一种用于选择性对抗炎性细胞的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及其制备方法和应用

1.本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种用于选择性对抗炎性细胞的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子。


背景技术：

2.炎症性疾病(inflammatory bowel disease,ibd)是一种消化系统疾病，大致分为两类：溃疡性结肠炎和克罗恩病，可以累及整个消化道，主要是回肠、结肠和盲肠炎症。发病机制及发病原因到目前尚不明确，其主要症状表现为持续性腹泻、体重下降、疲劳、便血和腹部疼痛。ibd通常被认为是由遗传易感性、肠道免疫异常、菌群失调和环境等多因素相互作用而造成的慢性、易复发性疾病。而随着国民经济的提升和国民生活方式的逐渐西化，近年来我国的炎症性肠病的病例数不断的攀升。尽管ibd直接导致的死亡人数不多，但ibd慢性且易复发性的特点会严重影响患者的生活质量，不仅如此，这种肠部炎症刺激会增加病人罹患血栓、关节炎症、原发性胆管炎等并发症的风险，给患者家庭及社会造成严重的经济压力和医疗负担。截止到目前，临床上尚未出现能够彻底治愈ibd的药物，大多数用于一线治疗的药物如5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid,5-asa)主要用于患者症状缓解但无法实现根治，并且长期服用存在导致患者恶心、呕吐、结肠炎症状加剧及肝肾毒性等副作用的风险。因此，开发一种安全、有效的ibd治疗策略具有重要的研究价值。
3.自从1985年报道日本学者首次采用葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium,dss)制备出仓鼠溃疡性结肠炎模型后，已有大量数据证明dss结肠炎模型的病因、临床症状、病理改变及治疗应答均与人类溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)相似。因此，dss结肠炎模型对于研究uc病因、发病机制及肿瘤疾病，成为了一种很重要治疗手段，也是目前应用最为广泛的uc模型之一。
4.氯喹最早作为一种价格低廉的抗疟疾药物广泛应用于临床，在临床上的应用主要是类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮等自身免疫疾病的治疗。此外，氯喹已被证明具有抗癌活性或预防作用，并且作为一种熟知的自噬抑制剂，可以使得p62蛋白含量积累。令人惊喜的是，近年来越来越多的研究表明，氯喹还有着较强的抗炎能力，并且在很多已知的炎症模型中都起到了较好的效果。但其在临床上因为毒副作用较大，用药时间和剂量较大，所以亟需开发一种具有优异性质的载体将其搭载并运送到作用部位。
5.而目前针对于炎症性疾病，纳米载体被广泛应用于搭载药物去发挥不同作用，不同的研究人员和实验室也开发了各种各样的纳米粒子用于治疗。但是传统纳米粒子有着成本高昂、代谢困难、生物安全性等难以保障的问题，而牛血清白蛋白(bsa)去溶后交联制备的纳米粒子是一种很有前途的药物载体。牛血清白蛋白(bsa)是一种无毒、可生物降解、生物相容性好、价格低廉的蛋白质，广泛应用于药物缓释系统。而经过乙醇去溶法制备的变性白蛋白纳米粒子仍然拥有良好的生物相容性，且研究报告发现，这种纳米粒子可以被炎症部位的巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞高效率内化，这使得其在特异性靶向方面有着很
深的潜力。于是这让本发明可以便于搭载氯喹药物针对于结肠部位的巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞进行特异性输送，从而通过抑制这些细胞自噬造成p62蛋白的积累再进一步的减少炎症因子的释放，从而达到一个治疗结肠炎的目的。


