基于TYRP1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用的制作方法

基于tyrp1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用
技术领域
1.本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种基于tyrp1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用。


背景技术：

2.物种丰富多样的体色特征一直是生物进化和表观遗传学研究的热点问题。研究认为，动物体色通常是由其体表皮肤含有不同的色素细胞及其不同的数量分布所致。不同于哺乳动物仅含有一种黑色素细胞，两栖动物体色与其真皮层中的三类色素细胞相关。针对两栖类动物具有的独特体色类型，以往研究主要从生理学和行为学上对其体色形成模式进行阐述和分析，但有关其体色性状下潜在的分子遗传特征的报道较少。近十年来，随着分子标记技术的发展，利用分子生物学方法针对不同体色性状进行标记从而进行选育辅助选择，能够有效提升育种效率。
3.大鲵(andrias davidianus)作为我国特有的珍稀物种，具有重要的研究和应用价值。在漫长的进化及人工驯养过程中，大鲵形成了多种不同的体色表型，使其成为研究两栖动物体色多态性和分子遗传机制的优良材料。然而目前关于大鲵体色的研究十分有限，在染色体组操作技术、选择育种、功能基因等方面尚属空白。同时，大鲵种群存在一定的种质退化问题，缺少高性能的养殖新品种或新品系。考虑到大鲵具有重要的理论研究和社会经济价值，利用分子标记技术培育大鲵不同体色新品种或新品系已势在必行。
4.酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrp1)基因编码的活性蛋白为5,6二羟基吲哚2-羧酸氧化酶，是一种在人的着色性黑色素细胞和黑色素瘤的黑素体中表达的一种丰富的细胞内糖蛋白，其不仅能催化底物反应，还可作为酪氨酸酶的分子伴侣而稳定其活性，是黑色素合成下游途径中的关键基因。研究表明，tyrp1基因的突变或酶的失活，会影响黑色素小体的成熟和黑色素细胞的增殖与凋亡，最终导致机体组织异常表达，使狗、马、小鼠及人类表现出肤色或发色变浅、出现色斑及条纹等异化特征(miller，1997；rieder，2001；biossy，2003；cargjll，2005)。然而针对大鲵这一稀有物种，tyrp1基因相关的分子遗传学研究较少。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种基于tyrp1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用。
6.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
7.一种基于tyrp1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用。
8.进一步地，tyrp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.进一步地，tyrp1基因编码的蛋白质序列如seq id no.2所示。
10.进一步地，tyrp1基因克隆引物的上下游序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
11.tyrp1基因采用实时荧光定量pcr技术在野生型大鲵不同组织中表达的应用。
12.进一步地，不同组织包括肌肉、皮肤、心脏、肝脏、脾、肺、胃、胰脏、生殖腺和肠道。
13.tyrp1基因采用实时荧光定量pcr技术在大鲵不同体色皮肤组织中的表达应用。
14.进一步地，大鲵不同体色皮肤包括黄色皮肤、黄底镶嵌黑色皮肤、黑底镶嵌黄色皮肤及灰色皮肤或虎斑色皮肤。
15.进一步地，tyrp1基因实时荧光定量pcr引物的上下游序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。
16.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
17.(1)经济效益
18.本发明利用snp分子标记技术分析体色性状相关基因的遗传多样性，进行候选基因snp位点与体色性状的关联性分析，为大鲵体色的定向选育提供有效的分子标记。在实际应用中，可以促进大鲵不同体色群体到品系的形成，进一步建立性状可稳定遗传的体色品系和新品种，解决大鲵种质退化问题，提供理论依据和指导作用，促进大鲵养殖产业健康蓬勃发展；故本发明不仅具有重要的理论和方法学意义，也有重要的生产应用价值。
19.(2)生态效益
