一种鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液的制备方法及应用

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种鼻腔乳头状瘤组织的单细胞悬液制备方法及应用。


背景技术：

2.鼻腔乳头状瘤是比较常见的鼻腔良性肿瘤，男性多于女性(约为3：1)，多见于40岁以上，50-60岁发病率最高，生长慢，病程长。临床症状单侧鼻塞、流粘脓涕有时带血。肿瘤外观呈息肉样，瘤体较大，色红，表面不平，质地较硬，触及易出血。肿瘤多原发于鼻腔侧壁，上颌窦和筛窦最易受侵犯；延伸到颅内者罕见。术后易复发，复发率为28％-74％不等，复发原因：
①
误认为息肉，经鼻内手术很难彻底切除。
②
肿瘤具有多发性生长特点，术中肉眼难以判断原发部位和侵犯范围。
③
与本病组织病理有增生倾向有关。本病多于反复手术后恶变，恶变率2％-20％。
3.近年来，单细胞测序技术已被成功地用于解析一些正常或疾病组织中的复杂亚群结构。单细胞测序技术允许在单个细胞水平上研究分子差异并重建谱系层次结构，使相关研究人员能够解决复杂的疾病特别是肿瘤微环境中的细胞类型和亚型生物学的基本问题。然而由于单细胞测序需要大量的分离的、活性高(活率80％以上)的细胞，因此，目前大多数通过分离新鲜组织来获得人鼻腔乳头状瘤细胞的方法，尚不适合用于单细胞测序。
4.由于人鼻腔乳头状瘤具有多发性生长和易复发及恶变的特点，但是相关机制并不清晰，而且该组织难以解离成高活力、高分散的单细胞限制了单细胞测序技术在该领域的应用。
5.因此，本领域的技术人员致力于开发一种简单、方便的可用于单细胞测序的人鼻腔乳头状瘤单细胞悬液的制备方法，克服人鼻腔乳头状瘤组织难以解离成高活力、高分散的单细胞悬液的限制，使单细胞测序技术可以更广泛地应用于肿瘤组织微环境的研究。


技术实现要素：

6.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是利用简单、方便的方法分离鼻腔乳头状瘤单细胞。
7.为实现上述目的，本发明提供了一种制备鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液的酶溶液，包括单细胞悬液制备酶和溶剂；单细胞悬液制备酶包括ii型胶原酶、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶i，溶剂为无钙镁pbs溶液。
8.进一步地，ii型胶原酶的酶单位不低于125cdu/mg；胰蛋白酶为trypletm express酶。
9.进一步地，酶溶液中ii型胶原酶浓度为0.15～0.3％，胰蛋白酶浓度为0.25％，脱氧核糖核酸酶i浓度为20～50μg/ml。
10.本发明还提供了一种鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液的制备方法，包括以下步骤：
11.步骤1、酶解和孵育鼻腔乳头状瘤肿瘤组织，得到酶溶液孵育后的组织。
12.步骤2、过滤：收集步骤1中获得的酶混合液孵育后的组织，细胞滤网过滤，收集滤液，得到细胞悬液；
13.步骤3、红细胞裂解：用红细胞裂解稀释液对步骤2获得的细胞悬液进行红细胞裂解，离心，弃上清液，得到细胞沉淀；
14.步骤4、清洗：收集步骤4的细胞沉淀，用细胞洗涤液清洗，离心，用细胞重悬液重悬细胞，过滤，得到鼻腔乳头状瘤单细胞悬液。
15.进一步地，上述步骤1还包括：将鼻腔乳头状瘤组织用无钙镁的pbs溶液冲洗2～3次，用剪刀物理剪碎肿瘤组织至0.2mm3的小块，孵育的处理条件为：37℃下，旋转孵育20～40min；步骤3中红细胞裂解稀释液为预冷的无钙镁pbs溶液加入红细胞裂解液而得，离心转速为500g，离心处理时间为5～10min；步骤4中细胞洗涤液为预冷的无菌的无钙镁pbs溶液。
