天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于医药技术领域，涉及一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法及其在阴道黏膜修复中的应用，还涉及葡配甘露聚糖的应用。


背景技术：

2.葡配甘露聚糖又称葡甘聚糖(glucomannan，gl)，是兰科植物白及bletilla striata(thunb.)reichb.f.的主要活性成分。白及中的葡配甘露聚糖主要由甘露糖和葡萄糖组成的一种中性多糖，以甘露糖居多，二者比例大约4:1并通过β型糖苷键聚合形成稳定的空间螺旋结构。葡配甘露聚糖的平均分子量约为65000～150000kda，分子结构中有大量的羟基，因此其水溶性好，溶于水后可形成分子内氢键而其水溶液具有较高的黏稠度和生物黏附性，在体内可生物降解，对人体安全无毒；白及葡配甘露聚糖具有广泛的药理活性，如抗溃疡、抗炎、抗肿瘤、止血、抑菌、促进创面愈合与抑制血管侧支循环形成等；同时，葡配甘露聚糖由于稳定性高、分子量大、具有空间螺旋结构，对大多数药物具有良好的相容性和包载性。基于上述优点，葡配甘露聚糖作为一种新型医用敷料被广泛的应用于给药系统的载体材料如水凝胶、微球、纳米粒、血浆代用品、伤口辅料与体内支架等。因此，白及葡配甘露聚糖的应用前景十分广阔、市场需求量不断增加。
3.目前，市面上供应的白及葡配甘露聚糖普遍存在含量低、色泽差、价格高的问题，进而影响作为新型给药系统材料性能的发挥与制剂成型性能；而少数高纯度(含量75％以上)葡配甘露聚糖则由于价格昂贵、供应量少而难于大量推广应用。究其原因，主要是因为高纯度葡配甘露聚糖制备过程复杂、周期长、损失大与有机溶剂残留超标等，因而造成价格较高、质量不佳与难于工业化进而影响其推广应用。因此，积极开发一种适合于工业化的简单、高效的高纯度葡配甘露聚糖的制备方法，对进一步的应用开发具有重要促进作用。
4.女性妇科病以阴道炎和宫颈糜烂为主，而黏膜受损与不全造成的阴道防御屏障低下则是妇科炎症反复发作的根本原因，而单纯使用抗生素、手术与凝胶类器械难以修复黏膜组织，因此，开发一种能够促进阴道黏膜修复的医用敷料则对于妇科疾病的治疗和预防具有重要意义。本发明基于中药材白及具有良好的祛腐生肌和止血消肿作用，从而制备高纯度的葡配甘露聚糖，为阴道炎与宫颈糜烂的治疗提供一种新的医用敷料白及葡配甘露聚糖。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的是提供一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，可简单高效的工业化制备高纯度葡配甘露聚糖(纯度≥95％)，解决了现有制备方法存在的制备过程复杂、周期长、损失大、成本高、含量低、色泽差与有机溶剂易残留超标等难于满足医用敷料质量要求的问题，也解决了高纯度葡配甘露聚糖纯化过程复杂繁琐而不易工业化放大的问题。
6.本发明的第二个目的是提供以葡配甘露聚糖作为修复阴道黏膜的一种新的医用
敷料新材料。
7.本发明所采用的第一种技术方案是：一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，具体步骤如下：
8.步骤1：称取白及药材，破碎后多次加入纯化水浸渍提取，并将多次提取的提取液合并冷却至室温后，置于冷库静置12h，分离得到上清液a备用；
9.步骤2：将步骤1中得到上清液a减压浓缩，得到浓缩物a，将浓缩物a放置室温后加入95％乙醇使含醇量达到75～80％，常温下静置24h，离心分离得到粗提物，密封置于冷库备用；
10.步骤3：将步骤2中得到的粗提物剪碎或撕碎后加入纯化水使其溶解完全，得到粗提物溶液，向粗提物溶液中加入沉淀剂搅拌均匀，静置12h后分离得到上清液b，向上清液b中加入沉淀剂搅拌均匀，静置24h后分离得到上清液c备用；
11.步骤4：向上清液c中加入双氧水搅拌均匀，调节ph＝7.0
±
0.2，静置1.5～2.5h，真空浓缩至无明显溶剂冷凝析出，得到浓缩物b，冷却至室温后，向浓缩物b中加入95％乙醇使含醇量达到80～85％，静置12h后离心甩干，得到湿的葡配甘露聚糖样品，将湿的葡配甘露聚糖样品置于65～70℃鼓风干燥，得到白色干燥物，将白色干燥物粉碎，即得到可降解医用敷料葡配甘露聚糖。