20.本发明的实施不仅能有效的缓解中国大鲵这一珍稀两栖动物的生存压力，同时能为本地区水产养殖提供宝贵的种质资源及配套的技术支持，从而实现自然资源保护与社会经济发展协调统一。
21.(3)社会效益
22.本发明以不同体色大鲵为研究对象，参考国内外动物体色多样性研究领域获得的科研成果，利用科学的功能基因研究方法，选择可靠的候选基因，采用准确的snp分子标记技术，研究候选基因在不同特色大鲵群体中的遗传多样性；应用race技术对重要候选基因进行克隆，结合生物信息学方法，分析基因的dna序列特征，预测基因cds区编码的蛋白质序列的二级结构和三级结构；结合qrt-pcr技术，进行候选基因表达谱分析。不但有助于了解大鲵体色多样性形成的分子遗传基础，同时，有助于为大鲵体色的定向选育提供有效的分子标记。这些研究不但为进一步揭示大鲵体色多样性形成的遗传机制及细胞代谢机制奠定基础，且为非模式生物经济性状相关基因研究提供了可供参考的科学试验方法。
附图说明
23.图1为本发明的不同体色大鲵图(a：黄色为主色，简称黄色；b：黄色为主色，分布黑斑；c：黑色为主色，分布黄斑；d：黑色为主色，分布少量黄斑；e：野生型体色：灰色或虎斑色)。
24.图2为本发明的tyrp1基因pcr扩增产物m：dna marker(dl2000)；1：tyrp1基因克隆图。
25.图3为本发明的6个物种的tyrp1 cds区核苷酸序列比对图。
26.图4为本发明的中国大鲵tyrp1基因编码蛋白分子结构特征预测图。
27.图5为本发明的tyrp1基因在不同组织中的相对表达量图。
28.图6为本发明的tyrp1基因在不同体色大鲵皮肤组织中的相对表达量图。
29.图7为本发明的不同体色个体tyrp1基因序列比对图。
30.图8为本发明的不同体色皮肤组织tyrp1蛋白序列序列比对图
31.图9为本发明的tyrp1基因实时定量扩增曲线图。
32.图10为本发明的tyrp1基因溶解曲线图。
具体实施方式
33.本发明提供了一种基于tyrp1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用。
34.本发明以中国大鲵皮肤组织为材料，对其中的tyrp1基因进行了克隆，并通过多种生物信息学分析软件，对该基因cds区核苷酸序列及其编码的蛋白质序列进行序列特征分析。能够从分子层次上了解该基因的结构特点，为进一步研究该基因功能提供理论依据。同时，采用实时荧光定量pcr技术，检测并分析了tyrp1基因在不同体色表型皮肤组织中的表达量，以及其在大鲵不同组织中表达谱分析，为进一步揭示该基因的生物学功能奠定试验基础。
35.1.主要材料和试剂
36.(1)主要仪器和设备
37.液氮生物容器四川金凤
38.dyy-lll稳压仪北京六一仪器厂
39.通风橱杨凌天工
40.超净工作台北京长城空气净化设备厂
41.超低温冰箱thermo
42.自动高压灭菌锅tomy55-325
43.可调式微量移液器，eppendorf
44.台式超速低温离心机eppendorf
45.台式超速常温离心机eppendorf
46.ddy-zc水平电泳仪北京六一仪器厂
47.凝胶成像系统trans-illuminator2020d united bio-rad
48.恒温水浴锅常州国华电器有限公司
49.去离子水超纯水系统thermo
50.恒温水浴循环系统thermo
51.紫外分光光度计德国beckman公司
52.icycler iq5 tm实时荧光定量pcr仪美国bio-rad公司
53.pcr仪美国bio-rad公司
54.电转化仪美国bio-rad公司
55.(2)主要试剂
56.trizol reagent美国invitrogen公司
57.rnase-free dnaⅰ大连宝生物公司
58.taqdna polymerase加拿大fermentas公司
59.氨苄青霉素
60.x-gal
61.iptg
62.(3)试剂盒
63.revertaid cdna synthesize kit加拿大fermentas公司
64.sybr green qpcr master mix德国roche公司
65.pcr产物纯化试剂盒axygen公司
66.质粒提取试剂盒百泰克公司
67.(4)载体及菌株：
68.vector systemⅰ美国invertrogen公司
69.大肠杆菌dh5α本实验室保存
70.2.材料与方法：
71.试验动物与样品采集
72.(1)选取体色为野生型的成年商品大鲵3只(两公一母)，将其宰杀后立即取其肌肉、皮肤、心脏、肝脏、脾、肺、胃、肠、胰脏、生殖腺(卵巢/精巢)等10个组织样品，-80℃冷冻保存备用。