技术实现要素：

6.为解决由葡聚糖硫酸钠引起的结肠炎疾病以及传统纳米粒子成本高昂、代谢困难、生物安全性难以保障等问题，本发明构建了一种用于选择性对抗炎性细胞的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子，并将其应用于由葡聚糖硫酸钠dss引起的结肠炎疾病治疗。
7.本发明为解决技术问题，采取如下技术方案：
8.本发明首先公开了一种用于选择性对抗炎性细胞的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子，其特点在于：所述包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子是以变性白蛋白纳米粒子为载体，包裹有药物氯喹，其水合粒径为50～150nm。
9.本发明的所述包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的制备方法为：
10.将80mg牛血清白蛋白溶解于4ml去离子水中，获得浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白的溶液；将16mg氯喹溶解于320μl二甲亚砜中，获得浓度为50mg/ml的氯喹溶液；在牛血清白蛋白溶液中加入氯喹溶液，然后室温下搅拌反应10-20min；之后再逐滴滴加14ml无水乙醇，滴加完成后在室温下搅拌反应1h，再加入320μl质量浓度为2％的戊二醛溶液，避光反应12-24h：对所得产物进行离心(离心温度为4℃)、水洗，即获得包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子。
11.本发明所制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子具有显著减轻由葡聚糖硫酸钠引起的结肠炎的功能，且对哺乳动物细胞无显著毒性，具有良好的生物安全性，可用于制备对抗由葡聚糖硫酸钠引起的结肠炎的有效抗炎制剂。
12.本发明所述的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子用于选择性对抗结肠部位中的炎性细胞的实现机理是：在由dss诱导的炎症性肠病疾病模型中，结肠部位会主动招募巨噬细胞和中性粒细胞等炎性细胞来对抗炎症因子水平升高等情况的产生，而所合成的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子可以有效地被巨噬细胞和中性粒细胞所内化，这就可以让本发明所合成的纳米粒子能够较为高效的到达炎症部位。当变性白蛋白包裹氯喹到达炎症部位时，一方面氯喹药物可以通过降低炎症因子的水平，抑制炎症小体的产生从而减缓炎症，从而达到缓解治疗的结果。另一方面氯喹药物作为一种熟知的自噬抑制剂，还可以通过抑制结肠部位的巨噬细胞自噬，使得p62蛋白含量增多，从而抑制巨噬细胞分泌炎症因子来达到治疗炎症的效果。总而言之，氯喹是一种廉价且有效地治疗结肠炎的药物，而变性白蛋白纳米粒子又是一种良好安全的载体系统。
13.本发明的有益效果体现在：
14.1、本发明包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子具有良好的稳定性及其生物相容性。氯喹是一种廉价且有效地治疗结肠炎的药物，而变性白蛋白纳米粒子又是一种良好安全的载体系统，从而提高了临床应用的安全性；同时炎症部位的巨噬细胞和中性粒细胞对变性白蛋白纳米粒子的高效摄取实现了材料在炎症部位的高效性富集。
15.2、本发明包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子用于对抗dss诱导结肠炎，显著提高了传统氯喹药物的抗炎性能，并显著降低了药物浓度用量。
16.3、本发明包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的制备过程简单、条件温和，具有大规模生产的可能，具有工业和实际应用的潜力。
17.4、本发明所使用的材料具有很好的生物相容性，对人体无直接或间接毒害作用，无潜在毒性。
18.5、本发明包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子具有良好的分散性和稳定性，有利于临床使用。
附图说明
19.图1为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的透射电镜图。
20.图2为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的扫描电镜图。
21.图3为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的水合粒径图。
22.图4为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹的紫外-可见光吸收光谱图。
23.图5为实施例1制备的不同质量比的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的包封率。
24.图6为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的药物释放曲线图。
25.图7为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子在不同溶剂中的7天稳定性图。
26.图8为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的体外溶血性能测试图。
27.图9为构建dss诱导结肠炎模型的流程示意图。
28.图10为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠体重变化曲线图。
29.图11为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠疾病活性指数变化曲线图。
30.图12为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠结肠照片图。
31.图13为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠结肠长度图。
32.图14为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠结肠苏木精-伊红染色切片图。
33.图15为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠结肠il-1β免疫组化染色图。
34.图16为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠结肠il-6免疫组化染色图。
35.图17为实施例1制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹，对dss处理和水处理后的balb/c雌性小鼠结肠tnf-α免疫组化染色图。
具体实施方式
36.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发
明的具体实施方式做详细的说明。以下内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