12.本发明的特点还在于，
13.步骤1中浸渍提取的次数为3～5次，所述浸渍提取的步骤为：向白及药材中加入其质量15～20倍量的纯化水，浸泡120～180min，于85～95℃搅拌下动态浸渍提取60min。
14.步骤2中减压浓缩的真空度为-0.08～-0.1mpa。
15.步骤3中粗提物溶液的质量浓度为35～40％。
16.步骤3中粗提物中沉淀剂的添加量为粗提物溶液体积与沉淀剂体积之和的15～20％；上清液b中沉淀剂的添加量为上清液体积与沉淀剂体积之和的15～20％；沉淀剂为二氯甲烷与正丁醇的混合物，其中二氯甲烷与正丁醇的体积比为4:1。
17.步骤4中双氧水的添加量为上清液c体积与双氧水体积之和的5～7％。
18.步骤4中调节ph值所采用的试剂为氨水。
19.本发明所采用的第二种技术方案是：一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的应用，该医用敷料葡配甘露聚糖本技术的制备方法得到，对于阴道黏膜损伤、不全具有较好的修复作用，能够作为阴道黏膜修复的医用敷料。
20.本发明的有益效果是：
21.(1)本发明采用动态热水浸渍法提取白及中的葡配甘露聚糖，通过动态热水浸渍可提高葡配甘露聚糖高分子在热水中的扩散速度和药材内外的浓度梯度，进而提高了提取效率，避免了静态浸渍法由于无法维持有效的浓度梯度而提取效率低，也避免了传统沸水煎煮法提取时由于过度加热致使杂质较多、纯化困难与多糖部分降解损失的弊端；将白及提取液进行冷藏静置，利用自然沉降原理使不溶性杂质沉淀、结饼而易于除掉，减少杂质含量；将提取液浓缩后进行醇沉，通过离心分离出粗多糖，粗多糖以湿状态置于冷库存放，由于湿多糖的絮状孔道结构含有高浓度乙醇，因此不易腐败利于存放，且易溶于水，避免了传统需要烘干存放与烘干后复溶时时间较长不利于加工处理的问题。
22.(2)本发明采用连续两步法除蛋白，是将粗多糖复溶于纯化水后通过连续的两步
法加入沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇＝4:1)可充分除掉蛋白类沉淀，再通过双氧水脱色，即可保障产品的色泽和纯度，避免了传统单次加入沉淀剂无法充分除掉蛋白的弊端；通过真空浓缩，除掉沉淀剂，再进行第二次醇沉，通过高浓度的乙醇进一步除掉多糖上残留的沉淀剂，同时，通过醇沉可使葡配甘露聚糖形成疏松多孔的絮状沉淀，通过离心分离出湿多糖，在普通的鼓风干燥下湿多糖通过疏松多孔结构迅速挥发掉吸附的乙醇和水分而干燥，得到白色具有微孔结构和较强脆性的干燥物，因此易于粉碎加工，避免了真空浓缩后直接干燥存在的有机溶剂残留的弊端，避免了使用冷冻干燥法周期长、成本高、产量低的弊端，也避免了传统工艺制备多糖存在的烘干后烘干物韧性大而无法粉碎加工的弊端。
23.(3)采用本发明方法制备的葡配甘露聚糖，为白色块状或粉末(粉碎后)，纯度高(纯度≥95％)，粉末流动性好、易溶于水，可以作为良好的医用敷料用于黏膜、皮肤伤口等，可作为阴道黏膜修复的一种医用敷料新材料用于阴道黏膜损伤与不全的修复；也可用于阴道新型给药系统如水凝胶、微球、纳米粒、植入剂等的载体材料，因此，具有广阔的应用前景。
附图说明
24.图1为使用本发明的方法制备的葡配甘露聚糖对人阴道上皮细胞相对生长率对照图；
25.图2是使用本发明的方法制备的葡配甘露聚糖对人阴道上皮细胞作用后对照图；
26.图3是使用本发明的方法制备的葡配甘露聚糖对阴道黏膜细胞因子表达对照图；
27.图4是使用本发明的方法制备的葡配甘露聚糖对阴道组织胶原蛋白表达对照图；
28.图5是使用本分明的方法制备的葡配甘露聚糖对阴道黏膜的刺激性对照图；
29.图6是使用本分明的方法制备的葡配甘露聚糖的扫描电镜图；
30.图7是使用本分明的方法制备的葡配甘露聚糖的xrd图谱；
31.图8是使用本分明的方法制备的葡配甘露聚糖对阴道黏膜损伤的修复作用对照图。
具体实施方式
32.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步阐述。