16.进一步地，步骤1使用的酶溶液为ii型胶原酶、胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶i都溶解于无钙镁pbs溶液所得。
17.进一步地，其中步骤1还包括以下步骤：
18.(1)配制酶溶液、红细胞裂解稀释液、细胞洗涤液，酶溶液包含ii型胶原酶浓度为0.15～0.3％，胰蛋白酶浓度为0.25％，脱氧核糖核酸酶i浓度为20～50μg/ml；
19.(2)组织解离
20.剪取2～5mm肿瘤组织放入预冷的离心管中，加入酶溶液，用预冷的剪刀在小离心管中反复剪碎至0.2mm3的碎块，得到组织悬液；将组织悬液置于37℃孵箱，旋转孵育；用细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液。
21.进一步地，孵育处理条件为：37℃下，60rpm/min旋转孵育20～40min。
22.进一步地，孵育处理条件为：37℃下，60rpm/min旋转孵育为30min。
23.进一步地，步骤4中细胞重悬液为用于酶解解离中和的缓冲溶液，即含胎牛血清(fbs)的dmem培养液。
24.进一步地，含胎牛血清(fbs)的dmem培养液，缓冲溶液中fbs浓度为10％。
25.进一步地，步骤2中采用细胞过滤器进行过滤。
26.进一步地，步骤2中过滤方法为使用70μm细胞滤器进行过滤。
27.进一步地，步骤4中过滤方法为使用30μm细胞滤器进行过滤。
28.进一步地，步骤4中用于离心转速控制为200g，离心处理时间为5～10min。
29.进一步地，一种鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液的制备方法各步骤在无菌条件下进行，或者除了孵育处理条件为：37℃下以外，其他步骤均在冰上操作完成。
30.本发明还提供了一种鼻腔乳头状瘤组织的单细胞悬液制备方法制备得到的鼻腔乳头状瘤单细胞悬液。
31.本发明还提供一种鼻腔乳头状瘤单细胞悬液在单细胞测序中的应用。
32.本发明还提供一种鼻腔乳头状瘤组织的单细胞悬液制备方法进行单细胞rna测序后在肿瘤进化机制研究、癌症精准分型、肿瘤耐药机制和疗效预测研究中的应用。
33.在本发明的较佳实施方式中，详细说明制备鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液的方法；
34.在本发明的对比例1～4，其中对比例1为一步解离法，对比例2～4为分步解离法，作为实施例的对比方式来说明实施例的技术效果显著。
35.本发明有益的技术效果如下：
36.本发明首次提供一种用于单细胞测序的人鼻腔乳头状瘤单细胞悬液的制备方法；该方法制备得到鼻腔乳头状瘤单细胞悬液在保证细胞活性的同时，还可一次性获得大量分离度高的乳头状瘤单细胞。另外，本发明提供的制备方法不需要高度专业化的设备、试剂或技能，便于研究人员进行操作，因此具有良好的实际应用价值。本发明提供的制备方法是一种简便的方法，可以从离体新鲜肿瘤组织样本中获得适用于单细胞测序的单细胞悬液。
37.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
38.图1是本发明的一个较佳实施例1获取的单细胞悬液计数、活力检测及细胞分散程度的检测示意图；
39.图2是本发明的一个较佳实施例1获取的单细胞悬液的光镜及pi染色后的照片示意图；
40.图3是本发明的对比例1获取的单细胞悬液计数、活力检测及细胞分散程度的检测示意图；
41.图4是本发明的对比例1获取的单细胞悬液的光镜及pi染色后的照片示意图的对照图；
42.图5是本发明的对比例2获取的单细胞悬液计数、活力检测及细胞分散程度的检测示意图；
43.图6是本发明的对比例3的单细胞悬液计数、活力检测及细胞分散程度的检测示意图；
44.图7是本发明的对比例4的单细胞悬液计数、活力检测及细胞分散程度的检测示意图。
具体实施方式
45.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
