一种三方益子膏中六种活性成分含量测定的方法

1.本发明涉及一种三方益子膏中活性成分的检测方法，具体的说是一种同时测定三方益子膏中六种活性成分的方法，属于医药技术领域。


背景技术：

2.中成药、保健食品等大健康产品作为一个整体，强调的是各味药的协同作用。中药(含保健食品)中单一有效成分或指标成分控制，难以真正控制药品质量，而采用多指标多成份的含量测定方法将成为中药未来质量控制方法的主流。三方益子膏是在中医药理论基础上，采用盐益智、盐补骨脂、乌药、金樱子、酒覆盆子、酒黄精、枸杞子、桑葚、芡实、酒苁蓉和炙甘草十一味药材所开发的复方中成药膏滋。其具暖肾祛寒、温脾养肝、缩尿止遗的功效，用于因脾肾阳虚、肝肾不足、膀胱气化无力所致夜尿症的治疗。其方是基于《校注妇人良方》中的缩泉丸、《洪氏集验方》中的水陆二仙丹、宋《圣济总录》中二精丸演绎出来的壮族民间验方，方由盐益智、盐补骨脂、乌药、金樱子等十一味药组成，方中益智仁味辛性温，能暖肾温脾，固精缩尿，补骨脂味辛苦温，能温肾助阳，纳气平喘，温脾止泻，盐炙能缓和辛窜湿燥之性，并可引药入肾，增强补肾健脾的作用，故二者共为君药。乌药辛温，能行气止痛，温肾散寒，能除膀胱和肾间冷气，止小便频数；金樱子味酸涩性平，能固精缩尿；覆盆子味甘酸性微温，能益肾固精缩尿，三药能收涩固肾、温下焦虚寒以辅助君药加强治疗肾虚之下元虚冷，共为臣药。黄精味甘性平，能补脾气、益脾阴、益肾精；枸杞子味甘性平，能滋补肝肾，益精血；桑椹味甘酸性寒，能滋阴补血，生津润燥，三药均具滋肾阴之效，在补阳之中配伍补阴药，意在“阴中求阳”，协助君药补肾暖脾之效及滋补肝肾而强筋骨、温腰府，缓解腰膝酸软等证；芡实味甘涩性平，能益肾固精，且可健脾，能协助君药温肾止遗；肉苁蓉味甘咸性温，能补肾阳；益精血；润肠道，为极润之品，可助君药补肾而温润不伤津液之功；以上五药共为佐药。甘草益气补中，调和药性，为使药。全方重在调理肾、脾、肝三脏腑，诸药合用共奏暖肾祛寒、温脾养肝、缩尿止遗之功。现代研究表明，三方益子膏中盐益智、金樱子、桑葚、枸杞子主要活性成分为原儿茶酸，黄精主要活性成分为5-羟甲基糠醛，肉苁蓉主要活性成分为松果菊苷，补骨脂主要活性成分为补骨脂素和异补骨脂素，甘草主要活性成分为甘草酸，可作为评价该制剂质量的重要依据。目前，国内还没有公开三方益子膏同时测定六种活性成分含量的方法，因此必需建立一种快速、准确、全面分离、检测三方益子膏中活性成分的方法，以便更好地对该产品进行质量监控和用药安全。
3.本发明建立了同时测定三方益子膏盐益智、金樱子、桑葚、枸杞子主要活性成分原儿茶酸、肉苁蓉主要活性成分松果菊苷、补骨脂主要活性成分补骨脂素和异补骨脂素及甘草主要活性成分甘草酸含量的检测方法，实验结果表明，本法建立的hplc转换波长同时测定制剂中六个不同指标成分的含量测定方法，简单快速、准确可靠，重复性及稳定性均较好，可作为该制剂的质量控制方法。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种同时测定三方益子膏中六种活性成分5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素及甘草酸含量的方法，该方法简单、稳定、重现性好，可用于该制剂的质量控制。
5.本发明的目的是这样实现的：利用高效液相色谱方法，同时测定制剂中三方益子膏盐益智、金樱子、桑葚、枸杞子主要活性成分原儿茶酸、肉苁蓉主要活性成分松果菊苷、补骨脂主要活性成分补骨脂素和异补骨脂素及甘草主要活性成分甘草酸含量，具体步骤如下：
6.(1)混合对照品溶液的制备：精密称取5-羟甲基糠醛对照品、原儿茶酸对照品、松果菊苷对照品、补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品和甘草酸对照品适量，置于20ml 容量瓶中，加入甲醇稀释定容，摇匀后制得每1ml分别含5-羟甲基糠醛0.263mg、原儿茶酸0.017mg、松果菊苷0.098mg、补骨脂素0.038mg、异补骨脂素0.049mg、甘草酸0.078mg的混合对照品溶液。
7.(2)供试品溶液制备：精密量取3g三方益子膏，置于具塞锥形瓶中，精密加入 50.0ml甲醇，精密称重；超声(功率200w，频率40khz)处理30min后，放冷至室温，再次精密称重，补足减失的重量并摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
8.(3)色谱条件及样品检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱：agilent 5 tc-c18(4.6
×
250mm)色谱柱；检测波长：0-15min时260nm，15-30min时330nm，30-60min时252nm；流动相：0.1％磷酸水溶液(a)-乙腈(b)；梯度洗脱为0-5min时5％b，5-12min时5％b
→
7％b，12-26min 时7％b
→
15％b，26～35min时15％b
→
50％b，35-45min时50％b，45-60min时50％b
ꢀ→