33.一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，具体步骤如下：
34.步骤1：称取白及药材，破碎后加入白及药材质量15～20倍量的纯化水，浸泡120～180min，于85～95℃搅拌下动态浸渍提取60min，共浸渍提取3～5次，并将多次提取的提取液合并冷却至室温后，置于冷库静置12h，分离得到上清液a备用；
35.步骤2：将步骤1中得到上清液a在-0.08～-0.1mpa的真空度下减压浓缩，得到浓缩物a，将浓缩物a放置室温后加入95％乙醇使含醇量达到75～80％，常温下静置24h，离心分离得到粗提物，密封置于冷库备用；
36.步骤3：将步骤2中得到的粗提物剪碎或撕碎后加入纯化水使其溶解完全，得到质量浓度为35～40％的粗提物溶液，向粗提物溶液中加入沉淀剂搅拌均匀，静置12h后分离得到上清液b，向上清液b中加入沉淀剂搅拌均匀，静置24h后分离得到上清液c备用；
37.其中，粗提物中沉淀剂的添加量为粗提物溶液体积与沉淀剂体积之和的15～
20％，上清液b中沉淀剂的添加量为上清液体积与沉淀剂体积之和的15～20％，沉淀剂为二氯甲烷与正丁醇的混合物，其中二氯甲烷与正丁醇的体积比为4:1。
38.步骤4：向上清液c中加入双氧水搅拌均匀，其中，双氧水的添加量为上清液c体积与双氧水体积之和的5～7％，接着，用氨水调节体系ph＝7.0
±
0.2，静置1.5～2.5h，真空浓缩至无明显溶剂冷凝析出，得到浓缩物b，冷却至室温后，向浓缩物b中加入95％乙醇使含醇量达到80～85％，静置12h后离心甩干，得到湿的葡配甘露聚糖样品，将湿的葡配甘露聚糖样品置于65～70℃鼓风干燥，得到白色干燥物，将白色干燥物粉碎，即得到可降解医用敷料葡配甘露聚糖。
39.本发明的一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖，采用上述的制备方法得到，对于阴道黏膜损伤、不全具有较好的修复作用，能够作为阴道黏膜修复的医用敷料。
40.以下通过对本发明的制备方法制备的葡配甘露聚糖进行表征，进行药学相关实验进一步说明本发明所产生的有益效果：
41.(一)对人阴道上皮细胞vk2/e6e7(atcc～crl2616)的影响
42.1、实验方法
43.将人阴道上皮细胞vk2/e6e7(atcc～crl2616)以传代的方式制成单细胞悬液，用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液(6μl左右)，在技术版上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。在倒置显微镜下，用10x物镜观察技术版四角大方格中的细胞数。细胞计数后，将细胞稀释成100μl 5000个细胞的单细胞悬液，种于96孔板中，每孔100μl细胞悬液。设置未处理细胞对照组和接受处理细胞对照组，每孔设3个复孔。种板后的细胞培养24h，待细胞贴壁后，吸弃培养基，将采用本技术的制备方法制备的葡配甘露聚糖不同剂量(10mg/l,20mg/l，40mg/l)分别与培养贴壁后的细胞接触处理72h，处理结束后，吸弃液体。避光，每孔加入10μl的mtt stock，37℃培养箱内继续孵育4h。吸弃培养基，每孔加100μl mtt溶解剂，摇床室温下轻柔摇15min，37℃孵育半h，倒置显微镜观察紫色结晶全部溶解。在570nm波长下测量od吸光度值，检测细胞的活性和增殖情况，以相对生长率(relative growth rate，rgr)表示：
44.rgr＝(ode÷
odc)
×
100％，其中ode表示实验组、odc表示空白组。
45.将与配甘露聚糖作用后的部分细胞，用荧光染料pi(碘化丙啶)进行染色，pi是一种可对dna染色的细胞核染色试剂，不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。因此，受损死亡的细胞可被染色而呈现红色荧光(激发波长535nm，发射波长615nm)。
46.2、实验结果