46.本发明提出了一种简便、高效地从人鼻腔乳头状瘤组织中解离分离单细胞的方法，所得单细胞悬液适用于高通量单细胞测序或分选挑选单个细胞测序等研究。本发明的实施例和对比例的步骤都包括试剂配制、组织裂解、红细胞裂解及细胞清洗、单细胞悬液质检。其中组织裂解，即酶解和孵育步骤，包括一步解离法或者分步解离法两种方式。以下提供一个较佳实施例1和对比里例1～4，其中实施例1组织裂解方式是一步解离法，对比例1为一步解离法；对比例2～4为分步解离法。用对比例与较佳实施例1技术效果相比较，说明本发明提供的鼻腔乳头状瘤组织的单细胞悬液制备方法的有益效果为能得到单个悬浮的细胞，无细胞碎片，且总体细胞浓度高，获得的细胞总数多，以便进行诸如高通量单细胞测序或单细胞分选等下游实验。
47.实施例1一步解离法制备鼻腔乳头状瘤组织的单细胞悬液
48.实施步骤如下：
49.(一)试剂配制
50.1.组织裂解液(db)：将1.5～3mg ii型胶原酶，2.5mg胰蛋白酶，20～50μg脱氧核糖核酸酶i溶解于1ml无钙镁pbs溶液中；
51.2.红细胞裂解液(rcb)和细胞洗涤液(wb)：9ml的预冷的无钙镁pbs溶液加入1ml 10
×
红细胞裂解液(德国美天旎130-094-183)配置成10ml 1
×
红细胞裂解液(rcb)；细胞洗涤液(wb)为预冷的无菌的无钙镁pbs溶液。
52.3.细胞重悬液(rsb)：将100μl fbs加入900μl dmem培养基。
53.(二)组织解离
54.1.将剪刀、镊子等小手术器械，无钙镁pbs缓冲液等试剂及2ml、15ml离心管等耗于冰上预冷：；
55.2.将6cm塑料培养皿放在冰上预冷，加入4ml预冷无钙镁pbs对组织进行清洗2～3次；
56.3.剪取2～5mm肿瘤组织放入预冷的离心管中，加入500μl db，用预冷的剪刀在小离心管中反复剪碎至0.2mm3的碎块，整个过程置于冰上；
57.4.将组织悬液置于37℃孵箱，60rpm/min旋转孵育30min；
58.5.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液。
59.(三)红细胞裂解及细胞清洗
60.1.向上述细胞悬液加入9倍体积的预冷的1
×
红细胞裂解液，上下颠倒混匀，室温静置2min；
61.2.于4℃500g，离心5min；
62.3.小心移去上清，不要碰到细胞沉淀；
63.4.加入5ml预冷的细胞洗涤液，轻柔吹吸10次；
64.5. 4℃200g，离心5min；
65.6.加入0.5ml预冷的细胞重悬液，轻柔吹吸10次重悬并用30μm细胞过滤器过滤。
66.(四)细胞悬液质检
67.取10μl单细胞悬液用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。自动计数结果如图1所示，细胞总浓度为1.10
×
106/ml，其中活细胞浓度为9.33
×
105/ml，占85％，死细胞浓度为1.70
×
105/ml，占15％，未见黏连的细胞团块，表明得到了单个悬浮的细胞，无细胞碎片；重复取样测试细胞总浓度为1.26
×
106/ml，其中活细胞浓度为1.07
×
106/ml，占84.9％，死细胞浓度为1.9
×
105/ml占15.1％，未见黏连的细胞团块，表明得到了单个悬浮的细胞，无细胞碎片。通过光镜和pi染色检测，单细胞悬液的光镜及pi染色后结果如图2所示，a部分为单细胞悬液的光镜图，b部分为pi染色后的照片，说明在细胞总浓度约1
×
106/ml的条件下，有1.01
×
105/ml细胞被染色，即染色率为10.1％，着色的部分也未见黏连的细胞团块。
68.对比例1一步解离法制备鼻腔乳头状瘤组织的单细胞悬液的对比例
69.本对比例使用的酶溶液为liberase tl酶溶液，代替实施例1中酶溶液解离组织。具体实施步骤如下：
70.(一)试剂配制
71.1.db：将125μg liberasetl溶解于1ml无钙镁pbs溶液中，制成liberase tl酶溶液；
72.2.rcb&wb：9ml的预冷的无钙镁pbs溶液加入1ml 10