73.(2)选取体色为黄色(黄色站体表面积》90％，见图1中a)，以下简称yl；黄色为基础体色，体表分布少量黑色斑纹(黄色站体表面积50-90％，见图1中b)，以下简称y(b)；黑色为基础体色，体表分布较多黄色斑块(黄色站体表面积10-50％，见图1中c)，以下简称b(y)；黑色为基础体色，体表分布少量黄色斑块(黄色站体表面积《10％，见图1中d)，以下简称b(sy)；野生型体色(见图1中e)，以下简称gy。以上体色大鲵共15只，分别手术法采集其尾部皮肤组织约0.5cm2左右，采样结束后进行伤口清洗并涂抹碘伏消毒液(安捷高科，中国山东)。
74.实施例1：
75.tyrp1基因克隆、测序
76.1》rna提取
77.使用rneasy mini kit提取大鲵皮肤组织总rna，整个过程严格遵守rna操作的全部注意事项。除特殊说明外，各步骤均为室温操作。
78.2》cdna第一链合成
79.用revertaid cdna synthesize kit对总rna进行反转录。除特殊说明外，以下各步骤均为冰上操作。
80.(1)在rnase-free 0.5μl离心管中，加入总rna 2μg(2-4μl)，oligodt(18)引物1μl，加depc处理水至12μl。
81.(2)65℃温育5min，冰上冷却，瞬时离心。
82.(3)加入以下组分：5
×
buffer 2μl，rnase抑制剂1μl，10mm dntp mix 1μl，反转录酶1μl。
83.瞬时离心，进行pcr反应，反应程序为：42℃，60min，70℃，2min。于-20℃保存反转录产物备用。
84.3》引物设计与合成
85.参考中国大鲵tyrp1基因的相关序列，使用primerquest(http://sg.idtdna.com/primerquest/home/indexprimer)软件设计pcr及qrt-pcr引物，相关信息见表1。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。
86.表1 tyrp1基因克隆引物及其与内参基因实时荧光定量引物
[0087][0088]
注：p1：tyrp1基因克隆引物；p2：tyrp1基因实时荧光定量pcr引物；p3：gapdh基因实时荧光定量pcr引物。
[0089]
4》目的基因的pcr扩增
[0090]
pcr反应体系为25μl：2.5μl 10
×
taqbuffer，2.5mm mgci2，2.5mm dntp，1u taqdna polymerase(加拿大fermentas公司)，10μm上游引物和下游引物。tyrp1基因pcr反应程序：94℃预变性4min，35个循环(94℃，30s，65℃，60s，72℃，120s，72℃延伸10min)。
[0091]
5》目的基因pcr产物的纯化
[0092]
pcr产物经胶回收试剂盒纯化。
[0093]
(1)pcr扩增产物中加入3倍体积的pcr-a，不足100μl，补至100μl，涡旋混匀。
[0094]
(2)将吸附柱放入2ml离心管，将上述反应液加入柱中，12000rpm离心1min。
[0095]
(3)弃流出液，柱中加入700μl缓冲液w2(试剂盒自带)，12000rpm离心1min。
[0096]
(4)弃流出液，柱中加入400μl缓冲液w2(试剂盒自带)，12000rpm离心1min。
[0097]
(5)将吸附柱放入新的1.5ml离心管中，吸附膜中央加入25-30ml洗脱液eb(65℃预热)，室温静置1min，12000rpm离心1min，收集流出液，-20℃保存备用。
[0098]
6》pcr产物与pemg-teasy载体的连接
[0099]
(1)将纯化的二次pcr扩增产物及载体，简短离心，涡旋2
×
快速连接缓冲液。
[0100]
(2)添加以下组分：
[0101][0102]
吸打混匀，16℃连接过夜。
[0103]
7》大肠杆菌(dh5α)感受态细胞的制备
[0104]
(1)挑取经平板培养的大肠杆菌(dh5α)单个菌落接种于5ml液体lb培养基中，37℃，220rpm振荡过夜培养。
[0105]
(2)以1:50的比例，取适量菌液于装有lb培养基锥形瓶中，37℃，220rpm振荡扩大培养。
[0106]
(3)当菌液od600达到0.5-0.6时(约需2-3h)，将菌液置于冰上，缓慢摇动使其充分冷却。
[0107]
(4)将冷却的菌液分装至预冷过的50ml离心管中，4℃，5000rpm离心10min，收集管底菌体细胞，菌液较多时，可重复集菌。
[0108]
(5)弃上清液，加入30ml预冷的灭菌去离子水，轻轻吹打菌液，使其悬浮，4℃，5000rpm离心10min。
[0109]
(6)重复(5)中操作一次。
[0110]
(7)弃上清液，加入30ml预冷的10％甘油，轻轻吹打菌液，使其悬浮，4℃，5000rpm离心10min。
[0111]
(8)重复(7)中操作一次。
[0112]