47.高中低三个剂量组的相对生长率高于空白组，具有显著性差异(t～test，p《0.05)，结果表明本发明制备的葡配甘露聚糖对人阴道上皮细胞vk2/e6e7安全无毒并具有显著的促进细胞增殖作用，能够减少细胞损伤，且具有剂量依耐性。具体结果见下图1和图2，图1为葡配甘露聚糖对人阴道上皮细胞相对生长率的影响；图2为葡配甘露聚糖对人阴道上皮细胞作用后的荧光染色情况图，图中，红色荧光代表死亡细胞：a～高剂量组，b～中剂量组，c～低剂量组，d～对照组。
48.(二)对阴道黏膜防御因子表达的影响
49.正常的阴道组织能够分泌一些重要的细胞防御因子如白细胞蛋白酶抑制剂(slpi)、乳铁蛋白(lf)、表面活性蛋白d(sp～d)等，从而发挥杀菌、抗病毒、抗炎与免疫调节等作用，对维持阴道的正常微生态环境与疾病的防治起重要作用；当阴道黏膜受损后，这些
防御因子的表达下降，会导致阴道黏膜的天然防御功能降低，从而易于引发妇科炎症。为了系统评价配甘露聚糖对对阴道黏膜防御因子表达的影响情况，进行如下实验：
50.1、实验方法
51.取雌性昆明种小鼠，随机分为5组，每组10只，连续用药1周后观察指标表达情况，具体如下：
①
正常对照组(生理盐水组)，
②
葡配甘露聚糖低剂量组(10mg/l)，
③
葡配甘露聚糖中剂量组(20mg/l)，
④
葡配甘露聚糖高剂量组(40mg/l)，
⑤
空白组，共5组。小鼠喂养1周后，每只小鼠按2μg皮下注射苯甲酸雌二醇(e2)的混合液，每2天注射1次，直至实验结束，注射e2 72h后在各组小鼠阴道内分别注入相应的药剂或生理盐水，再将小鼠放回笼中，继续喂养。1周后，脱颈处死各组小鼠，打开腹腔，切除阴道组织，用4℃生理盐水中洗净后，置于10％中性多聚甲醛中固定24h，酒精脱水，石蜡包埋，切片，具体按sp法免疫组化试剂盒说明书操作检测slpi、lf、sp～d的表达情况(nmol/l)。
52.2、实验结果
53.结果表明，与对照组和空白组比较配甘露聚糖能够促进小鼠阴道组织中黏膜防御因子slpi、lf、sp～d的表达(t～test，p《0.05)，并且随着剂量的增大而增多。防御因子slpi、lf、sp～d的表达有利于阴道黏膜防御屏障的构建，从而增强对致病性病原微生物的抵抗能力。具体结果见下图3，图3为葡配甘露聚糖对阴道黏膜细胞因子表达的影响图。
54.(三)对阴道组织胶原蛋白表达的影响
55.胶原蛋白对阴道组织的完整性、柔韧性以及盆底结缔组织韧性强弱有着重要作用，其中主要是i型(collagen i)和iii型胶原蛋白(collagen iii)。collagen i直径较粗，抗张能力强，具有出色的抗拉伸强度，起支持作用；collagen iii直径较细，柔韧性强，主要存在于需要增加柔初性和扩张力并承受周期性压力的组织中,而弹性纤维则为组织提供弹性和张力。collagen i和collagen iii结构和功能的完整性异常,使阴道组织韧性、弹力降低，引起支撑盆腔肌纤维强度降低而影响盆底结构和功能。
56.1、实验方法
57.将成年健康雌性sd大鼠分别随机分为模型组(造模后不给予药物)、空白组(不作任何处理)、葡配甘露聚糖高中低剂量组(10mg/l，20mg/l，40mg/l)。除空白组外，其余各组按照建立大鼠阴道炎动物模型的标准操作规范制作成白色念珠菌的模型，使模型大鼠阴道黏膜局部出现充血、肿胀、黏膜糜烂、伪膜及分泌物增多等症状。模型组和空白组不给予任何药物，葡配甘露聚糖组按照高、中、低剂量连续给药7天。给药结束后，处死动物，取100mg新鲜阴道组织，pbs洗净血污，冰上剪碎组织。配制裂解液，ripa：pmsf＝100:1，加入剪碎的组织中，超声震荡1min，冰上裂解30min，4℃13000g离心30min，取上清于新ep管中，备用。采用免疫蛋白印记法(western～blot)检测胶原蛋白i蛋白、胶原蛋白iii蛋白的表达。主要步骤：sds～page凝胶制备及灌胶，上样、电泳、切胶及制备硝酸纤维素膜(pvdf)、转膜、抗原封闭、加入一抗和二抗，在避光条件下显影，具体操作方法按试剂盒说明书步骤进行。
58.2、实验结果
59.实验结果表明，葡配甘露聚糖能够促进阴道组织collagen i和collagen iii的表达，且具有剂量依耐性。通过阴道组织collagen i和collagen iii的表达可以修复受损的病灶组织，同时可提高盆底结缔组织韧性强度增加而对阴道机能退化引起的盆腔脏器脱垂和尿失禁有一定的预防作用，图4葡配甘露聚糖对阴道组织胶原蛋白表达的影响图中所示。