×
红细胞裂解液(德国美天旎130-094-183)配置成10ml 1
×
红细胞裂解液(rcb)；细胞洗涤液(wb)为预冷的无菌的无钙镁pbs溶液。
73.3.rsb：将100μl fbs加入900μl dmem培养基。
74.(二)组织解离
75.1.将剪刀、镊子等小手术器械，无钙镁pbs缓冲液等试剂及2ml、15ml离心管等耗于冰上预冷：；
76.2.将6cm塑料培养皿放在冰上预冷，加入4ml预冷无钙镁pbs对组织进行清洗2～3次；
77.3.剪取2～5mm肿瘤组织放入预冷的离心管中，加入500μl的liberase tl酶溶液，用预冷的剪刀在小离心管中反复剪碎至0.2mm3的碎块，整个过程置于冰上；
78.4.将组织悬液置于37℃孵箱，60rpm/min旋转孵育12min；
79.5.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液。
80.(三)红细胞裂解及细胞清洗
81.1.向上述细胞悬液加入9倍体积的预冷的1
×
红细胞裂解液，上下颠倒混匀，室温静置2min；
82.2.于4℃500g，离心5min；
83.3.小心移去上清，不要碰到细胞沉淀；
84.4.加入5ml预冷的wb，轻柔吹吸10次；
85.5.4℃200g离心5min；
86.6.加入0.5ml预冷的细胞重悬液，轻柔吹吸10次重悬并用30μm细胞过滤器过滤。
87.(四)细胞重悬液质检
88.取10μl单细胞悬液用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。自动计数结果如图3所示，细胞总浓度为4.45
×
106/ml，其中活细胞浓度为3.33
×
106/ml，占75％，死细胞浓度为1.13
×
106/ml，占25％，可见部分黏连的细胞团块，表明得到了大部分为单个悬浮细胞的细胞悬液，有少量细胞碎片；重复取样测试细胞总浓度为4.86
×
106/ml，其中活细胞浓度为3.67
×
106/ml，占75.5％，死细胞浓度为1.19
×
106/ml占24.5％，可见部分黏连的细胞团块并存在少量细胞碎片。通过光镜和pi染色检测，单细胞悬液的光镜及pi染色后结果如图4所示，c部分为单细胞悬液的光镜图，d部分为pi染色后的照片，通过pi染色检测发现，在细胞总浓度约1
×
106/ml的条件下，有2.01
×
105/ml是细胞被染色，即染色率为20.1％，着色的部分可见黏连的细胞团块。
89.对比例2单支酶分步解离法i
90.本实施例使用的酶溶液为酶溶液db1和酶溶液db2，酶溶液中不包含脱氧核糖核酸酶i，两者分步加入反应体系。实施步骤如下：
91.(一)试剂配制
92.1.db：将1.5～3mg ii型胶原酶溶解于1ml无钙镁pbs溶液中制备成db1，将2.5mg胰蛋白酶溶解于1ml无钙镁pbs溶液中制备成db2；
93.2.rcb&wb：9ml的预冷的无钙镁pbs溶液加入1ml 10
×
红细胞裂解液(德国美天旎130-094-183)配置成10ml 1
×
红细胞裂解液(rcb)；细胞洗涤液(wb)为预冷的无菌的无钙镁pbs溶液。
94.3.rsb：将100μl加入900μl dmem培养基。
95.(二)组织解离
96.1.将剪刀、镊子等小手术器械，无钙镁pbs缓冲液等试剂及2ml、15ml离心管等耗于冰上预冷：；
97.2.将6cm塑料培养皿放在冰上预冷，加入4ml预冷无钙镁pbs对组织进行清洗2～3次；
98.3.剪取2～5mm肿瘤组织放入预冷的离心管中，加入500μl db1，用预冷的剪刀在小离心管中反复剪碎至0.2mm3的碎块，整个过程置于冰上；
99.4.将组织悬液置于37℃孵箱，60rpm/min旋转孵育12min；
100.5.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液1，收集滤渣；
101.6.向上一步的滤渣加入500μl db2，吹打混匀，室温解离3min；