(9)弃上清液，加入适量10％甘油，轻轻吹打，悬浮菌液。分装至1.5ml离心管中，-70℃保存备用。
[0113]
8》连接产物的转化(电转化法)
[0114]
使用电转化法转化连接产物。除特殊说明外，各步骤均为冰上操作。
[0115]
(1)从-70℃冰箱取出感受态细胞，冰上解冻。
[0116]
(2)将4.5μl连接产物缓慢加入感受态细胞中，吸打混匀。
[0117]
(3)取出预冷的电转化杯，将步骤(2)中的混合物吸入电转化杯中，使其位于电极之间。
[0118]
(4)仔细将电极杯两侧及底部快速擦干，放入电转化仪。选择或设置合适的电击程序(电压2500伏)，进行电击转化。
[0119]
(5)在电转化杯中加入约200μl lb液体培养基，吹打数次，用移液器将培养基和转化产物吸出，加入装有lb液体培养基的1.5ml离心管中，37℃，150rpm振荡培养1h，复苏细胞。
[0120]
9》阳性克隆的筛选
[0121]
按配方配置固体(sb)培养基，高压灭菌处理后，加入氨苄青霉素，倒板(厚度约3mm)，待其凝固后，在表面均匀地涂抹x-gal(40μl)和iptg(7μl)，静置1h，备用。
[0122]
(1)电击转化菌液200μl，涂板。
[0123]
(2)将涂好的培养皿正面朝上放置，37℃培养约1h后，倒置培养过夜。
[0124]
(3)将培养皿放入4℃冰箱，待显色完全后，挑取阳性克隆。
[0125]
(4)随机挑选长势良好的白色单菌落，在装有lb培养基的1.5ml离心管中，37℃，220rpm振荡扩大培养。共挑阳性克隆约3000个左右。
[0126]
10》质粒提取
[0127]
使用质粒提取试剂盒提取质粒。
[0128]
(1)取1.5ml菌液，10000rpm离心1min，弃上清。重复一次。
[0129]
(2)加入250μl溶液i(试剂盒自带)，吹打悬浮沉淀至无明显可见的细胞。
[0130]
(3)加入250μl溶液ⅱ(试剂盒自带)，混合均匀至反应液清亮，静置2min。
[0131]
(4)加入350μl溶液ⅲ(试剂盒自带)，颠倒离心管至出现白色沉淀。
[0132]
(5)13000rpm离心10min。
[0133]
(6)将上清液转移至离心柱中，室温10000rpm离心1min。
[0134]
(7)弃流出液，加入500μl hb缓冲液，10000rpm离心1min，以去除残留的蛋白质。
[0135]
(8)弃流出液，加入700μl洗脱缓冲液，10000rpm离心1min，弃流出液。
[0136]
(9)重复步骤(8)一次。
[0137]
(10)13000rpm离心2min。
[0138]
(11)将离心柱放入一新离心管中，加入40μl溶解缓冲液，静置2min，13000rpm离心1min，将质粒沉淀到管底。
[0139]
11》酶切鉴定
[0140]
使用ecorⅰ酶酶切鉴定质粒提取物。
[0141]
12》测序
[0142]
选择酶切鉴定正确的质粒，送南京金斯瑞生物科技公司测序。
[0143]
13》tyrp1基因cds区生物信息学分析
[0144]
表2生物信息学软件及其功能
[0145][0146]
实施例2：
[0147]
实时定量荧光pcr分析tyrp1基因在大鲵的不同组织中表达
[0148]
1》总rna提取及反转录
[0149]
用tizol一步法分别提取大鲵肌肉、皮肤、心脏、肝脏、脾、肺、胃、胰脏、肾脏、生殖腺(卵巢/精巢)、肠道组织总rna并反转录为cdna，具体实验步骤同实施例1。
[0150]
2》引物设计与合成
[0151]
使用测序所得中国大鲵tyrp1基因cds区序列，使用primerquest(http://sg.idtdna.com/primerquest/home/indexprimer)在线软件设计实时荧光定量引物，其相关信息见表1。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。
[0152]
3》反应体系及条件
[0153]
反应体系为：每个pcr反应管中加入1μl cdna，10nm/μl dntp 1μl，目的基因上游引物和下游引物各0.75μl，sybr green qpcr master mix(德国roche公司)14.5
μl。pcr反应程序为：40个循环(94℃，1min；94℃，18s；62℃，18s；72℃，20s)，85℃读板。以gapdh作为内参基因，并有一个不加模板的反应作为空白对照，每个反应设置三次重复。
[0154]
4》试验数据分析
[0155]
使用excel软件对试验数据进行分析，以各目的基因的ct值减掉相应gapdh的ct值，得出目的基因的δct，使用power(2，-δδct)公式计算目的基因的相对表达量。用spss17.0软件对试验数据进行分析。试验结果以“平均数
±
标准误”表示。
[0156]
实施例3：
[0157]