60.(四)对阴道黏膜的安全性评价
61.1、实验方法：
62.成年健康日本大耳雌性白兔12只，体重2.0～2.5kg；饲养环境为室温18～22℃，相对湿度40～50％。
63.按照《消毒技术规范》(卫生部2002版)中阴道黏膜刺激性试验方法进行。将试验动物随机分为4组，对照组和葡配甘露聚糖高中低剂量组，每组3只。操作方法，
①
葡配甘露聚糖高中低剂量组：将8cm长的导尿管与2ml注射器连接，注射器和导尿管内注满受试样品葡配甘露聚糖高中低剂量组(10mg/l，20mg/l，40mg/l)，将兔子仰面固定并暴露出会阴和阴道口，将导尿管润湿后插入阴道约5cm，并注入2ml受试物。
②
对照组：给予等体积生理盐水作同样处理。
64.24h后处死实验动物，解剖取出兔子阴道组织，纵向切开，肉眼观察有无充血、水肿等；然后将阴道组织置于10％的甲醛溶液中固定48h，取出阴道的内端、中央和外端3个部位的组织进行he染色和病理组织学检查。按照如下表1的标准进行评价。
65.表1阴道刺激反应症状和评分标准
[0066][0067]
注意：0为无刺激性；1～3为最小刺激性；4～6为轻度刺激性；7～9为中度刺激性；10～12为明显刺激性。
[0068]
3、实验结果：
[0069]
肉眼观察外阴及阴道有无异常分泌物，用生理盐水冲洗干净，肉眼观察给药处阴道黏膜有无红斑、水肿等刺激反应症状。病理观察结果如下表2和图5所示，由下表2可知：葡配甘露聚糖高中低剂量组的动物均未出现无红斑、水肿等刺激反应症状，而对照组兔子则出现一定程度的炎症状况。如图5所示，a为高剂量组、b为中剂量组、c为低剂量组、d为对照组，对照组与葡配甘露聚糖高中低剂量组的阴道上皮结构相似，均能观察到鳞状上皮细胞完整，无明显的血管扩张与细胞坏死，肌层结构完整。结果表明本发明的葡配甘露聚糖对阴道黏膜无刺激。
[0070]
表2阴道黏膜刺激反应评分
[0071][0072]
(五)对本发明制备的葡配甘露聚糖的理化性质与相关应用进行表征
[0073]
采用本发明方法制备的葡配甘露聚糖呈白色固体，xrd扫描显示其有错综结晶结构而具有良好的刚性和脆性(图7)，因此易于粉碎加工。同时，干燥的葡配甘露聚糖具有空间网状结构，可通过毛细管作用而易溶于水(图6)，其水溶液成无色透明的黏稠状凝胶态。
[0074]
(六)葡配甘露聚糖的对阴道黏膜的修复作用
[0075]
将成年健康雌性日本大耳白兔，随机分为对照1组(造模后不给予药物)、对照2组(造模后给予生理盐水)与葡配甘露聚糖高中低剂量组(10mg/l，20mg/l，40mg/l)，造模前先用灭菌的生理盐水冲洗实验动物的阴道，再用无菌棉球吸取残留的冲洗液，按照建立阴道炎动物模型的标准操作规范，分别造成阴道炎模型，使模型动物的阴道黏膜局部出现充血、肿胀、糜烂、伪膜及分泌物增多等症状。对照～1组正常饲养，不给予任何药物；对照～2组，给予生理盐水；其余各模型组，分别给予葡配甘露聚糖高中低剂量(10mg/l，20mg/l，40mg/l)，连续给药7天。7天处死动物，解剖阴道组织，生理盐水洗净，纵向剖开后用4％的多聚甲醛固定，行he染色，进行病理组织学检查，观察黏膜上皮结构和厚度。
[0076]
实验结束后，病理组织学检查显示，与对照组比较葡配甘露聚糖高、中、低剂量组的黏膜固有层胶原丰富、排列紧密(如图8所示)，表明葡配甘露聚糖对病理损伤性阴道黏膜具有胶好的修复作用，可作为一种医用敷料新材料用于阴道黏膜损伤与不全的修复。
[0077]
实施例1
[0078]
一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法：
[0079]
步骤1：根据需要，称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材，破碎后加入白及药材质量15倍量的纯化水，浸泡180min，于85℃搅拌下动态浸渍提取60min，共提取3
次，并将3次提取液合并，冷却至室温后，置于冷库静置12h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得上清液a，备用；