102.7.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液2；
103.8.将细胞悬液1与细胞悬液2混合得细胞悬液3。
104.(三)红细胞裂解及细胞清洗
105.1.向上述细胞悬液3中加入9倍体积的预冷的1
×
红细胞裂解液，上下颠倒混匀，室温静置2min；
106.2.于4℃500g，离心5min；
107.3.小心移去上清，不要碰到细胞沉淀；
108.4.加入5ml预冷的wb，轻柔吹吸10次；
109.5. 4℃200g，离心5min；
110.6.加入0.5ml预冷的rsb，轻柔吹吸10次重悬并用30μm细胞过滤器过滤，得到单细胞细胞重悬液。
111.(四)细胞重悬液质检
112.取10μl单细胞重悬液用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。自动计数结果如图5所示，细胞总浓度为1.10
×
107/ml，其中活细胞浓度为9.62
×
106/ml，占87％，死细胞浓度为1.43
×
106/ml，占13％，未见细胞碎片，但是可见大连黏连的细胞团块，表明并未得到单个悬浮细胞；重复取样测试依旧可见大量黏连的细胞团块，表明未能得到分散度好的细胞悬液。通过pi染色检测发现，在细胞总浓度约1
×
106/ml的条件下，着色的部分可见黏连的细胞团块。
113.对比例3单支酶分步解离法ii
114.本实施例使用的酶溶液为酶溶液db1、酶溶液db2和酶溶液db3，分步加入反应体系。实施步骤如下：
115.(一)试剂配制
116.1.db：将1.5～3mg ii型胶原酶溶解于1ml无钙镁pbs溶液中制备成db1，将2.5mg胰蛋白酶溶解于1ml无钙镁pbs溶液中制备成db2，将10μg脱氧核糖核酸酶i溶解于1ml无钙镁pbs溶液中制备成db3；
117.2.rcb&wb：9ml的预冷的无钙镁pbs溶液加入1ml 10x红细胞裂解液(德国美天旎130-094-183)配置成10ml 1x红细胞裂解液(rcb)；细胞洗涤液(wb)为预冷的无菌的无钙镁pbs溶液。
118.3.rsb：将100μl加入900μl dmem培养基。
119.(二)组织解离
120.1.将剪刀、镊子等小手术器械，无钙镁pbs缓冲液等试剂及2ml、15ml离心管等耗于冰上预冷：；
121.2.将6cm塑料培养皿放在冰上预冷，加入4ml预冷无钙镁pbs对组织进行清洗2～3次；
122.3.剪取2～5mm肿瘤组织放入预冷的离心管中，加入500μldb1，用预冷的剪刀在小离心管中反复剪碎至0.2mm3的碎块，整个过程置于冰上；
123.4.将组织悬液置于37℃孵箱，60rpm/min旋转孵育12min；
124.5.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液1，收集滤渣；
125.6.向上一步的滤渣加入500μl db2，吹打混匀，室温解离3min；
126.7.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液2；
127.8.将细胞悬液1与细胞悬液2混合得细胞悬液3。
128.(三)红细胞裂解及细胞清洗
129.1.向上述细胞悬液3中加入9倍体积的预冷的1
×
红细胞裂解液，上下颠倒混匀，室温静置2min；
130.2.于4℃500g，离心5min；
131.3.小心移去上清，不要碰到细胞沉淀；
132.4.加入5ml预冷的wb，轻柔吹吸10次；
133.5. 4℃500g，离心5min；
134.6.加入0.5ml预冷的无钙镁pbs，轻柔吹吸10次重悬并用30μm细胞过滤器过滤，得到单细胞细胞重悬液1；
135.(四)细胞悬液去团块
136.1.将上述单细胞细胞重悬液1于4℃500g离心5min，用500μl db3，吹打混匀，于室温静置5min，期间颠倒混匀2～3次；
137.2.于4℃500g，离心5min；
138.3.小心移去上清，不要碰到细胞沉淀；