85％b；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl，即可。
9.本发明具有以下优点和积极效果：
10.1、本发明所述方法简单、准确、重现性和稳定性好，可为全面评价和控制三方益子膏质量提供理论基础和科学依据。
11.2、本发明方法采用高效液相色谱法，利用梯度洗脱方式，实现了同时测定三方益子膏中6种有效成分的含量，本发明建立的色谱法能够较好的分离、测定三方益子膏中5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素及甘草酸有效成分含量，色谱峰峰形好，分离度较高，在此色谱条件下5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素及甘草酸的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，各种成分平均加样回收率为101.75％、97.54％、101.90％、97.82％、96.56％、99.11％，rsd 分别为1.2％、2.4％、1.9％、1.6％、1.0％、1.8％。
12.3、本发明方法操作简单、精密度、重现性和稳定性良好，为三方益子膏有效成分质量控制和药效评价的进一步研究奠定了理论基础和科学依据。
附图说明
13.图1是本发明三方益子膏含量测定专属性试验hplc图谱
14.附图标记说明：1：5-羟甲基糠醛；2：原儿茶酸；3：松果菊苷；4：补骨脂素；5：异补骨脂素；6：甘草酸
15.s1：样品
16.s2.空白
17.s3：5-羟甲基糠醛阴性对照图
18.s4：原儿茶酸阴性对照图
19.s5：缺补骨脂阴性对照图
20.s6：缺肉苁蓉阴性对照图
21.s7：缺甘草阴性对照图
22.s8：混合对照品
具体实施方式
23.以下结合附图和具体实施方式对本发明作以进一步的阐述，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不以此限制本发明。
24.1 仪器与材料
25.1.1 仪器
26.超纯水仪一体机direct-q5uv(广西南宁市博美生物科技有限公司)；kq-500e 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；sqp十万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)； ar204e千分之一电子天平(奥豪斯仪器(常州)有限公司)。
27.1.2 材料
28.甲醇(批号：2020102902，成都市科隆化学品有限公司)；磷酸(批号：2019060 6，成都金山化学试剂有限公司)；原儿茶酸(批号：110809-201906，含量：99.99％，中国食品药品检定研究院)；松果菊苷(批号：110749-201919，含量：99.63％，中国食品药品检定研究院)；补骨脂素(批号：111525-201912，含量：99.99％，中国食品药品检定研究院)；异补骨脂素(批号：110736-201943，含量：99.95％，中国食品药品检定研究院)；甘草酸(批号：rp190517，含量：99.34％，成都麦德生科技有限公司)；5-羟甲基糠醛(批号：110629-201919，含量：99.96％，中国食品药品检定研究院)；s1～s10号样品(批号：20210301，20210302，20210303，20210304，20210305， 20210306，20210307，20210308，20210309，202103010)。
29.2 hplc同时测定三方益子膏中六种成分含量
30.2.1 色谱条件
31.采用agilent 5tc-c18(2)(4.6
×
250mm)色谱柱；流动相为乙腈(b)-0.1％磷酸水溶液(a)，梯度洗脱(0-5min，5％b；5-12min，7％b；12-26，15％b；26-35min，40％b； 35-45min，50％b；45-60，85％b；)；切换波长检测：(0-15min，260nm；15-30min， 330nm；30-60min，252nm；)；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量为10μl。
32.2.2 供试品溶液的制备
33.称取三方益子膏(批号：20201002)3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声30min(功率200w，频率40khz)，放冷到室温，再次称重，用甲醇补足减失的重量，即为供试品溶液。
34.2.3 对照品溶液的制备
35.精密称取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸适量，加甲醇溶解，配置成浓度分别为0.263mg/ml、0.017mg/ml、0.098mg/ml、 0.038mg/ml、0.049mg/ml和0.078mg/ml的混合对照品溶液。
36.2.4 阴性对照溶液的制备