[0080]
步骤2：将步骤1所得上清液a于-0.08～-0.1mpa的真空度下进行减压浓缩，得到浓缩物a(1ml相当于原药材1g)，放至室温，加入95％乙醇使含醇量达到75％，常温下静置24h，经离心分离，得到粗提物，将粗提物置于洁净的医用塑料包装袋，扎口密闭，置于冷库存放，备用；
[0081]
步骤3：称取步骤2所得的粗提物，剪碎或撕碎后加入纯化水，使粗提物溶液的质量浓度为35％，然后通过均质机或胶体磨使粗提物溶解完全，加入总体积20％的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇＝4:1，v/v)，搅拌至混匀，静置12h，分离得到上清液b，向上清液b中继续加入总体积15％的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇＝4:1，v/v)，搅拌至混匀，静置24h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得上清液c，备用；
[0082]
步骤4：在步骤3得到的上清液c中，加入总体积5％的医用双氧水，搅拌混合均匀，用氨水调节体系的ph＝7.0
±
0.2，静置1.5h，进行真空浓缩，浓缩至无明显的溶剂冷凝析出，得到浓缩物b，冷却至室温后，加入95％乙醇使含醇量达到80％，静置12h，经离心甩干，得到湿的葡配甘露聚糖样品，再将湿样品置于65～70℃鼓风干燥，得到白色干燥物，将白色干燥物粉碎，即得到可降解医用敷料葡配甘露聚糖，得到白色粉末状葡配甘露聚糖，用双层医用塑料包装袋包装，阴凉干燥处存放。
[0083]
实施例2
[0084]
一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法：
[0085]
步骤1：根据需要，称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材，破碎后加入白及药材质量20倍量的纯化水，浸泡120min，于95℃搅拌下动态浸渍提取60min，共提取4次，并将4次提取液合并，冷却至室温后，置于冷库静置12h，分离得上清液a，备用；
[0086]
步骤2：将步骤1所得上清液a进行减压浓缩(真空度-0.08～-0.1mpa)，得到浓缩物a(1ml相当于原药材1g)，放至室温，加入95％乙醇使含醇量达到80％，常温下静置24h，经离心分离，得到粗提物，将粗提物置于洁净的医用塑料包装袋，扎口密闭，置于冷库存放，备用；
[0087]
步骤3：称取步骤2所得的湿粗提物，剪碎或撕碎后加入纯化水，使粗提物溶液的质量浓度为40％，然后通过均质机或胶体磨使粗提物溶解完全，加入总体积15％的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇＝4:1，v/v)，搅拌至混匀，静置12h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得到上清液b，向上清液b中继续加入总体积20％的沉淀剂(同上)，搅拌至混匀，静置24h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得上清液c，备用；
[0088]
步骤4：在步骤3所得上清液c中，加入总体积7％的医用双氧水，搅拌混合均匀，用氨水调节体系的ph＝7.0
±
0.2，静置2.5h，进行真空浓缩，浓缩至无明显的溶剂冷凝析出，得到浓缩物b，冷却至室温后，加入95％乙醇使含醇量达到85％，静置12h，经离心甩干，得到湿的葡配甘露聚糖样品，再将湿样品置于65～70℃鼓风干燥，得到白色干燥物，将白色干燥物粉碎，即得到可降解医用敷料葡配甘露聚糖，得到白色粉末状葡配甘露聚糖，用双层医用塑料包装袋包装，阴凉干燥处存放。
[0089]
实施例3
[0090]
一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法：
[0091]
