g：800ml：10ml：60ml。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，fe3o4@sio2硅烷化的方法为：取5-10ml正十二烷基三甲氧基硅烷或正十八烷基三甲氧基硅烷于室温下搅拌，然后边搅拌边加入5-15g fe3o4@sio2，再在室温下搅拌12h，即得。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅烷化fe3o4@sio2：异辛烷：十二烷基苯磺酸：乙二胺：正戊醇的添加比例为5-15g：10-30ml：0.5-1.0g：5-15ml：10-20ml。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵液与磁性纳米固相萃取材料的质量比为80-100：1。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，吸附有pqq的磁性纳米固相萃取材料与氯化钠溶液的比例为1g：8-20ml。

技术总结
本发明提供一种利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料分离纯化吡咯喹啉醌的方法，包括以下步骤：(1)发酵液制备；(2)磁性纳米固相萃取材料的制备：硅包埋制备Fe3O4@SiO2、Fe3O4@SiO2的硅烷化及超分子溶剂在磁性纳米固相萃取材料表面的自组装修饰；(3)吸附；(4)洗脱；(5)结晶纯化。本发明方法有效克服了传统有机溶剂物理萃取法对水溶性成分PQQ萃取率低不足的问题。该方法利用反胶束表面修饰的磁性纳米固相萃取材料，从发酵液中萃取富集PQQ而制备高纯度的PQQ产品。与液液萃取相比，无需利用萃取塔或离心萃取机等设备进行液液两相分离，设备简单，操作便捷。操作便捷。操作便捷。


技术研发人员：马科 杨雪鹏 钟桂芳 王光路 王冰洋 胡仙妹 程源航 苏泽宇
受保护的技术使用者：郑州轻工业大学
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2022/3/8