37.2.4.1 缺盐益智、黄精、枸杞子、桑葚、酒苁蓉、炙甘草阴性对照液的制备
38.按处方比例称取盐补骨脂、乌药、金樱子、酒覆盆子、芡实5味药材，按制备工艺，同步制成膏滋。称取其膏滋适量，按“2.2”项下方法制备，既得。
39.2.4.2 缺盐益智、金樱子、桑葚、枸杞子阴性对照液的制备
40.按处方比例称取补骨脂、乌药、黄精、覆盆子、肉苁蓉、芡实、甘草7味药材，按制备工艺制备成膏滋，再按“2.2”项下方法制备，既得。
41.2.4.3 缺补骨脂阴性对照液的制备
42.按处方比例称取益智仁、乌药、金樱子、覆盆子、黄精、枸杞子、桑葚、肉苁蓉、芡实、甘草10味药材，按制备工艺制备成膏滋，再按“2.2”项下方法制备，既得。
43.2.4.4 缺肉苁蓉阴性对照液的制备
44.按处方比例称取益智仁、补骨脂、乌药、金樱子、覆盆子、黄精、枸杞子、桑葚、芡实、甘草10味药材，按制备工艺制备成膏滋，再按“2.2”项下方法制备，既得。
45.2.4.5 缺炙甘草阴性对照液的制备
46.按处方比例称取益智仁、补骨脂、乌药、金樱子、覆盆子、黄精、枸杞子、桑葚、肉苁蓉、芡实10味药材，按制备工艺制备成膏滋，再按“2.2”项下方法制备，既得。
47.2.5 方法学考察
48.2.5.1 专属性考察
49.在色谱条件下，分别取混合对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液进样分析，结果显示5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸中6个成分的色谱峰保留时间与样品中相应的色谱峰保留时间相一致，各个峰分离度、对称性较好，满足测定条件，各阴性样品成分测定无影响，色谱柱理论塔板数以原儿茶酸计不低于10000为准。混合对照品溶液、三方益子膏供试品溶液及其阴性对照溶液的 hplc色谱图见图1。
50.2.5.2 标准曲线的制备
51.取“2.3”项下混合对照品溶液，用自动进样器分别精密取2、4、5、6、8、10μl，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，记录各个指标成分的峰面积，分别以峰面积y为纵坐标，进样量(μg)x为横坐标，求得5-羟甲基糠醛的线性回归方程为y＝2832.16x+43.45 r＝0.99995；原儿茶酸线性回归方程为y＝3129.93x+3.78，r＝0.99997；松果菊苷的线性回归方程为y＝1196.98x+5.68，r＝0.99995；补骨脂素的线性回归方程为 y＝5847.81x+11.45，r＝0.99994；异补骨脂素线性回归方程为y＝5404.57x+18.96， r＝0.99997；甘草酸线性回归方程为y＝804.76x+2.79，r＝0.99997；结果表明5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸分别在0.526μg～2.63μg、 0.034μg～0.17μg、0.196μg～0.98μg、0.076μg～0.38μg、0.098μg～0.49μg、0.156μg～0.78μg 范围内，其峰面积与进样量(μg)呈现良好的线性关系(n＝6)。
52.2.5.3 精密度试验考察
53.取“2.3”项下的混合对照品溶液注入高效液相色谱仪中，按“2.1”色谱条件下测
定，连续进样6次，记录相应的峰面积与保留时间。结果表示分别测得5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸峰面积的rsd分别为0.10％、0.13％、 0.080％、0.080％、0.090％、0.060％，显示仪器精密度良好。
54.2.5.4 重复性试验考察
55.准确称取三方益子膏(批号：20201002)6份，各3g，精密称定，按“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果显示5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸峰的平均含量分别为：2.121mg/g、 0.167mg/g、0.843mg/g、0.295mg/g、0.432mg/g、0.658mg/g，rsd分别为0.50％、1.1％、 0.57％、0.38％、0.48％、0.37％，表明该方法的重复性良好。
56.2.5.5 稳定性试验考察
57.按照“2.2”项下制备三方益子膏(批号：20201002)供试品溶液，按“2.1”色谱条件测定，分别在0h、2h、4h、8h、12h、24h，依次测定，结果表示分别测得5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸含量的rsd分别为1.0％、 0.84％、1.4％、0.77％、0.76％、0.96％，表明供试品溶液24h内稳定。
58.2.5.6 加样回收率试验