步骤1：根据需要，称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材，破碎后加入白及药材质量18倍量的纯化水，浸泡150min，于90℃搅拌下动态浸渍提取60min，共提取5次，并将5次提取液合并，冷却至室温后，置于冷库静置12h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得上清液a，备用；
[0092]
步骤2：将步骤1所得上清液a进行减压浓缩(真空度-0.08～-0.1mpa)，得到浓缩物a(1ml相当于原药材1g)，放至室温，加入95％乙醇使含醇量达到78％，常温下静置24h，经离心分离，得到粗提物，将粗提物置于洁净的医用塑料包装袋，扎口密闭，置于冷库存放，备用；
[0093]
步骤3：称取步骤2所得的粗提物，剪碎或撕碎后加入纯化水，使粗提物溶液的质量浓度为38％，然后通过均质机或胶体磨使粗提物溶解完全，加入总体积17％的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇＝4:1，v/v)，搅拌至混匀，静置12h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得到上清液b，向上清液b中继续加入总体积17％的沉淀剂(同上)，搅拌至混匀，静置24h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得上清液c，备用；
[0094]
步骤4：在步骤3所得上清液c中，加入总体积6％的医用双氧水，搅拌混合均匀，用氨水调节体系的ph＝7.0
±
0.2，静置2.0h，进行真空浓缩，浓缩至无明显的溶剂冷凝析出，得到浓缩物b，冷却至室温后，加入95％乙醇使含醇量达到83％，静置12h，经离心甩干，得到湿的葡配甘露聚糖样品，再将湿样品置于65～70℃鼓风干燥，得到白色干燥物，将白色干燥物粉碎，即得到可降解医用敷料葡配甘露聚糖，得到白色粉末状葡配甘露聚糖，用双层医用塑料包装袋包装，阴凉干燥处存放。
[0095]
实施例4
[0096]
一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法：
[0097]
步骤1：根据需要，称取符合现行版《中国药典》质量标准的白及药材，破碎后加入白及药材质量15倍量纯化水，浸泡120min，于90℃搅拌下动态浸渍提取60min，共提取3次，并将3次提取液合并，冷却至室温后，置于冷库静置12h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得上清液a，备用；
[0098]
步骤2：将步骤1所得上清液a进行减压浓缩(真空度-0.08～-0.1mpa)，得到浓缩物a(1ml相当于原药材1g)，放至室温，加入95％乙醇使含醇量达到75％，常温下静置24h，经离心分离，得到粗提物，将粗提物置于洁净的医用塑料包装袋，扎口密闭，置于冷库存放，备用；
[0099]
步骤3：称取步骤2所得的粗提物，剪碎或撕碎后加入纯化水，使粗提物溶液的质量浓度为35％，然后通过均质机或胶体磨使粗提物溶解完全，加入总体积20％的沉淀剂(二氯甲烷与正丁醇＝4:1，v/v)，搅拌至混匀，静置12h，分离得上清液b，向上清液b中继续加入总体积20％的沉淀剂(同上)，搅拌至混匀，静置24h，吸取上清液，沉淀层弃掉，得上清液c，备用；
[0100]
步骤4：在步骤3所得上清液c中，加入总体积6％的医用双氧水，搅拌混合均匀，用氨水调节体系的ph＝7.0
±
0.2，静置2.0h，进行真空浓缩，浓缩至无明显的溶剂冷凝析出，得到浓缩物，冷却至室温后，加入95％乙醇使含醇量达到80％，静置12h，经离心甩干，得到湿的葡配甘露聚糖样品，再将湿样品置于65～70℃鼓风干燥，得到白色干燥物，将白色干燥物粉碎，即得到可降解医用敷料葡配甘露聚糖。

技术特征：