139.4.加入5ml预冷的wb，轻柔吹吸10次；
140.5. 4℃200g，离心5min；
141.6.加入0.5ml预冷的rsb，轻柔吹吸10次重悬并用30μm细胞过滤器过滤，得到单细胞细胞重悬液。
142.(五)细胞重悬液质检
143.取10μl单细胞重悬液用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。自动计数结果如图6所示，细胞总浓度为5.23
×
106/ml，其中活细胞浓度为4.15
×
106/ml，占79％，死细胞浓度为1.08
×
106/ml，占21％，未见细胞碎片，可见少量黏连的细胞团块，表明并未得到高度分散的单个悬浮细胞；重复取样测试
依旧可见少量黏连细胞团块，表明未能得到分散度好的细胞悬液。通过pi染色检测发现，在细胞总浓度约1
×
106/ml的条件下，着色的部分可见黏连的细胞团块。
144.对比例4酶混合液分步解离法
145.本实施例使用的酶溶液为酶溶液db1和酶混合溶液db2，两者分步加入反应体系。实施步骤如下：
146.(一)试剂配制
147.1.db：将1.5～3mg ii型胶原酶溶解于1ml无钙镁pbs溶液中制备成db1，将2.5mg胰蛋白酶和50μg脱氧核糖核酸酶i溶解于1ml无钙镁pbs溶液中制备成db2；
148.2.rcb&wb：9ml的预冷的无钙镁pbs溶液加入1ml 10
×
红细胞裂解液(德国美天旎130-094-183)配置成10ml 1
×
红细胞裂解液(rcb)；细胞洗涤液(wb)为预冷的无菌的无钙镁pbs溶液。
149.3.rsb：将100μl加入900μl dmem培养基。
150.(二)组织解离
151.1.将剪刀、镊子等小手术器械，无钙镁pbs缓冲液等试剂及2ml、15ml离心管等耗于冰上预冷：；
152.2.将6cm塑料培养皿放在冰上预冷，加入4ml预冷无钙镁pbs对组织进行清洗2～3次；
153.3.剪取2～5mm肿瘤组织放入预冷的离心管中，加入500μl db1，用预冷的剪刀在小离心管中反复剪碎至0.2mm3的碎块，整个过程置于冰上；
154.4.将组织悬液置于37℃孵箱，60rpm/min旋转孵育30min；
155.5.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液1，收集滤渣；
156.6.向上一步的滤渣加入500μl db2，吹打混匀，室温解离3min；
157.7.用70μm细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到细胞悬液2；
158.8.将细胞悬液1与细胞悬液2混合得细胞悬液3。
159.(三)红细胞裂解及细胞清洗
160.1.向上述细胞悬液3中加入9倍体积的预冷的1
×
红细胞裂解液，上下颠倒混匀，室温静置2min；
161.2.于4℃500g，离心5min；
162.3.小心移去上清，不要碰到细胞沉淀；
163.4.加入5ml预冷的wb，轻柔吹吸10次；
164.5. 4℃500g，离心5min；
165.6.加入0.5ml预冷的无钙镁pbs，轻柔吹吸10次重悬并用30μm细胞过滤器过滤，得到单细胞细胞重悬液。
166.(四)细胞悬液质检
167.取10μl单细胞悬液用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。自动计数结果如图7所示，细胞总浓度为6.28
×
105/ml，其中活细胞浓度为5.40
×
105/ml，占86％，死细胞浓度为8.80
×
104/ml，占14％，未见黏连的细胞团块也无细胞碎片，表明得到了高度分散的单个悬浮细胞；重复取样测试细胞也未见黏连的细胞团块及细胞碎片，但是总体细胞浓度偏低，获得的细胞总数少，难以进行诸
如高通量单细胞测序或单细胞分选等下游实验。
168.以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