59.称取三方益子膏(批号：20201002)1.5g，共6份，分别加入适量的5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸对照品，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，结果显示各个指标成分的平均加样回收率为101.75％、97.54％、101.90％、97.82％、96.56％、99.11％，rsd分别为1.2％、2.4％、 1.9％、1.6％、1.0％、1.8％，表明该方法的加样回收率及准确度良好。
60.表1 5-羟甲基糠醛加样回收试验结果(n＝6)
[0061][0062]
表2 原儿茶酸加样回收试验结果(n＝6)
[0063][0064]
表3 松果菊苷加样回收试验结果(n＝6)
[0065][0066]
表4 补骨脂素加样回收试验结果(n＝6)
[0067][0068][0069]
表5 异补骨脂素加样回收试验结果(n＝6)
[0070][0071]
表6 甘草酸加样回收试验结果(n＝6)
[0072][0073]
2.6 样品含量测定
[0074]
取s1～s10样品各3g，按“2.2”项下方法制备10批供试品，按“2.1”项下色谱条件一同测定，结果如表7。结果表明，10批三方益子膏中5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨
脂素、异补骨脂素、甘草酸6个成分平均含量分别为0.863mg/g、0.187mg/g、 2.323mg/g、0.145mg/g、0.185mg/g、0.631mg/g。按照制剂含量测定范围不得低于80％计算，10批三方益子膏中5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸的含量分别不得低于0.690mg/g、0.149mg/g、1.858mg/g、0.116mg/g、0.147 mg/g和0.504mg/g。
[0075]
表7 10批样品含量测定结果(n＝2)
[0076][0077][0078]
3 讨论
[0079]
通过对三方益子膏中此5味药材进行tlc法系统研究，建立了合理，有效的三方益子膏主要成分的薄层鉴别方法，覆盖君臣佐使。采用hplc法建立了6种成分的含量测定方法，并标定含量限度范围不得低于0.690mg/g、0.149mg/g、1.858mg/g、0.116 mg/g、0.147mg/g和0.504mg/g。本章节所建立的hplc含量测定方法，灵敏度高，准确性好，可作为三方益子膏的含量测定定量分析方法。本研究建立完善的三方益子膏质量标准方法简单、重复性好，准确可靠，为三方益子膏的质量标准修订提供依据，可用作该药的质量控制标准。

技术特征：
1.一种三方益子膏中六种活性成分含量的测定方法，其特征在于：该方法利用高效液相色谱法(hplc)在同一实验条件下同时分离并测定三方益子膏中5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸的含量，具体步骤如下：(1)对照品溶液的制备：精密称取5-羟甲基糠醛对照品、原儿茶酸对照品、松果菊苷对照品、补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品和甘草酸对照品适量，置于20ml容量瓶中，加入甲醇稀释定容，摇匀后制得每1ml分别含5-羟甲基糠醛0.263mg、原儿茶酸0.017mg、松果菊苷0.098mg、补骨脂素0.038mg、异补骨脂素0.049mg、甘草酸0.078mg的混合对照品溶液。(2)精密量取3g三方益子膏，置于具塞锥形瓶中，精密加入50.0ml甲醇，精密称重；超声(功率200w，频率40khz)处理30min后，放冷至室温，再次精密称重，补足减失的重量并摇匀，经0.22μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。(3)分离检测：将混合对照品溶液和供试品溶液分别注入高效液相色谱仪，采用如下色谱条件检测：色谱柱：agilent 5 tc-c18(4.6
×
250mm)色谱柱；检测波长：0-15min时260nm，15-30min时330nm，30-60min时252nm；流动相：0.1％磷酸水溶液(a)-乙腈(b)；梯度洗脱为0-5min时5％b，5-12min时5％b
→
7％b，12-26min时7％b
→
15％b，26～35min时15％b
→
50％b，35-45min时50％b，45-60min时50％b
→
85％b；柱温：35℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl，即可。

技术总结
本发明公开了一种HPLC法同时测定三方益子膏中5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸六种活性成分含量的方法，该方法采用的色谱条件如下：色谱柱：Agilent 5 TC-C18(4.6


技术研发人员：蒋林 农毅清 李芳婵
受保护的技术使用者：广西中医药大学
技术研发日：2021.09.24
技术公布日：2022/3/8