实时定量荧光pcr分析tyrp1基因在不同体色大鲵尾部皮肤组织中的表达
[0158]
1》总rna提取及反转录
[0159]
用tizol一步法分别提取体色为yl、y(b)、b(y)、b(sy)和gy的大鲵尾部皮肤组织总rna并反转录为cdna，具体实验步骤同实施例1。
[0160]
2》引物设计与合成
[0161]
同实施例1。
[0162]
3》反应体系及条件
[0163]
同实施例1。
[0164]
4》试验数据分析
[0165]
同实施例1。
[0166]
实施例4：
[0167]
tyrp1基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，snp)分析
[0168]
总rna提取及反转录同实施例1。
[0169]
引物设计与合成同实施例1。
[0170]
目的基因的pcr扩增同实施例1。
[0171]
目的基因pcr产物的纯化同实施例1。
[0172]
pcr产物与pemg-teasy载体的连接同实施例1。
[0173]
大肠杆菌(dh5α)感受态细胞的制备同实施例1。
[0174]
连接产物的转化(电转化法)同实施例1。
[0175]
阳性克隆的筛选同实施例1。
[0176]
质粒提取同实施例1。
[0177]
酶切鉴定同实施例1。
[0178]
测序同实施例1。
[0179]
序列比对同实施例1。
[0180]
使用bioedit软件对测序所得序列进行同源性比对，找出该基因的snp位点，结合序列对应的体色类型，分析snp位点与体色之间的对应关系。
[0181]
结果与分析：
[0182]
大鲵皮肤组织总rna提取及检测同实施例1。
[0183]
tyrp1基因pcr扩增与克隆、测序：
[0184]
以皮肤组织cdna为模板，用设计的tyrp1基因引物进行touchdown pcr扩增(图2)。结果显示pcr产物与预期片段一致。将tyrp1基因扩增产物测序。
[0185]
tyrp1基因序列及其生物信息学分析：
[0186]
1》tyrp1基因序列特征
[0187]
使用orf finder分析中国大鲵的tyrp1基因序列结构，发现该基因的cds序列长1584bp。tyrp1基因cds区核苷酸序列(seq id no.1)如下。
[0188]
tyrp1基因cds区核苷酸序列(长度：1584bp)：
[0189]
atgctgcttccttggctgacgctgctgcttctggcaccaatggcgcggactcagttcccgcggcagtgcgtgaccgcagaggagctgcgcagcggccagtgctgccctggccttttcccagcgctgaccccggacccgtcggaccgctgcggggcctcggtgggacgcggcctctgcgcacaggtgcaggccgactcccggcctcacgggccccagtacccgcacgatgggctcgacgaccgcgagctctggccccgccgcttcttcaaccgctcctgcctctgcgcccgcaacttctatggctacaactgcggctcctgccggtccggctggaccggggccaactgcgaccaaagggtggtggcggtcaggaggaacgttttggaactaagcattcaggaaaggcgccactttatcaatgctttggatatggctaagagaactgtacatcctcattatgtaatcgcttcacggagatatgcagagataatgggaccagatggcaacaccacccggtttgagaatgtatccatttacaactactttgtctggactcactattattctgtcagcaagaccttcctcggtcaaggacaagagagctttgggggaatagacttctctcacgaagggccagcatttctcacttggcacaggtaccacctgctgcatctggaaagggatatgcaggaaatgcttcaggatcccacctttgctcttccatattggaattttgccattggtggcaataactgtgacatttgcacagatgacttcatgggggctcggagcaactttgactctactctgttaagttccaactctgtattttctgaatggcaaattatttgtgaaagcatagaagaatatgattccttgggaacaatttgtaacagtacagagggtgggccaattcgaaggaaccctgctgggaatgtagccaggcctatggtgcagcgtctacctgaaccacaagatgttgctctctgcttggaagttggtttatttgacacacctccttattattctaattcttcagaaagctttcgtaatacagttgaagggtacagtgatccttctggaaaatatgatccttcagttcgaagccttcataacttggctcacctgtttctgaatggaactggaggacaaactcacgtgtctccgaatgatcctatttttgttcttctacacacatttaccgatgctgtgtttgatgaatggctgagaagacacagtgctgatgttacactttacccacttgagaatgcccctattggacataacaggcagtacaacatggtaccattctggcctcctgttaccaataatgagatgtttgttactgcaccagagaacctgggatatgcatatgaagtccagtggccaagccgtgctctgaatgccactgaaatcataactatcaccattgtggccgctcttgtcgcggttgctgttatctttgctgctgcttcttgtggtgttcattgcaggaaaaaagatgatcttcaccagcctcttcttggtgagaaatatccccggtactctgacgaatatgaagaggatgcaaatcaatctgtatga。
[0190]
2》tyrp1基因cds区序列的同源性分析：
[0191]
采用ncbi数据库中blastn程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行中国大鲵tyrp1序列同源比对，结果显示中国大鲵tyrp1与美西钝口螈(genebank登录号：af064803.1)、西部锦龟(genebank登录号：xm_005295200.2)、绿海龟(genebank登录号：xm_007053423.1)、白领姬鹟(genebank登录号：xm_005061644.1)及牛(genebank登录号：af400250.1)核苷酸序列同源性分别为82％、78％、78％、76％、78％。与美西钝口螈(genebank登录号：p55027.2)、绿海龟(genebank登录号：xp_007053485.1)、西部锦龟(genebank登录号：xp_005295256.1)、中华鳖(genebank登录号：xp_006117908.1)、非洲爪蟾(genebank登录号：np_001080492.1)及美国短吻鳄(genebank登录号：xp_006258332.1)氨基酸序列同源性分别为86％、77％、78％、78％、76％、76％。
[0192]
使用blustal w程序对中国大鲵tyrp1基因cds区核苷酸序列与美西钝口螈(genebank登录号：af064803.1)、西部锦龟(genebank登录号：xm_005295200.2)、绿海龟(genebank登录号：xm_007053423.1)、白领姬鹟(genebank登录号：xm_005061644.1)及牛(genebank登录号：af400250.1)的核苷酸序列进行多重序列比对(见图3)。
[0193]
3》tyrp1基因编码蛋白氨基酸序列功能结构域预测
[0194]
利用smart(http://smart.embl-heidelberg.de/)对蛋白质的结构域进行预测，结果表明中国大鲵tyrp1基因cds部分序列编码的527个氨基酸残基,包括酪氨酸酶(177-411氨基酸)等保守功能结构域(见图4)。
[0195]
tyrp1基因编码蛋白序列(seq id no.2)(527个氨基酸)：
[0196]
mllpwltllllapmartqfprqcvtaeelrsgqccpglfpaltpdpsdrcgasvgrglcaqvqadsrphgpqyphdglddrelwprrffnrsclcarnfygyncgscrsgwtgancdqrvvavrrnvlelsiqerrhfinaldmakrtvhphyviasrryaeimgpdgnttrfenvsiynyfvwthyysvsktflgqgqesfggidfshegpafltwhryhllhlerdmqemlqdptfalpywnfaiggnncdictddfmgarsnfdstllssnsvfsewqiicesieeydslgticnsteggpirrnpagnvarpmvqrlpepqdvalclevglfdtppyysnssesfrntvegysdpsgkydpsvrslhnlahlflngtggqthvspndpifvllhtftdavfdewlrrhsadvtlyplenapighnrqynmvpfwppvtnnemfvtapenlgyayevqwpsralnateiititivaalvavavifaaascgvhcrkkddlhqpllgekyprysdeyeedanqsv。