37.实施例1
38.本实施例按如下方法制备包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子：
39.将80mg牛血清白蛋白溶解于4ml去离子水中，获得浓度为20mg/ml的牛血清白蛋白的溶液；将16mg氯喹溶解于320μl二甲亚砜中，获得浓度为50mg/ml的氯喹溶液；在牛血清白蛋白溶液中加入氯喹溶液，然后室温下以1600rpm的搅拌速度搅拌反应15min；之后再逐滴滴加14ml无水乙醇，滴加完成后在室温下以600rpm的搅拌速度搅拌反应1h，再加入320μl质量浓度为2％的戊二醛溶液，避光反应12h：对所得产物进行离心(离心温度为4℃、18000-20000g转速)、水洗，即获得包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子。
40.图1和图2分别为本实施例制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的透射电镜图和扫描电镜图，从图中可以看到该纳米粒子呈现球形状态且直径为50～150nm。
41.图3为本实施例制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的水合粒径图，从图中可以看到：纳米粒子的水合粒径大概在85nm左右且分散性良好，大多数纳米粒子的粒径都集中50-150nm之间。
42.图4为本实施例制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子(bsa-chloroquine)与不包裹氯喹的变性白蛋白包裹纳米粒子(bsa)及氯喹(chloroquine)的紫外-可见光吸收光谱图。其表征方法为：分别配置三种样品的溶液：包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的bsa含量为20mg/ml，氯喹当量为400μg/ml；不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的bsa含量为20mg/ml；游离氯喹含量为400μg/ml；各取3ml加入紫外样品池中并测试其紫外-可见吸收光谱图。从图中可以看出包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子在300-400nm处显示出明显的吸收峰，这与单一氯喹在300-400nm处出现的吸收峰的位置重合，证实了氯喹成功的被变性白蛋白纳米粒子所包裹。
43.图5为本实施例中牛血清白蛋白与氯喹按照不同质量比所制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的包封率。其表征方法为：配置不同质量比所得纳米粒子的溶液与不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的溶液(bsa含量均为20mg/ml)，各取3ml并测试其紫外-可见吸收光谱图，以不包裹氯喹的纳米粒子溶液作为基线，取340nm处的吸收值代入氯喹的标准曲线即可求得不同质量比所得纳米粒子的包封率。从图中可以看出，牛血清白蛋白与氯喹的质量比为5：1时有着最好的包封率。
44.图6为本实施例所制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的药物释放曲线图，其表征方法为：取2ml氯喹当量为400μg/ml的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子(bsa-chl)与游离氯喹(chloroquine)(400μg/ml)的水分散液加入到分子量为1000mw的透析袋中，分别在透析袋外围加入30mlph＝7.4或ph＝5的pbs缓冲溶液(游离氯喹的透析袋外围加入ph＝7.4的缓冲溶液)于37℃的摇床下孵育，并在多个时间点测试其紫外-可见光吸收光谱，取340nm的吸收值代入氯喹浓度标准曲线来进行量化。从图中可以看到经过变性白蛋白包裹的氯喹有着缓释的作用，在ph为5的pbs介质下最大药物释放量会增加。
45.图7为本实施例所制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子在不同介质下(水、ph＝
7.4的pbs缓冲溶液及高糖培养基dmem)的7天稳定性图，其表征方法为：将所制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子分散在不同介质下并置于常温储存，每隔一天利用激光粒度仪测试其尺寸。从图中可以看出所制备的纳米粒子稳定性良好，在水分散条件下保持稳定，尺寸基本不变。
46.图8为本实施例所制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的体外溶血性能测试图，其表征方法为：将纳米粒子水分散液稀释至25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、800μg/ml的氯喹当量，将0.2ml上述不同浓度溶液分别与0.2ml处理后的血液(500μl新鲜血液加入4.5ml生理盐水离心洗涤5～8次，离心转速3000rpm、离心时间为10min，至血液上清液清澈透明后，弃去上清液，用生理盐水定容至5ml)及0.6ml生理盐水混合37℃孵育4h，之后3000rpm离心10min，吸取上清液测od541 nm处的吸光值，计算溶血率。从图中可以看出不同浓度纳米粒子的溶血率均低于5％，表明材料的生物相容性良好。
47.为验证本实施例所制备的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子对由dss诱导的结肠炎的治疗效果，建立如下dss模型：将50只balb/c雌性小鼠分成五组：
①
正常对照组pbs+water：为静脉注射ph＝7.4的pbs缓冲溶液，全程用水培养。
②
dss对照组pbs+dss：为静脉注射ph＝7.4的pbs缓冲溶液，在适应后一周用质量浓度为3％的dss水溶液培养一周。
③
空白载体对照组bsanps+dss：为静脉注射bsanps的pbs分散液(使用ph＝7.4的pbs缓冲溶液)，在适应后一周用质量浓度为3％的dss水溶液培养一周。
④
纳米粒子治疗组bsa-chl nps+dss：为静脉注射bsa-chl nps的pbs分散液(使用ph＝7.4的pbs缓冲溶液)，在适应后一周用质量浓度为3％的dss水溶液培养一周。
⑤
游离药物对照组free chl+dss：为静脉注射氯喹药物的pbs分散液(使用ph＝7.4的pbs缓冲溶液)，在适应后一周用质量浓度为3％的dss水溶液培养一周。以上每组均放置十只。将包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子、不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及氯喹在dss模型建立第7、9、11、13天尾静脉注射给药。