技术特征：
1.一种制备鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液的酶溶液，其特征在于，包括单细胞悬液制备酶和溶剂；所述单细胞悬液制备酶包括ii型胶原酶、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶i，所述溶剂为无钙镁pbs溶液。2.如权利要求1所述的酶溶液，其特征在于，所述ii型胶原酶的酶单位不低于125cdu/mg；所述胰蛋白酶为trypletm express酶。3.如权利要求1所述的酶溶液，其特征在于，所述ii型胶原酶浓度为0.15～0.3％，所述胰蛋白酶浓度为0.25％，所述脱氧核糖核酸酶i浓度为20～50μg/ml。4.一种鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1、酶解和孵育所述鼻腔乳头状瘤肿瘤组织，得到酶溶液孵育后的组织。步骤2、过滤；收集步骤1中获得的酶溶液孵育后的组织，细胞滤网过滤，收集滤液，得到细胞悬液；步骤3、红细胞裂解；用红细胞裂解稀释液对步骤2获得的细胞悬液进行红细胞裂解，离心，弃上清液，得到细胞沉淀；步骤4、清洗；收集步骤4的细胞沉淀，用细胞洗涤液清洗，离心，用细胞重悬液重悬细胞，过滤，得到所述鼻腔乳头状瘤单细胞悬液。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1还包括：将所述鼻腔乳头状瘤组织用无钙镁的pbs溶液冲洗2～3次，用剪刀物理剪碎肿瘤组织至0.2mm3的小块，所述孵育的处理条件为：37℃下，旋转孵育20～40min；所述步骤3中所述红细胞裂解稀释液为预冷的所述无钙镁pbs溶液中加入红细胞裂解液而得，所述离心转速为500g，离心处理时间为5～10min；所述步骤4中所述细胞洗涤液为预冷的无菌的所述无钙镁的pbs溶液。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤1使用的酶溶液为ii型胶原酶、胰蛋白酶和脱氧核糖核酸酶i都溶解于所述无钙镁的pbs溶液而得。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，其中步骤1还包括以下步骤：(1)配制所述酶溶液、所述红细胞裂解稀释液、所述细胞洗涤液，其中所述酶溶液中所述ii型胶原酶浓度为0.15～0.3％，所述胰蛋白酶浓度为0.25％，所述脱氧核糖核酸酶i浓度为20～50μg/ml；(2)组织解离剪取2～5mm肿瘤组织放入预冷的离心管中，加入所述酶溶液，用预冷的剪刀在小离心管中反复剪碎至0.2mm3的碎块，得到组织悬液；将所述组织悬液置于37℃孵箱，旋转孵育；用细胞过滤器过滤到预冷的新的离心管中得到所述细胞悬液。8.权利要求4-7任一项所述的制备方法制备得到的鼻腔乳头状瘤单细胞悬液。9.权利要求8所述的鼻腔乳头状瘤单细胞悬液在单细胞测序中的应用。10.如权利要求4-7任一项所述的鼻腔乳头状瘤组织单细胞悬液制备方法进行单细胞rna测序后在肿瘤进化机制研究、癌症精准分型、肿瘤耐药机制和疗效预测研究中的应用。

技术总结
本发明公开了一种鼻腔乳头状瘤组织的单细胞悬液制备方法及应用，涉及生物检测技术领域，该方法的酶溶液为II型胶原酶、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶I的无钙镁PBS溶液；该方法包括的步骤为酶解和孵育鼻腔乳头状瘤肿瘤组织，过滤得到细胞悬液，红细胞裂解得到细胞沉淀，清洗得到鼻腔乳头状瘤单细胞悬液。本发明制备得到的鼻腔乳头状瘤单细胞悬液中单细胞活性高，数量充足，且细胞分离度高，有利于进行下游包括高通量单细胞测序、细胞分选后进行单个细胞的测序等实验。测序等实验。测序等实验。


技术研发人员：王慧 何牮 周献超 高锐 孟梅
受保护的技术使用者：上海交通大学医学院
技术研发日：2021.09.07
技术公布日：2022/3/8