[0197]
表3核酸编码表
[0198][0199]
4》tyrp1基因表达谱分析
[0200]
实时定量结果显示(见图5)，tyrp1基因在皮肤组织中mrna的表达量最高(0.007967
±
0.001328),在性腺、胰腺、心脏、胃、脾脏、肠、肺、肝脏、肌肉组织中的表达量依次递减，分别为0.002893
±
0.000482、0.000124
±
2.06e-05、4.81e-05
±
8.02e-06、1.85e-06
±
3.09e-07、1.18e-06
±
1.97e-07、9.47e-07
±
1.58e-07、4.75e-07
±
7.91e-08、2.25e-07
±
3.75e-08、3.45e-08
±
5.75e-09，且与皮肤组织中的表达量差异极显著(p《0.01)。tyrp1基因实时定量扩增曲线及相关的原始数据见图9，溶解曲线及相关的原始数据见图
10。
[0201]
5》不同体色皮肤组织中tyrp1基因mrna表达量分析
[0202]
实时定量结果显示(见图6)，tyrp1基因在b(y)型体色大鲵皮肤组织中mrna的表达量最高(0.014285
±
0.003571),其次为b(sy)型体色，tyrp1基因mrna的表达量为(0.009822
±
0.001637)，y(b)型和gy型体色皮肤组织中tyrp1基因mrna的表达量分别为0.003877
±
0.000646、0.003447
±
0.000431，yl型体色皮肤组织中tyrp1基因的表达量最低，为0.003192
±
0.000532。各数据之间的差异显著性检验结果见图6。tyrp1基因实时定量扩增曲线及相关的原始数据见图9，溶解曲线及相关的原始数据见图10。
[0203]
6》tyrp1基因单核苷酸多态分析
[0204]
本发明扩增了大鲵灰色皮肤、黄底镶嵌黑色皮肤，黑底镶嵌黄色皮肤、黄色个体皮肤组织中tyrp1基因共1811bp(包括cds区1584bp)的核苷酸序列，利用blustal w程序对获得序列进行多重序列比对，结果见图7。结果显示不同体色大鲵个体tyrp1核苷酸序列基本一致，发生在黄色体色个体的tyrp1存在2个核苷酸插入位点，导致氨基酸序列中断(见图8)。
[0205]
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种基于tyrp1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述tyrp1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述tyrp1基因编码的蛋白质序列如seq id no.2所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述tyrp1基因克隆引物的上下游序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。5.tyrp1基因采用实时荧光定量pcr（qrt-pcr）技术在野生型大鲵不同组织中表达的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述不同组织包括肌肉、皮肤、心脏、肝脏、脾、肺、胃、胰脏、生殖腺和肠道。7.tyrp1基因采用实时荧光定量pcr技术在大鲵不同体色皮肤组织中的表达应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述大鲵不同体色皮肤包括黄色皮肤、黄底镶嵌黑色皮肤、黑底镶嵌黄色皮肤及灰色皮肤或虎斑色皮肤。9.根据权利要求5或7所述的应用，其特征在于：所述tyrp1基因实时荧光定量pcr引物的上下游序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。

技术总结
本发明公开了一种基于TYRP1基因的分子标记在大鲵体色选育中的应用，首次克隆大鲵TYRP1基因编码区核苷酸序列，全长1584bp，编码527个氨基酸残基，包括一个酪氨酸酶（177-411氨基酸）功能结构域；采用实时荧光定量PCR技术检测TYRP1基因在野生型大鲵体色不同组织及不同体色皮肤组织中的表达谱差异；对比不同体色TYRP1基因CDS区全序列，发现黄色体色个体的TYRP1基因存在2个核苷酸插入位点，导致译码框发生变化，氨基酸序列中断。本发明为大鲵体色的定向选育提供了有效的分子标记，为体色多样性形成的分子遗传基础及细胞代谢机制研究提供方法，有助于大鲵新品系选育，解决大鲵种质退化问题。退化问题。退化问题。


技术研发人员：邓捷 姜维 张红星 王启军 赵虎 孔飞 张晗 马红英
受保护的技术使用者：陕西省动物研究所
技术研发日：2022.01.17
技术公布日：2022/3/8