48.将100μl包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子(纳米粒子中的氯喹浓度当量是5mg/ml，此浓度是在每kg小鼠体重的体内注射25mg氯喹当量的纳米粒子)的pbs分散液、100μl游离氯喹(游离氯喹浓度是10mg/ml，此浓度是在每kg小鼠体重的体内注射50mg游离氯喹)的pbs分散液、100μl不包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子(bsa浓度与上述包裹药物的浓度一致)的pbs分散液在dss模型建立第7、9、11、13天给药。
49.通过各组别小鼠体重百分比变化来观察各实验组的老鼠生长情况，结果如图10所示。可以看到，正常小鼠的体重在16天内不断增加，而pbs+dss处理的小鼠有明显的体重减轻，包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的治疗使小鼠体重上升，这说明包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的治疗可以明显缓解典型的炎症症状。
50.通过各个组别小鼠疾病活性指数变化来观察各个实验组的老鼠生长情况。结果如图11所示，可以看到，正常小鼠的体重在16天内dai评分几乎没有变化，而pbs+dss处理的小鼠有明显的疾病活性指数上升，包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子使小鼠的疾病活性指数下降，这说明包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的治疗可以明显缓解典型的炎症症状。
51.在第16天对各个组别的老鼠进行解剖并分离结肠，通过拍摄各个组别的结肠直观照片。结果如图12所示，可以看到，pbs+dss组以及dss+bsanps结肠的缩短，经包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子治疗后结肠长度恢复至正常水平。
52.在第16天对各个组别的老鼠进行解剖并分离结肠，通过测量各个组别的结肠来观
察各个组别的结肠长度对比图。结果如图13所示，可以看到，pbs+dss组以及dss+bsanps结肠的缩短，相较于健康小鼠从9.2+0.2cm减少至7.6+0.2cm，经包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子治疗后结肠长度恢复至正常水平。
53.为进一步证明本实施例所得包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子对dss诱导的结肠炎的治疗效果，进行如下测试：在第16天对各个组别的老鼠进行解剖并分离结肠，对分离出的结肠组织块(一般厚度不超过0.5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，bouin氏固定液)使组织的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶，从而保持细胞本来的形态结构。
54.经过脱水透明，浸蜡包埋，进行切片与贴片，脱蜡，用苏木精-伊红染色、脱水透明、封固等步骤后制备成h&e切片，结果如图14所示，可以看到在结肠炎小鼠中(pbs+dss组和dss+bsanps组)可以观察到明显的结肠微结构的破坏和杯状细胞的破碎。
55.经过脱色、冲洗浸泡、敷抗体、显色、充分冲洗，复染，脱水，透明，封片等步骤制备成il-1β免疫组化切片，结果如图15所示，可以看到在结肠炎小鼠中(pbs+dss组和dss+bsanps组)的炎症因子的水平显著提升，显著比正常组和治疗组要高，这表明在dss诱导的结肠炎模型中具有较好的治疗能力。
56.经过脱色、冲洗浸泡、敷抗体、显色、充分冲洗，复染，脱水，透明，封片等步骤制备成il-6免疫组化切片，结果如图16所示，可以看到在结肠炎小鼠中(pbs+dss组和dss+bsa nps组)的炎症因子的水平显著提升，显著比正常组和治疗组要高，这表明在dss诱导的结肠炎模型中具有较好的治疗能力。
57.经过脱色、冲洗浸泡、敷抗体、显色、充分冲洗，复染，脱水，透明，封片等步骤制备成tnf-α免疫组化切片，结果如图17所示，可以看到在结肠炎小鼠中(pbs+dss组和dss+bsanps组)的炎症因子的水平显著提升显著比正常组和治疗组要高，这表明在dss诱导的结肠炎模型中具有较好的治疗能力。
58.以上仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于选择性对抗炎性细胞的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子，其特征在于：所述包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子是以变性白蛋白纳米粒子为载体，包裹有药物氯喹。2.根据权利要求1所述的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子，其特征在于：所述包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的水合粒径为50～150nm。3.一种权利要求1或2所述包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的制备方法，其特征在于：将牛血清白蛋白溶解于去离子水中，获得牛血清白蛋白溶液；将氯喹溶解于二甲亚砜中，获得氯喹溶液；在牛血清白蛋白溶液中加入氯喹溶液，然后室温下搅拌反应10-20min；之后再逐滴滴加无水乙醇，滴加完成后在室温下搅拌反应1h，再加入质量浓度为2％的戊二醛溶液，避光反应12-24h：对所得产物进行离心、水洗，即获得包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述牛血清白蛋白溶液的浓度为20mg/ml。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述氯喹溶液的浓度为50mg/ml。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述牛血清白蛋白与所述氯喹的质量比为5:1。7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述无水乙醇的体积与所述牛血清白蛋白的质量之比为14ml：80mg。8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述戊二醛溶液的体积与所述牛血清白蛋白的质量之比为320μl：80mg。9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述离心的温度为4℃。10.一种权利要求1～2中任意一项所述包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子的应用，其特征在于：用于制备对抗由葡聚糖硫酸钠引起的结肠炎的抗炎制剂。

技术总结
本发明公开了一种用于选择性对抗炎性细胞的包裹氯喹的变性白蛋白纳米粒子及其制备方法和应用，其是以变性白蛋白纳米粒子为载体，包裹有药物氯喹。本发明的纳米粒子具有良好的稳定性、生物相容性且能被巨噬细胞高效率内化，可有效地针对结肠部位的炎性细胞，从而减缓炎症以用于治疗由葡聚糖硫酸钠引起的结肠炎疾病。肠炎疾病。


技术研发人员：查正宝 马玉佩
受保护的技术使用者：合肥工业大学
技术研发日：2021.12.14
技术公布日：2022/3/8