1.一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1：称取白及药材，破碎后多次加入纯化水浸渍提取，并将多次提取的提取液合并冷却至室温后，置于冷库静置12h，分离得到上清液a备用；步骤2：将步骤1中得到上清液a减压浓缩，得到浓缩物a，将浓缩物a放置室温后加入95％乙醇使含醇量达到75～80％，常温下静置24h，离心分离得到粗提物，密封置于冷库备用；步骤3：将步骤2中得到的粗提物剪碎或撕碎后加入纯化水使其溶解完全，得到粗提物溶液，向粗提物溶液中加入沉淀剂搅拌均匀，静置12h后分离得到上清液b，向上清液b中加入沉淀剂搅拌均匀，静置24h后分离得到上清液c备用；步骤4：向上清液c中加入双氧水搅拌均匀，调节ph＝7.0
±
0.2，静置1.5～2.5h，真空浓缩至无明显溶剂冷凝析出，得到浓缩物b，冷却至室温后，向浓缩物b中加入95％乙醇使含醇量达到80～85％，静置12h后离心甩干，得到湿的葡配甘露聚糖样品，将湿的葡配甘露聚糖样品置于65～70℃鼓风干燥，得到白色干燥物，将白色干燥物粉碎，即得到可降解医用敷料葡配甘露聚糖。2.根据权利要求1所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤1中浸渍提取的次数为3～5次，所述浸渍提取的步骤为：向白及药材中加入其质量15～20倍量的纯化水，浸泡120～180min，于85～95℃搅拌下动态浸渍提取60min。3.根据权利要求1所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤2中减压浓缩的真空度为-0.08～-0.1mpa。4.根据权利要求1所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3中粗提物溶液的质量浓度为35～40％。5.根据权利要求1所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3中粗提物中沉淀剂的添加量为粗提物溶液体积与沉淀剂体积之和的15～20％。6.根据权利要求1所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3中上清液b中沉淀剂的添加量为上清液体积与沉淀剂体积之和的15～20％。7.根据权利要求5或6所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤3中沉淀剂为二氯甲烷与正丁醇的混合物，其中二氯甲烷与正丁醇的体积比为4:1。8.根据权利要求7所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4中双氧水的添加量为上清液c体积与双氧水体积之和的5～7％。9.根据权利要求8所述的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，其特征在于，所述步骤4中调节ph值所采用的试剂为氨水。10.一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的应用，其特征在于，该医用敷料葡配甘露聚糖根据权利要求1～9任一项所述的制备方法得到，对于阴道黏膜损伤、不全具有较好的修复作用，能够作为阴道黏膜修复的医用敷料。

技术总结
本发明公开了一种天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖的制备方法，通过对白及药材进行动态温浸渍提取，提取液经过冷藏静置、减压浓缩、醇沉、离心分离，再经过复溶、脱蛋白、脱色、醇沉、离心分离、干燥与粉碎，得到白色的天然可降解医用敷料葡配甘露聚糖，其粉末流动性好、易溶于水、水溶液黏度高与生物黏附性好，多糖含量≥95％。本发明的制备工艺简单、成本低、绿色环保与产品纯度高的特点，所制备的葡配甘露聚糖通过促进阴道黏膜细胞增殖、阴道胶原蛋白表达与促进黏膜防御因子表达而修复受损或不全的阴道黏膜组织、重构阴道黏膜防御屏障，为妇科炎症疾病的治疗和预防提供了一种天然可降解医用敷料，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。


技术研发人员：李伟泽 何树苗 李健 关丽 杨黎彬 赵宁 韩文霞 郭伟 周记磊 周永强
受保护的技术使用者：江苏微纳医药科技有限公司
技术研发日：2022.01.14
技术公布日：2022/3/8